ściąga damian


Enzymy restrykcyjne-są to endonukleazy tnące DNA w specyficznych miejscach, niezależnie od jego pochodzenia. Stały się one 1-szym narzędziem stosowanym do pocięcia całego genomu na charakterystyczne fragmenty DNA (tzw. Fragmenty restrykcyjne).W ten sposób geny lub zespoły genow stają się jednostkami fizycznie możliwymi do wyizolowania , a nie tylko informacja rozsianą w olbrzymiej ciągłości genomu. W warunkach naturalnych enzymy te występują w komórkach bakterii i sinic i pełnia tam rolę systemu obronnego. Ich zadaniem jest niszczenie obcego DNA najcześciej wirusowgo. Własny DNA nie jest niszczony gdyż nie ma w nim specyficznych rozpoznawanych przez restryktazy sekwencji zasad albo Są one zmetylowane i w ten sposób staja się niedostępne dla enzymu. Obecnie znanych jest ok. 3000 enzymów restrykcyjnych natomiast niewiele z nich ma zastosowanie .Zasady nazewnictwa np. Eco R I - 1- sza litera - rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, 2 następne litery-gatunek bakterii, z której wyizolowano enzym, R -szczep, cyfra rzymska-przedstawia klejnosc odkrycia enzymu u tego samego gatunku bakterii. Charakterystyczna cechą enzymów restrykcyjnych jest rozpoznawanie swoistych dla danego enzymu sekwencji zasad w Dna (4-8 pz).Charakterystyczna cechą rozpoznawanych sekwencji jest polindromiczność-co oznacza, że kolejność zasad w jednej nici Dna odczytywana w kierunku 5` 3` jest taka sama jak kolejność zasad w drugiej nici w kierunku 5`3`.Endonukleazy rozpoznawszy sekwencje tną Dna albo w obrębie tej sekwencji albo w pewnej odległości od niej. Ze względu na miejsce cięcia, ale tez ze względu na kofaktory i ilość podjednostek można dokonać podziału enzymów restrykcyjnych na 3 klasy.

Klasa I- najliczniejsza i najbardziej skomplikowana,3 podjednostki, aktywność metylazy. Działanie zależy od kofaktorów ATP, jony magnezu i s-adenozynometionina. Enzymy rozpoznają sekwencję łączą się z nią, ale tną w pewnej odległości -nawet 1000 pz od miejsca rozpoznawanego.

Klasa III-2 typy podjednostek. Wymagają ATP, jonów magnezu ,s-adenozynometionia nie jest niezbędna. Przecinają Dna w pewnej odległości od rozpoznanej sekwencji- ok. 25 nukleotydów.

Klasa II-najprostszy system , 1 typ podjednostki . Aktywowane jonami magnezu,nie maja aktywności metylazy. Przecinają Dna w miejscu rozpoznawanej sekwencji.

Do badań genetycznych wykorzystywana jest tylko klasa II.

Typy cięć-enzymy restrykcyjne mogą przecinać podwójną nić Dna na 2 różne sposoby:

-przecinają obie nici Dna na tej samej wysokości(naprzeciw siebie) tak że powstają zakończenia Dna z tępymi końcami, na których nie ma wolnych niesmarowanych zasad. fragmenty o tępych końcach mogą się połączyć tylko za pomocą enzymu ligazy polinukleotydowej T4.

-przecinają każdą nić Dna nie naprzeciwko siebie, ale cięcia na 2 niciach przesunięte są jedno względem drugiego o kilka zasad. Powstają w ten sposób lepkie końce, na których znajdują się niesmarowane zasady. Końce te mogą tworzyć wiązania wodorowe zgodnie z zasadą komplementarności z lepkimi końcami każdego innego fragmentu Dna powstałego powstałego wyniku działania tej samej endonukleazy.

Zastosowanie-inżynieria genetyczna umożliwiły postęp w mapowaniu genomu,nieodzowne w analizie RFLP, wykrywanie mutacji, ustalanie stopnia pokrewieństwa , ustalanie ojcostwa, kryminalistyka.

Fluorescencyjna hybrydyzacja In situ-FISH

Technika ta wykorzystuje fluorescencyjne metody detekcji sondy . Po hybrydyzacji preparat ocenia się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ze względu na duża rozdzielczość rozdzielczość łatwość użycia FISH wyparł radioaktywną hybrydyzacje in situ.

Wykorzystuje się 3 rodzaje sond:

-centromerowe

-malujące

-unikatowe

Etapy:

-przygotowanie preparatu chromosomowego

-denaturacja DNA chromosomowegopowstają 1-niciowe łańcuchy

- jednocześnie przygotowujemy sondę (denaturacja z wytworzeniem fragmentow jednoniciowych , znakowanie)

-hybrydyzacja In situ -nakrapiamy sondę na preparat chromosomowy

-odstawienie i tworzenie się hybryd

-po hybrydyzacji odpukanie niespecyficznie związanej sondy

-detekcja związanej sondy(metoda bezpośrednia-od razu preparat oglądany pod mikroskopem fluorescencyjnym albo jeśli znacznikiem była biotyna dodać avidynę i fluoresceinę-metoda pośrednia)

Zastosowanie

-wykrywanie aberracji chromosomowych-liczbowych i strukturalnych

-wykrywanie mikrodelecji

-identyfikacja złożonych translokacji

-diagnostyka komórek nowotworowych

OBOJNACTWO RZEKOMO MĘSKIE

Niepełna maskulinizacja narządów płciowych u płci genetycznie męskiej.

  1. Hipoplazja lub brak komórek Leydiga (brak odpowiedzi na hCG i LH)

  2. Wrodzony defekt enzymatyczny biosyntezy testosteronu