Daniel Bryjak 12 OSL B

Sprawozdanie

1. Screening drobnoustrojów. Izolacja ze środowiska szczepów drobnoustrojów o znaczeniu przemysłowym.

• Izolacja mikroorganizmów z gleby.

5g gleby wytrząsaliśmy 10 min w 90 ml jałowego płynu fizjologicznego (pf). Jest to rozcieńczenie 10^-1 . Odstawiliśmy na 10 min dla sedymentacji makrocząsteczek. Wykonaliśmy kolejne rozcieńczenia od
do
.

Próbki objętości 50 µl wysialiśmy na płytki z agarem odżywczym (AO) i rozprowadziliśmy głaszczkiem opalonym w alkoholu. Płytki inkubowaliśmy 7 dni w temp. ok. 28^oC.

Zaobserwowano 15 kolonii na ¼ płytki (przy rozcieńczeniu 10^-5), czyli na całej płytce były 60 kolonie.

Liczymy ile bakterii były w 1ml zawiesiny gleby (5g gleby/90 ml pf):

60*10-¹* 10⁴=6*10⁷

1ml zawiesiny gleby=0,1g gleby

1ml zawiesiny gleby-6*10⁷ komórek

0,1g gleby- 6*10⁷ komórek

1g gleby-x

Czyli w 1g gleby było 6*10⁸ komórek.

• Izolacja bakterii przetrwalnikowych.

10 ml zawiesiny gleby ogrzewaliśmy 15 min. w 90^oC. Rozcieńczyliśmy
-
. Próbki o objętości 50 µl wysialiśmy na płytki z agarem odżywczym (AO) i rozprowadziliśmy głaszczkiem opalonym w alkoholu. Płytki inkubowaliśmy 7 dni w temp. 28^oC.

Zaobserwowano 6 kolonii bakterii przetrwalinikujących na ½ płytki, czyli na całej płytce było ich około 12 (przy rozcieńczeniu 10^{-4 )}

12*10-¹*10³=1,2*10⁵

1ml zawiesiny gleby=0,1g gleby

1ml zawiesiny gleby-1,2*10⁵ komórek

0,1g gleby- 1,2*10⁵ komórek

1g gleby-x

X= 1,2*10⁶ -tyle komórek było w 1g gleby.

Określenie właściwości biochemicznych wybranych szczepów.

Wybrane kolonie wysialiśmy rysą na sektory płytek z podłożami różnicującymi (zawierającymi żelatynę) i podłożami wybiórczymi ze skrobią.

Kontrola: zawiera bakterie Bacillus subtilis oraz Staphylococcus aureus (bakteria nierozkładająca skrobi).

Płytki inkubowaliśmy 7dni w temp. ok. 28⁰C.

Poszukiwanie potencjalnych producentów antybiotyków-metoda płytek dwuwarstwowych

Mikroorganizmy na wybranych płytkach zabiliśmy chloroformem (1,5 ml). Przykryliśmy denkiem i zostawiliśmy na ok.20 min. Następnie zalaliśmy 05,% agarem ze szczepem wrażliwym na antybiotyki (Staphylococus aureus 209P)

Płytki inkubowaliśmy.

Wyniki: Powinny powstać strefy zahamowania wzrostu- doświadczenie nie wykryło substancji antybiotycznych. Za pomocą płynu Lugola zaobserwowaliśmy obecność skrobi-są obecne w podłożu wybiórczym, nie ma ich w podłożu różnicującym.

By sprawdzić czy bakterie rozkładają żelatynę dolewaliśmy roztworu siarczanu amonu. Tam gdzie było obecne białko zaobserwowaliśmy zmętnienie dookoła kolonii. Siarczan amonu wytrąca białko.

2. Fermentacja mlekowa

Do 3 kolb wlaliśmy po 150ml surowego mleka, zakryliśmy folią aluminiową i pasteryzowaliśmy przez 15min.w aparacie Kocha. Mleko schłodziliśmy. Do 3 kolb dodaliśmy odpowiednio:

• łyżeczkę jogurtu naturalnego

• 0,5g liofilizowanych bakterii kultury jogurtowej (zawierającej szczepy Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium infantis)

Kolby inkubowaliśmy w temp. pokojowej przez 7 dni.

W trzeciej kolbie zmierzyliśmy pH (za pomocą papierka wskaźnikowego), które wynosiło 6,8. Aby oznaczyć kwasowość mleka do kolby odważyliśmy 50g mleka, dodaliśmy 2ml 2% roztworu fenoloftaleiny i miareczkowaliśmy 0,25M NaOH do słabo różowego zabarwienia, które utrzymywało się przez 30s. W kolbie z jogurtem zużyliśmy podczas miareczkowania po uśrednieniu 25,2ml NaOH , zaś w kolbie z liofilizatem zużyliśmy podczas miareczkowania po uśrednieniu 24,9ml NaOH, w kolbie z samym mlekiem 4ml NaOH.

Uśrednienie:

(24,8+25,6):2=25,2 ml NaOH

(24,6+25,2):2=24,9 ml NaOH

Po inkubacji zauważyliśmy wyraźną zmianę konsystencji, mleko stało się bardziej gęste oraz wyczuwaliśmy zapach kwasu mlekowego. Zmierzyliśmy pH mleka.

• pH mleka przed fermentacja wynosiło: 6,8

• pH mleka po fermentacji zawierającego jogurt wynosiło 3,8.

• pH mleka po fermentacji zawierającego liofilizat wynosiło 4,1

Oznaczyliśmy kwasowość mleka po fermentacji:

Mleko z jogurtem: 25,2*2=50,4 stopni Soxhleta-Henkla K2

Mleko z liofilizatem: 24,9*2= 49,8stopni Soxhleta-Henkla K2

Samo mleko-4ml*2=8 stopni Soxhleta-Henkla K1

Obliczyliśmy również rzeczywistą procentową zawartość kwasu mlekowego

• z jogurtem:

K=(K₂-K₁)* 0,0225

K=50,4*0,0225=1,134

• z liofilizatem

K=49,8*0,0225=1,1205

• w mleku

K=8*0,0225=0,18

3. Fermentacja masłowa.

Do wysokiej probówki wlaliśmy 10 ml mleka, dodaliśmy szczyptę CaCO₃ i szczyptę gleby. Zamknęliśmy korkiem z waty i wstawiliśmy do wrzącej łaźni wodnej na 10 min. Na powierzchnię mleka nawarstwiliśmy jałowy olej parafinowy na grubość 2cm. Inkubowaliśmy w temp. pokojowej przez 7dni.

pH mleka wynosiło 4,7.

Obserwacje:od mleka oddzieliła się serwatka, zapach kwaśnego mleka, utworzył się kwas masłowy.

4. Fermentacja alkoholowa.

Przygotowanie pożywek dla drożdży i założenie hodowli.

• do kolby wlaliśmy 200 ml soku jabłkowego dodaliśmy 0,2g pożywki dla drożdży. Za pomocą refraktometru oznaczyliśmy stężenie cukru, które wynosiło 11,5% (stężenie cukru mniejsze niż 20%) i dodaliśmy 13g cukru (glukozy). Końcowe stężenie wyniosło 18,75%.

• Przygotowaliśmy 150 ml 20% roztworu sacharozy dodaliśmy 0,2g pożywki dla drożdży. Oznaczyliśmy stężenie cukru, które wynosiło 21,4%. (sacharozy)

Obie kolby zamknęliśmy folią aluminiową i pasteryzowaliśmy 20 min. Ochłodziliśmy i dodaliśmy 1g drożdży piekarskich. Kolby (otwarte) zważyliśmy. I Kolba (z sokiem) ważyła 324,5g a II Kolba (z sacharozą) - 316,5g. Obie kolby zamknęliśmy korkami z rurkami fermentacyjnymi wypełnionymi 50% H₂SO₄. Inkubowaliśmy w temp. pokojowej 7-14 dni.

Wyniki po fermentacji:

Kolby po fermentacji zważyliśmy:

- kolba z sokiem-310g

- kolba z sacharozą- 307g

Refraktometrem zmierzyliśmy zawartość cukru w roztworach, po fermentacji:

- kolba z sokiem-8%

-kolba z sacharozą-11,6%

Następnie destylowaliśmy roztwory.

100ml płynu pofermentacyjnego przemieściliśmy do kolby destylacyjne, dodaliśmy 50 ml wody i kawałek porcelany i wykorzystując zestaw do destylacji prostej uzyskaliśmy 50 ml destylatu.

Reakcje:

Obliczamy ilość wydzielonego dwutlenku węgla: 324,5-310=14,5g

C₆H₁₂O₆-> 2C₂H₅OH+ 2CO₂

Zawartość etanolu (w kolbie z sokiem) 20%

Obliczamy wydajność fermentacji w stosunku do wydajności teoretycznej:

Stężenie cukru przed fermentacją wynosiło 18,75%

100ml roztworu-18,75g glukozy

150ml-x

X=28,125g

Stężenie cukru po fermentacji-8%

100ml-8g

150ml-x

X=12g

Obliczamy ilość glukozy, która przereagowała: 28,125-12=13,125g

Obliczamy ilość wyprodukowanego etanolu:

50ml destylatu-10%

100ml-5%

150ml-7,5g etanolu

1 mol glukozy-2mole etanolu

180g-92g

13,125-x

X=6,7g etanolu. Jest to wydajność teoretyczna.

C₁₂H₂₂O₁₁ +H₂O->4 C₂H₅OH + 4CO₂

Zawartość etanolu (w kolbie z sacharozą) 20%

Obliczamy wydajność fermentacji w stosunku do wydajności teoretycznej:

Stężenie cukru przed fermentacją wynosiło 21,4%

100ml roztworu-21,4g glukozy

150ml-x

X=32,1g

Stężenie cukru po fermentacji-10,9%

100ml-10,9g

150ml-x

X=16,35g

Obliczamy ilość glukozy, która przereagowała: 32,1-16,35=15,75g

1mol sacharozy-4 mole etanolu

342g-184g

15,75-x

X=8,5g etanolu- teoretyczna wydajność

5. Otrzymywanie inwertazy (ß-fruktofuranozydazy) z drożdży i badanie jej niektórych właściwości.

1. Ekstrakcja inwertazy z drożdży piekarskich.

5g drożdży piekarskich rozcieraliśmy z 5g piasku przez ok.5min. Dodawaliśmy stopniowo 25ml wody destylowanej. Odstawiliśmy na 20 min. Przesączyliśmy na miękkim sączku bibułowym. Do przesączu w zlewce dodaliśmy 5-krotną objętość zimnego acetonu:

13ml drożdży +5*13ml= 78ml

Mieszaliśmy roztwór do wytrącania się osadu. Przesączaliśmy na miękkim sączku bibułowym. Zebraliśmy osad i rozpuściliśmy w 20ml wody destylowanej. Przesączaliśmy. Przez 7 dni przechowywaliśmy w lodówce.

2. Przygotowanie szeregu wzorcowego do oznaczania cukrów redukujących.

Przygotowaliśmy 25 ml 2 % roztworu glukozy. Rozcieńczyliśmy go tak, aby uzyskać stężenia podane w tabeli.

Przykład liczenia:

100ml - 2g 1ml - 20mg

1ml - x x - 1mg

x=0,02g x=0,05*5=0,25ml glukozy

0,02g*1000=20mg 5ml- 0,25ml=4,75ml wody

	Stężenie glukozy [mg/ml]
		0	1	2	5	10	15	20
Woda [ml]	5	4,75	4,5	3,75	2,5	1,25	0
Glukoza 2% [ml]	0	0,25	0,5	1,25	2,5	3,75	5
Objętość końcowa [ml]	5	5	5	5	5	5	5

Korzystając z uzyskanych roztworów przeprowadziliśmy próbę Benedicta (cukry redukujące w roztworach zasadowych redukują jony metali ciężkich). Do 2ml odczynnika Benedicta dodaliśmy 0,2 ml badanego roztworu. Umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Oziębiliśmy.

	Stężenie glukozy [mg/ml]
		0	1	2	5	10	15	20
Barwa	niebieska	Lekko zielona ,mętna	Bardzo mętny zielony	Zgniła zieleń	brunatny	Pomarańczowy	czerwony
Osad	brak	brak	brak	pomarańczowy	czerwony	czerwony	ceglasty

3. Wyznaczanie optymalnego stężenia inwertazy.

Uzyskany roztwór enzymu rozcieńczamy 10, 25, 50, 100, 500 razy w wodzie destylowanej korzystając z kolb miarowych 10ml i 25ml.

Rozcieńczenie 10 razy - bierzemy 1ml enzymu i uzupełniamy do 10 ml (kolba 10ml)

Rozcieńczenie 25 razy - bierzemy 2,5 ml enzymu i uzupełniamy do 10 ml

Rozcieńczenie 50razy - bierzemy 2ml z rozcieńczenia 10razy i uzupełniamy do 10ml

Rozcieńczenie 100 razy- bierzemy 1ml z rozcieńczenia 10razy i uzupełniamy do 10ml

Rozcieńczenie 500 razy- bierzemy 1ml z rozcieńczenia 50razy i uzupełniamy do 10ml

Przygotowujemy roztwór sacharozy:

1mol --- 342g

0,3 mola --- x

X= 102,6g

Roztwór buforowy:

50ml --- 0,3M

1000ml --- 102,6g

50ml --- x

X= 5,13g sacharozy

Przygowaliśmy 100ml 0,05M buforu octanowego, pH =4,7 zawierającego 0,15 M sacharozy. W tym celu zmieszaliśmy 25 ml kwasu octowego, 25 ml octanu sodu i 50ml roztworu sacharozy. Do 2ml buforu octanowego z sacharozą dodaliśmy 1ml odpowiedniego roztworu inwertazy. Przygotowaliśmy próbę kontrolną, gdzie zamiast enzymu dodaliśmy 1ml wody. Próby inkubowaliśmy 30 min. w temp. pokowej. Po inkubacji, w celu przerwania reakcji, do każdej probówki dodaliśmy 5 kropel 0,25 M NaOH. Przeprowadziliśmy próbę Benedicta.

	woda	500x	100x	50x	25x	10x
Barwa, osad	Przejrzysty niebieski, brak osadu	Bez zmian	Bez zmian	Bez zmian	zielonkawy	Żółtawo-zielony
Stężenie glukozy	0mg/ml	0 mg/ml	Ok. 1 mg/ml	Ok. 2 mg/ml	2-5mg/ml	Ok. 5 mg/ml

4. Aktywność enzymu względem sacharozy i skrobi.

Przygotowaliśmy po 10ml: 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej (zagotowanej), 1% roztwór sacharozy i 0,1M buforu octanowego, pH=4,7 (zmieszaliśmy 1 cz 0,1M roztworu CH₃COOH, 1 cz 0,1M roztworu CH₃COONa). Próby przygotowaliśmy zgodnie z tabelą, korzystając z roztworu enzymu o optymalnym stężeniu.

Próba	Enzym [ml]	Woda [ml]	Bufor pH 4,7 [ml]	Skrobia 1% [ml]	Sacharoza 1% [ml]
1	1	1	1	0	0
2	1	0	1	1	0
3	1	0	1	0	1
4	0	1	1	0	1

Próby inkubowaliśmy 30 min. w temp. pokojowej. Do 0,2 ml z prób 1-4 dodaliśmy 5 kropel NaOH i wykonaliśmy próbę Benedicta.

W probówce nr 3 obserwujemy wytrącenie się zielonego osadu.

Wnioski: Sacharoza jest substratem do zachodzącej reakcji. Inwertaza rozkłada sacharozę do glukozy i fruktozy. Próba Benedicta wykrywa te właśnie cukry i dlatego obserwujemy wytrącenie zielonego osadu.

5. Wpływ pH na aktywność enzymu.

Korzystając z roztworów A (0,04 M kwas octowy, fosforowy i borowy) i B ( 0,2 M NaOH) przygotowaliśmy bufory o pH: 3, 5, 7, 9 w następujący sposób:

pH	Roztwór A [ml]	Roztwór B [ml]	Woda [ml]
3	10	1,85	do 40
5	10	3,6	do 40
7	10	5,3	do 40
9	10	7	do 40

Do 1ml odpowiedniego buforu dodaliśmy 1 ml 0,3 M roztworu sacharozy i 1ml roztworu inwertazy o optymalnym stężeniu. Próby inkubowaliśmy odpowiednio w temperaturze pokojowej. Po 30 min. próby zalkalizowaliśmy i wykonaliśmy próbę Benedicta.

Obserwacje: pH=3 zmętnienie słabe.

pH=5 zmętnienie

Oznacza to, że pH=5 jest najbardziej optymalne dla rozwoju inwertazy.

Wnioski: W pH=5 jest największa ilość cukrów redukujących. Obserwujemy największą aktywność inwertazy, są to optymalne warunki.

6. Hydroliza skrobi. Enzymy amylolityczne

1. Przygotowujemy 150 ml 20% roztworu

1. skrobi ziemniaczanej (uwzględniając jej wilgotność - 20%)

V = 150 ml

Cp = 20%

Cp = (ms / mr) * 100%

ms = (Cp * mr)/100%

ms = 150 ml * 0,2 = 30 ml (skrobi czystej)

30 g --- 80 %

x --- 100%

x = 37,5g (skrobi handlowej)

150g - 37,5g = 112,5g (wody)

2. Przygotowujemy 10 ml 10% roztworu enzymu Termamyl 120L. Gęstość enzymu 1,2g/ml.

V = 100 ml

Cp = 10%

d = 1,2 g/ml

10g --- 100 ml

x ---- 10 ml

x = 1g

1,2g --- 1 ml

1g --- x

x = 0,83 ml

Bierzemy dwie kolbki:

Do pierwszej wlewaliśmy 0,83ml enzymu Termamyl, a do drugiej 0,83ml enzymu Dextrozyme (ad.pkt.8). Następnie uzupełnialiśmy wodą do kreski, tzn. do 10cm³

3. Ustaliliśmy pH roztworu skrobi za pomocą 10% roztworu kwasu cytrynowego.

pH=6,5

4. Dodajemy enzym Termamyl 120L w dawce 0,5% i 1% w przeliczeniu na suchą substancję skrobi.

0,5g---100g roztworu

x---30g

x=30*0,5/100%=0,15g enzymu

1ml--- 1/10 enzymu

x---0,15g

x=1,5 ml enzymu T

5. Przygotowaliśmy szereg 10 probówek z odczynnikiem Benedicta (po 1ml) i płytkę porcelanową z dołkami wypełnionymi 0,2 ml 0,1% jodu w jodku potasu (płyn Lugola).

6. Roztwór umieściliśmy w łaźni wodnej temp. 90 °C. Inkubowaliśmy 1h.

Mieszaliśmy, co kilka minut. Co 3 minuty pobieraliśmy próbkę ok.2ml i alkalizowaliśmy je dodając 4 krople NaOH. Próbkę 0,1 ml użyliśmy do przeprowadzenia próby Benedicta, kilka kropel dodaliśmy natomiast do płynu Lugola na płytkach.

Próba Benedicta

1. - - bez zmian

2. + - brak osadu , barwa zielona

3. + - brak osadu, barwa ciemniejsza zielona

4. + - barwa zielona, osad pomarańczowy

5. ++ - barwa pomarańczowa

6. ++ - barwa jasno brązowa, mały osad

7. ++ - barwa pomarańczowa

8. +++ - barwa ceglasta, czerwona

9. +++ - bez zmian

10. +++ - bez zmian

11. +++ - bez zmian

12. +++ - bez zmian

Płyn Jugola

1. ++ - barwa fioletowa

2. ++ - barwa fioletowa

3. ++ - barwa fioletowa

4. ++ - barwa fioletowa

5. - - bez zmian

6. ++ - barwa fioletowa

7. - - bez zmian

8. - - bez zmian

9. - - bez zmian

10. - - bez zmian

11. - - bez zmian

12. - - bez zmian

Oznaczenia dla prób na płytkach:

++ -barwa fioletowa, - -bez zmian

Oznaczenia dla Próby Benedicta:

- -bez zmian

+- zielona lub żółta

+/- odcienie zielonkawe

++ jasno pomarańczowy

+++ czerwony

Wnioski: Im wyższy numer probówki tym większa jest ilość cukrów redukujących oraz coraz więcej skrobi w doświadczeniu z płynem Lugola.

7. Przygotowaliśmy 100ml 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej do oznaczania DE.

V=100ml

Cp=1%

100ml---1g skrobi

Roztwór zagotowaliśmy.

8. Przygotowaliśmy 10 ml 10% roztworu enzymu Dextrozyme DX 1,5X. Gęstość enzymu 1,2g/ml.

V = 100 ml

Cp = 10%

d = 1,2 g/ml

10g --- 100 ml

x ---- 10 ml

x = 1 g

1,2 g --- 1 ml

1 g --- x

x = 0,83 ml

9. W roztworze skrobi ustaliliśmy pH na 4,7(dodaliśmy kwas cytrynowy). Roztwór zagotowaliśmy i ostudziliśmy.

10. Pozostawiliśmy próbkę ok.15ml do oznaczania DE.

11. Do probówki z kwasem cytrynowym - ) dodaliśmy 1,2 ml enzymu. Otrzymaliśmy dawkę 0,4% w przeliczeniu na suchą substancję skrobi.

12. Roztwór inkubowaliśmy 1h w temp. 60 °C .

7. Oznaczanie zawartości cukrów redukujących.

a. oznaczenie zawartości rzeczywistej suchej substancji.

Syrop skrobiowy, hydrolizat:

Za pomocą refraktometru oznaczyliśmy stężenie- 33Bx, to jest 31,5% suchej substancji po upłynnieniu.

b. oznaczanie zawartości cukrów redukujących.

3g hydrolizatu po upłynnieniu uzupełniamy do 100ml. Równolegle wykonujemy próbę zerową, w której zamiast hydrolizatu znajduje się woda destylowana. W kolbie o pojemności 300ml odmierzaliśmy pipetą 10 ml roztworu A, 10 ml roztworu B, 10 ml roztworu badanego produktu i 20 ml wody destylowanej. Wymieszaliśmy. Zawartość kolby ogrzewaliśmy tak, by ciecz zawrzała i gotowaliśmy przez 2 min. Roztwór ochłodziliśmy. Dodaliśmy 10 ml roztworu jodku potasu, 10 ml kwasu siarkowego i 5-10 ml roztworu tiosiarczanu sodu. Gdy roztwór był jasnożółty dodaliśmy 5 ml skrobi. Miareczkowaliśmy do zaniku barwy niebieskiej.

Ilość zużytego tiosiarczanu sodowego w roztworze z hydrolizatem-26,6ml

Ilość zużytego tiosiarczanu sodowego w roztworze kontrolnym-27,8ml

27,8-26,6=1,2ml

Z tabeli odczytujemy ilość cukrów redukujących wyrażonych jako glukoza-3,82mg

1g-1000mg

x-3,82mg

x=0,00382g

c. obliczanie wyniku oznaczenia:

x= a*b*100/c*d

a-ilość glukozy odczytana w tabeli, g

b- objętość kolby miarowej z rozpuszczoną odważką badanego produktu, ml

c- objętość roztworu badanego zużytego do analizy, ml

d- odważka badanego produktu, g

x=0,00382*100*100/10*3=1,27%

DE-równoważnik glukozowy

DE=x*100/S

s-Zawartość rzeczywistej suchej substancji, %

DE=1,27%*100/31,5%=4,03%

Etap drugi: scukrzanie.

2h inkubacji.

Po 15 minutach sprawdzaliśmy czy roztwór zareaguje z płynem Lugola- obserwujemy czerwoną barwę, natomiast po 30 minutach pojawił się jasnobrązowy kolor-brak reakcji z jodem.

Kolba druga-po scukrzeniu.

DE powinno być większe niż po upłynnieniu.

Za pomocą refraktometru oznaczyliśmy stężenie- 33,5Bx, to jest 33,2% suchej substancji po scukrzeniu. W roztworze znajdowało się więcej cukrów redukujących. Po zagotowaniu pojawił się mocno bordowy kolor.

Ilość zużytego tiosiarczanu sodowego w roztworze kontrolnym-26,4ml

Ilość zużytego tiosiarczanu sodowego w roztworze z hydrolizatem (po scukrzeniu)-9,5ml

26,4-9,5=16,9 ml

Z tabeli odczytujemy ilość cukrów redukujących wyrażonych jako glukoza-69,2mg

1g-1000mg

x-69,2mg

x=0,0692g

Obliczamy wynik oznaczenia:

X=0,0692*100*100/10*3=23,06

DE=23,06*100/33,2%=69,45.

5

---