alfa-komplementacji system selekcji Polilinkery większości wektorów są Umiejscowione w obrębie genu kodującego enzym β-galaktozydazę. Transformacji podlegają bakterie, które posiadają mutację we fragmencie genomu kodującym tą właśnie część enzymu. Umożliwia to dokonanie na odpowiednio przygotowanej pożywce selekcji bakterii, które pobrały zrekombinowany plazmid, gdyż tylko one zabarwione będą na biało. Te bakterie, u których doszło do komplementacji mutacji enzym jest sprawny i rozkłada dodany do pożywki substrat, co powoduje, że taka kolonia przybiera niebieskie zabarwienie. Arg - Arginina, (skróty:R, Arg) - organiczny związek chemiczny, jeden z 20 aminokwasów kodowanych przez DNA. Obecność grupy guanidynowej w cząsteczce aminokwasu jest przyczyną jego zasadowego charakteru. ATP -proces ligacji- Potrzebny, ponieważ łączenie DNA następuje poprzez wytworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy końcem hydroksylowym 3` a końcem fosforowym 5` w reakcji zależnej od ATP. BAC to sztuczne chromosomy bakteryjne i są koliste podobnie jak naturalne chromosomy bakteryjne. BAC są oparte na plazmidach F naturalnie występujących w E.coli. Wektory BAc używane są do klonowania fragmentów wielkości przynajmniej 300kb. YAC to sztuczne chromosomy drożdżowe i są one liniowe tak jak DNA wchodzące w skład chromosomu eukariotycznego. Uzywane SA jako wektory do klonowania, oraz do tworzenia cDNA. Badania naukowe- współczesna biotech- analityka różno kierunkowa, bioinformatyka, chemia kombinatoryczna, diagnostyka, synteza białek (w tym enzymów), genomika, terapia medyczna, produkcja aparatury i odczynników, mikromacierze, agrobiotechnologia, proteomika, wyciszanie genów, manipulacje komórkami macierzystymi, aparatura i odczynniki wspomagające. Biblioteka genomowa jest zbiorem różnych fragmentów genomowego DNA danego organizmu, wklonowanych do cząsteczek wybranego wektora genetycznego, przygotowane z komplementarnego DNA. 1. Izolacja DNA. zależność od typu biblioteki, którą chcemy uzyskać izolujemy całkowity DNA lub DNA z danego typu organelli, 2. Fragmentacja DNA. DNA poddajemy fragmentacji z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych lub metod fizycznych takich jak np. sonikacja. 3. Ligacja z wektorem. Każdy fragment DNA, który ma być stabilnie utrzymywany w bibliotece, musi zostać połączony z cząsteczką 4. Transformacja. DNA biblioteki należy umieścić w komórkach E.coli lub drożdży, które następnie rozsiewane są na szalki selekcyjne w celu uzyskania pojedynczych klonów, z których każdy zawiera inny fragment genomu. Biblioteka na tym etapie może zostać poddana Biotechnologia - interdyscyplinarna dziedzina nauki (posługująca się wiedzą z biochemii, mikrobiologii i nauk inżynieryjnych), obejmująca różne kierunki techn. wykorzystania materiałów i procesów biol. (w szczególności przebiegających przy udziale drobnoustrojów, kultur tkankowych oraz biokatalizatorów); Biotechnologia biała -Biała- biotech przemysłowa wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska. Opiera się ona na biokatalizie i bioprocesach. Biotech czerwona - biotechnologia wykorzystywana w ochronie zdrowia, w szczególności w zakresie produkcji nowych biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, czy genoterapii i ksenotransplantologii. Cykl lityczny - cykl życiowy bakteriofaga polegający na zakażeniu bakterii, produkcji nowych cząstek fagowych, rozpadzie bakterii i uwolnieniu nowych bakteriofagów. I etapem (adsorpcji) jest przyczepienie się bakteriofaga do ściany komórkowej bakterii. II etap to penetracja - kapsyd pozostaje na zewnątrz, a materiał genetyczny wirusa jest wstrzykiwany do cytoplazmy gospodarza. W przypadku wirusów DNA ich DNA jest przepisywane na RNA, a następnie na jego matrycy powstają białka. III etap to składanie nowych wirusów - kopii wirionu, który zaatakował komórkę. IV etap to uwolnienie - komórka gospodarza ulega rozpadowi (lizie- stąd nazwa cykl lityczny), a kopie wirusa wydostają się na zewnątrz. Cykl lizogenny, cykl lizogeniczny (biogenny)- odmiana replikacji wirusów, polegająca na wnikaniu materiału genetycznego wirusa do komórki gospodarza i jego replikacji wraz z DNA gospodarza, która nie prowadzi do śmierci (lizy) komórki. Pierszym etapem jest wniknięcie materiału genetycznego wirusa do komórki gospodarza. Następnie wirusowy DNA integruje do genomu gospodarza. Wirus w genomie gospodarza nazywany jest prowirusem, w przypadku bakteriofagów mówi się o profagu. Materiał genetyczny wirusa jest namnażany podczas replikacji genomu komórki i przekazywany do komórek potomnych. Cykl życiowy faga M13 - Każdy bakteriofag przechodzi specyficzny cykl reakcji w celu namnożenia się. Najpierw musi rozpoznać bakterie, w której może się namnożyć, i wiąże się z powierzchnią jej komórki. Następnie wstrzykuje swój kwas nukleinowy, który musi być chroniony przed bakteryjnymi nukleazami występującymi w cytoplazmie. Fagowy genom jest następnie replikowany, transkrybowany, poczym musi ulec translacji, w trakcie której produkowane są białka płaszcza i ogona (jeśli jest obecny).Następnie kompletne wiriony są składane i następuje ich uwolnienie z komórki bakterii. Różne fagi używają różnych strategii do wykonania każdej z tych reakcji. Czy organizm żywy można opatentować ? Nie Patenty powinny dotyczyć tylko wynalazków, nie zaś odkryć. Żyjące obecnie organizmy - rośliny, zwierzęta oraz ich geny nie są niczyim wynalazkiem i z tego względu nie powinny podlegać patentowaniu i znajdować się pod prywatną kontrolą. Tak, Patentowanie żywych organizmów do niedawna nie było możliwe, ponieważ uważano je za część natury, a zatem byty nie podlegające patentowaniu. Sytuacja ta uległa jednak zmianie w 1980 roku, gdy w sprawie Diamonda przeciw Chakrabarty'emu Federalny Sąd Najwyższy Stanów Zjednoczonych wydał bezprecedensowy wyrok, mówiący o tym, że można opatentować żywy organizm - bakterię zdolną trawić olej. cDNA (komplementarny DNA, ang. complementary DNA) — DNA uzyskany poprzez odwrotną transkrypcję na matrycy mRNA uzyskanego z komórki. Nazwę tę nosi zarówno pojedyncza cząsteczka, jak i cała biblioteka genowa uzyskana w ten sposób. Ze względu na to, że mRNA pochodzi tylko od aktywnych transkrypcyjnie genów, cDNA reprezentuje w pewnym sensie zestaw informacji genetycznej, wykorzystywanej w komórce, tkance lub narządzie (zależnie od źródła komórek). Cechą charakterystyczną jest brak intronów, co jest wynikiem potranskrypcyjnej obróbki mRNA. DNA do komórki zwierzęcej -1. w postaci fosforanu wapnia do linii komórkowych, 2. metoda z zastosowaniem polikationów (Polibren), jonitowanego dekstranu, 3. metoda elektroporacji, 4. za pomoca liposomów, 5. mikroinekcja, 6. metoda wstrzeliwania. EcoRI enzym pochodzący ze szczepu E.coli RY13 rozpoznaje sześcionukleotydową sekwencję, przecinając obie nici DNA tak, że powstają tzw. "lepkie końce" (ang. sticky ends) w postaci jednoniciowych czteronukleotydowych końców 5'. Efekt pozycyjny- jeden z Etapów regulacji ekspresji genów - transkrypcji Efekt pozycyjny - zależność od regionalnej struktury chromatyny (rejony eu- lub heterochromatyny) Elektroforeza - jest to technika polegająca na rozdziale substancji w polu elektrycznym. Wykorzystuje różnice w szybkości ruchu naładowanych substancji (fazy rozproszonej) względem nieruchomego ośrodka. Enzymu klasy I są najbardziej skomplikowane pod względem budowy. Cecha charakterystyczna jest to, że po rozpoznaniu specyficznej dla siebie sekwencji enzymy te dokonują hydrolizy w pewnej odległości od rozpoznanego miejsca. Może to być nawet 1000 pz. enzymy restrykcyjne wykorzysta. w biotech -uzyskanie fragmentów DNA do klonowania, -badania genetyczne np. (RFLP.AFLP), -identyfikacja hybrydów, hybrydów, -badania pokrewieństwa w kryminalistyce, identyfikacja mutacji. Enzymy restrykcyjne typu II wymagają jako substratu dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej, co najmniej jedną sekwencję rozpoznawaną przez dany enzym, oraz jonów magnezu. DNA zostaje przecięte w obrębie lub w okolicy sekwencji rozpoznawanej Nacięcia w obu niciach mogą leżeć naprzeciwko siebie i wówczas powstają, tzw. "tępe końce" (ang. bunt ends), np. enzym HaeIII z Haemophilus aegypticus rozpoznaje i przecina poniższą sekwencję, w wyniku, czego powstają "tępe końce". Etapy transgenezy- wyizolowanie blastocysty, która powstała ze skrzyżowani dwóch myszy albinosów, - wszczepienie zmienionych genetycznie komórek- powstaje blastocysta chimera, - wszczepienie blastocysty chimery do zastępczej matki - samicy (albinos), - młode są chimerami i po skrzyżowaniu z albinosami u ich potomstwa będą albo same transgeniczne myszy albo nie transgeniczne myszy F + Komórka zwierająca plazmid koniugacyjny (płodna, dawca) F - komórka nie zawierająca plazmidu koniugująca (nie płodna, biorca) FlavrSavr - pomidor, który był pierwszym przypadkiem komercyjnej, zmodyfikowanej genetycznie rośliny uprawnej i jadalnej, dopuszczonej do spożycia przez ludzi.Pomidory FlavrSavr były bardziej odporne na gnicie, poprzez wprowadzenie do nich antysensownego genu, którego produkt interferował i powstrzymywał produkcję enzymu - poligalakturonazy (patrz: Interferencja RNA). Enzym ten jest normalnie odpowiedzialny za rozkład ściany komórkowej (a zatem mięknięcie tkanki), podczas dojrzewania, starzenia i w końcu psucia się owocu Formy RNA barwiące się bromkiem etydryny przy technice nothern blot- pre-mRNA, -mRNA, -częściowo wycięte - pośrednie formy miedzy mRNA a pre-mRNA Genom - suma czynników genetycznych, materiał genetyczny zawarty w podstawowym (haploidalnym) zespole chromosomów. Genotyp - suma lub pewna część informacji określająca zakres możliwości genotypowych organizmów GMO, czyli organizmy zmodyfikowane genetycznie (organizmy transgeniczne) to rośliny, zwierzęta i drobnoustroje, których geny zostały celowo zmienione przez człowieka. Rekombinacja DNA i inne pokrewne techniki pozwalają tworzyć organizmy o odmiennych właściwościach niż macierzy gatunek. Pierwszy "GMO "został stworzony w 1973 przez Stanley Cohena i Herberta Boyer'a Inżynieria genetyczna - to manipulacje obejmujące wprowadzenie do komórek organizmu biorcy ściśle określonego odcinka DNA dawcy z jednym lub paru genami odpowiadającego jednostce transkrypcyjnej celem wywołania trwałych zmian. Klon - to populacja identycznych pod względem genetycznym organizmów komórek, wirusów lub cząsteczek DNA . Populacja taka pochodzi z namnożenia pojedynczej kom, organizmu, wirusa czy cząsteczki DNA. Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację genetyczną jak dawca. Szczególnym przypadkiem jest twinning, czyli powstawanie lub otrzymywanie bliźniąt monozygotycznych, gdzie nie można wyróżnić dawcy. Kod genetyczny -Cechy. trójkowy - do zakodowania 20 różnych aminokwasów przez cztery rodzaje zasad niezbędne jest, aby podstawowe jednostki kodu genetycznego składały się zawsze z trzech zasad. taka trójka zasad w DNA to kodon. Z 64 rodzajów kodonów trzy nie kodują aminokwasów. bezprzecinkowy - między trójkami kodującymi nie ma żadnych dodatkowych elementów uniwersalny - kod genetyczny jest taki sam we wszystkich organizmach zdegenerowany - jeden aminokwas może być kodowany przez kilka różnych trójek niezachodzący - kodony nie zachodzą na siebie jednoznaczny - dana trójka koduje zawsze jeden i ten sam rodzaj aminokwasu. Kontrola ekspresji genetycznej- Ujawnienie się funkcji genu pod wpływem różnych czynników wewnątrz i zewnątrzkomórkowych nazywa się ekspresją genu. Kontrola wytwarzania białek może następować przez: -kontrolowanie, kiedy i jak często dany gen ulega transkrypcji, -kontrolowanie procesów składania i dojrzewania pierwotnego transkryptu RNA, -selekcjonowanie mRNA i decydowanie, który z nich ma ulegać translacji na rybosomach , -wybiórczą aktywację lub inaktywację białek po tym, jak już zostały wytworzone, -Najważniejsza kontrola działania wiekszości genów odbywa się na poziomie transkrypcji Kryteria czystości enzymów-trawienie DNA, -brak 3' 5' specyficznych nukleaz, -brak nukleaz specyficznych dla jednoniciowego DNA, -brak fosfataz, -homogennosć enzymu. Lepkie i tępe końce Lepkie konce: powstają wtedy gdy enzym restrykkcyjny przecina w częsteczce DNA nici w troche inntch miejscach. Np w jednej nici przecine w pewnym miejscu a w drugiej nici miejsce cięcia jest przesunięte kilka zasad w jedną czy w drugą strone. Tępe końce - Nacięcia w obu niciach mogą leżeć naprzeciwko siebie, restryktaza nacina w tych samych miejscach nic DNA. Łysinka fagowa- Jeśli jako wektora użyto fagów lub innych wirusów, w rezultacie tego procesu otrzymuje się populację łysinek fagowych w szalkach z komórkami bakteryjnymi lub łysinek wirusowych w szalkach z komórkami zwierzęcymi. Mapowanie restrykcyjne (wystawienie DNA na działanie restryktazy tnącej nić w miejscach charakterystycznych sekwencji powoduje jego pocięcie na fragmenty, które poddane działaniu pola elektrycznego migrują w nim, im krótsze tym dalej, zatrzymując się tworzą "prążki"; dwie nici DNA pocięte identycznym enzymem restrykcyjnym dadzą tym podobniejszy wzór prążków, im bardziej ich sekwencja jest zgodna). miRNA (mikroRNA) - jednoniciowe cząsteczki RNA o długości ok. 21-23 nukleotydów, regulujące ekspresję innych genów. miRNA kodowane są przez genom komórki, jak normalne geny, i transkrybowane przez RNA polimerazę II, tak samo, jak mRNA. Prekursorem są niewielkie RNA, o strukturze spinki do włosów, które ulegają obróbce podobnie do siRNA. Wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących specyficznie translację mRNA i nadają im specyficzność Miejsce ori - Miejsce na cząsteczce DNA, od którego zaczyna się replikacja. Cząsteczki DNA komórek eukariotycznych zawierają wiele miejsc origin, a prokariotyczne jedno. Mieszanina ligacyjna skład: inserta, wektora, ligazy, ATP, buforu do ligacji fragmenty DNAMetoda South blot- (DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA.Etapy: 1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek. 2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami. 3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ. Po rozdziale na żelu DNA zostaje zdenaturowany pod wpływem NaOH a następnie poddaje się go działaniu roztworu neutralizującego o pH 7,4. 4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem ich charakterystycznego rozmieszczenia. 5.Hybrydyzacja z sondą. a. Prehybrydyzacja, b. Właściwa hybrydyzacja, c. Płukanie filtru. 6. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji. Metoda shot gun dotyczy konstrukcji biblioteki genowej, polega na poddaniu obcego DNA i DNA wektora trawieniu enzymem restrykcyjnym co spowoduje pocięcie na fragmenty które poddaje się ligacji, która prowadzi do transformacji. Metoda replik polega odciśnięciu stempla na płytce "macierzystej" w celu naniesienia na welwet (pokrywający stempel) wszystkie kolonie, jakie się na tej płytce znajdują. Następnie ten stempel odbija się (replikuje) na nowych płytkach, które między sobą różnią się np stężeniem jonów metali ciężkich. Po określonym czasie inkubacji sprawdza się, które kolonie są odporne w tym przypadku na jony metali ciężkich i przy okazji na jak duże stężenia, co odczytujemy dzięki temu, że potomna kolonia na każdej płytce znajduje się w tym samym miejscu. Metoda ta jest także wykorzystywana przy selekcji mikroorganizmów po mutagenezie. Nadprodukcja białek np nadpr biał mleka u zwierząt, nadprodukcji rekombinowanych białek u E.Coli. Northern blot (technika służąca do identyfikacji RNA) potwierdzenie zmiennej ekspresji klonowanych fragmentów cDNA - analiza Northern Blot jest standardową procedurą używaną do otwierdzenia, że prążki cDNA wyizolowane z żelu reprezentują interesujący nas gen. Odkrycie biotechnologiczne ->wbór sekwencji -> wybór „drogi”- sposobu realizacji -> opracowanie receptury -> rozszerzenie procesu na skale doświadczalną ->produkcja próbna-> zapewnienie zgodności z przepisami -> wybór zakładu produkcyjnego -> powiekszenie procesu produkcyjnego na skale przemysłową. Transfer technologi -> produkcja przemysłowa -> produkt. Odwrotna transkryptaza, rewertaza, polimeraza DNA zależna od RNA (EC 2.7.7.49) - enzym syntetyzujący nić DNA na matrycy RNA. Proces ten nosi nazwę odwrotnej transkrypcji (por. transkrypcja - przepisywanie z DNA na RNA). Rewertaza wykazuje także aktywność rybonukleazową. Odkrycie tego enzymu zostało w 1975 nagrodzone nagrodą Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny.Odwrotna transkryptaza występuje u retrowirusów (np. HIV), którym umożliwia przepisanie ich materiału genetycznego z RNA na DNA, które następnie integruje do genomu gospodarza i wraz z nim ulega replikacji. Również niektóre wirusy DNA (hepadnawirusy) wykorzystują odwrotną transkrypcję podczas replikacji. Opiny - rzadko spotykane w przyrodzie, drobnocząsteczkowe związki organiczne. Związki te to pochodne metabolitów powszechnie występujących w komórkach roślinnych. Najczęściej syntetyzowane są one z aminokwasów (głównie argininy, jak na przykład oktopina lub nopalina). Opiny są dla komórek roślinnych zupełnie bezużyteczne. Stanowią natomiast pożywienie bakterii kolonizujących zaatakowaną tkankę. PCR - (ang. polymerase chain reaction) łańcuchowa reakcja polimerazy służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro. Primery (startery) są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów długości), jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji. Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA, która zachodzi w temperaturze ok. 95˚C. Następnie temperatura jest obniżana do ok. 50˚C, co umożliwia połączenie się primerów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu, temp jest podnoszona do ok. 72˚C i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment zawarty pomiędzy dwoma primerami. Ta sekwencja cykli jest powtarzana wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać.( Odmianą jest tzw. in situ PCR, pozwalający przeprowadzić reakcję PCR wewnątrz komórki. Reakcja, która jest prowadzona w termocyklerach, wymaga: termostabilnej polimerazy DNA (np. polimerazy Taq), wolnych trójfosforanów nukleotydów, jonów Mg2+ oraz primerów.) Plazmid F - czynnik płciowy - jest nośnikiem materiału genetycznego u bakterii, koduje około 40-60 białek. Zawiera informację genetyczną związaną z inicjacją i regulacją własnej replikacji, tworzeniem fimbrii płciowych, na których adsorbują się fagi płciowe swoiste dla szczepów męskich. Czynnik F jest episomem, tzn. może występować w postaci autonomicznej, jako koliste DNA lub zintegrowanej z genoforem. Plazmidu Ti budowa- T-DNA (transformujący DNA) - fragment DNA z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens złożony z sekwencji lewa sekwencja zawiera geny niezbędne do formowania tumoru w prawej części tej sekwencji występują geny odpowiedzialne za syntezę opin. Plazmid integruje się z DNA gospodarza ?Tak, Agrobacterium tumefaciens wywołują chorobę nowotworową zainfekowanych roślin przekazując do komórki roślinnej duży plazmid(Ti). Część pzamidu warunkująca choroby ulega integracji z chromosomowym DNA rośliny(T-DNA). Polilinker - jest to niewielki, sztucznie utworzony odcinek DNA, zawierający sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych. Są to na ogół pojedyncze miejsca cięcia w wektorze. Polilinker zazwyczaj wstawiony jest w obrębie drugiego markera inaczej syntetyczny odcinek DNA. Proteasom - jest to wieloenzymatyczny kompleks utworzony z proteaz. Jest odpowiedzialny za degradację enzymów i białek regulatorowych. Zbudowany jest z cylindra 20S i 2 regulatorowych kompleksów 19S znajdujących się na obydwu końcach cylindra. Ramię- Ramię akceptorowe - składa się ono każdego tzw. szypuły, którą stanowi dwuniciowy odcinek kończący się niesmarowana sekwencja CCA ( 5' - 3'). Dowolnego końca 3' - OH przyłączany jest aminokwas, Ramię D - tworzy tak zwaną pętlę DHU ( dihydrouracylową) sekwencja nukleotydowi pętli jest rozpoznawana przez enzym, który przyłącza aminokwas do tRNA. Oznacza to, że ramie D zawiera informację, jaki rodzaj aminokwasu może być przyłączony do danej cząsteczki tRNA, Ramię TγC - tworzy tak zwana pętlę pseudouracylową . Dzięki niej możliwe jest przymocowanie tRNA do rybosomu. Ramię antykodonowe tworzące pętlę antykodonową . Jest to wyróżniona część tRNA która zawiera charakterystyczna trojkę nukleotydowi czyli antykodon. Zadaniem antykodonu jest rozpoznanie kodonu odczytywanej matrycy mRNA. Ramię zmienne - pełni funkcje pomocnicze. Rośliny transgeniczne- produkcja szczepionek. Ziemniaki - zawierające gen pochodzący od bakterii E.coli. W rezultacie tej zmiany ziemniaki gromadziły obce białko. Zostały przeprowadzone testy na ludziach, którym podawano zmodyfikowane, surowe, ziemniaki. Okazało się, że wytworzyli oni przeciwciała w odpowiedzi na podany antygen. Sałata - produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B można się szczepić jedząc sałatę. Rośliny transgeniczne-zastosowanie-Rolnictwo: Odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roślin, środki chwastobójcze. Odporność na choroby powodowane przez grzyby, wirusy, bakterie.Odporność na owady - szkodniki.Odporność na niekorzystne warunki środowiska, Poprawa cech jakościowych oraz użytkowych roślin -Medycyna Szczepionki Różnica HSP70 i HSP60- Białko HSP70 - wiąże się z łańcuchem polipeptydowym zasłaniając miejsca mogące związać się z innymi białkami. Białko HSP60 ma kształt beczułki, mogą się zwijać żeby uzyskać swoją strukturę właściwą. Sekwencja palindromowa w genetyce oznacza taką sekwencję DNA, dla której sekwencja komplementarna jest identyczna (przy założeniu, że obie sekwencje czytamy z uwzględnieniem polarności nici; zgodnie z przyjętym obyczajem - od końca 5' do 3'): miejsce działań restryktaz. Sposoby eucariotycznej nadekspresji białek- splicing (zwykle nie działa dla genów eukariontów wyższych), -proces dojrzewania białka, -kosztowna i trudna hodowla. System binarny roślin transgenicznych- 1. Agrobacterium tumefaciens wywołują chorobę nowotworową zainfekowanych roślin przekazując do komórki roślinnej duży plazmid(Ti). Część plazmidu warunkująca choroby ulega integracji z chromosomowym DNA rośliny(T-DNA). 2. Guzy „crown gall”stanowią duży zbiór niezróżnicowanych komórek, z których wiele zawiera T-DNA. Wiele komórek nie zawiera T-DNA, co implikuje, że T-DNA aktywnie zapobiega różnicowaniu kodując syntezę substancji blokujących różnicowanie i że substancja ta może drogą dyfuzji przenikać do komórek sąsiednich. Taq Polimeraza - Do otrzymywania tego enzymu służą bakterie Thermus aquaticus lub rekombinant innej bakterii, czyli E. coli. Enzym ten w budowie zbliżony i funkcjonalnie podobny do polimerazy DNA I z E.coli. Specyficzna właściwość to; termostabilność w zakresie temperatur od 37°C do 94°C (optimum działania przy 80°C). Jako polimeraza DNA 5'->3' wymagająca do aktywności matrycy ssDNA oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH. (PCR). Taq1 - enzym do aktywacji potrzebuje temp 65°C. T-DNA (transformujący DNA) - fragment DNA z plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens złożony z sekwencji lewa sekwencja zawiera geny niezbędne do formowania tumoru w prawej części tej sekwencji występują geny odpowiedzialne za syntezę opin. Terapia genowa - leczenie polegające na wprowadzeniu obcych kwasów nukleinowych (DNA lub RNA) do komórek. Charakter lub informacja genetyczna zawarte we wprowadzonym DNA lub RNA powinny wywierać efekt terapeutyczny. Metoda in vivo polega na podaniu nośnika kwasu nukleinowego do ustroju pacjenta. Metoda ex vivo polega na wyizolowaniu komórek z organizmu pacjenta, wprowadzeniu do nich terapeutycznego DNA lub RNA (zobacz: transfekcja) i ponownym podaniu ich pacjentowi. Temp potrzebna procesu hydrolizy- Większość 37°C, Enzym Taq I - 65°C. Termocykler - urządzenie używane w laboratorium do przeprowadzania PCR. Urządzenie wyposażone jest w blok grzejny z otworami na próbówki (zwane tutaj peceerówkami), w których przeprowadza się reakcję. Urządzenie zapewnia zmiany temperatury bloku zgodne ze wcześniej zdefiniowanym programem i odpowiednie do efektywnego zajścia PCR. Bloki grzejne, by zmieniały swą temperaturę możliwie szybko, są zazwyczaj wyposażone w moduł Peltiera. Niektóre, bardziej zaawansowane termocyklery (np. do przeprowadzania reakcji , mają naczynia rekacyjne chłodzone i grzane powietrzem. Wektory kosmidowe - stosowane do klonowania dużych fragmentów DNA np. operonów prokariotycznych czy genów eukariotycznych. Budowa : są to zmodyfikowane plazmidy zawierające sekwencję cos faga l konieczną przy pakowaniu DNA do kapsydów fago wych. Najprostsze kosmidy zawierają ori repilkacji , gen markera selekcyjnego , miejsce do klonowania oraz sekwencję cos. Modyfikacje tego typu wektorów polegają na zwiększaniu ilości miejsc do klonowania (polilinkery) , wprowadzaniu element ów umożliwiających analizę klonowanego DNA Wektor retrowirusa- kodowanie - wniknięcie do komórki gospodarza i „rozpakowanie” wirusa, - synteza kopii DNA przez odwrotną transkryptazę, - synteza drugiej nici DNA - utworzenie dwuniciowej cząsteczki DNA, - integracja z chromosomem komórki gospodarza - transkrypcja z udziałem polimerazy RNA gospodarza, prowadząca do utworzenia wielu kopii retrowirusowego RNA, - synteza białek kapsydu, białek okrywy i odwrotnej transkryptazy, składanie nowych wirusów i ich uwolnienie przez pączkowanie. Wirusy są nazywane bezwzględnymi pasożytami Ponieważ nie mogą namnażać się poza ciałem gospodarza, rodzaje kwasów nukleinowych - rybonukleinowy(retrowirusy) i dezoksyrybonukleinowy(wirusy). Wymagania substratowe restryktaz klasy II -jony magnezu, nie potrzeba ATP i SAM. Są to 2 niciowe , koliste cząsteczki DNA, które zawierają: - sekwencje origin replikacji z różnych plazmidów, wirusów lub fagów, -sekwencje markerowi, -sekwencje - miejsce do wklinowywania, - sekwencje silnych promotorów, - inne sekwencje różnego pochodzenia. Wykrywanie 5' końca DNA dam metylaza rozpoznaje sekwencję 5' GATC 3'- pozycja N6 adeniny, dcm metylaza rozpoznaje sekwencję 5' CCAGG CCTGG 3' - pozycja C5 cytozyny.