CHEMIA KLINICZNA - Barwniki żółciowe, porfirie - wykład 5 30.10.2008

Funkcje wątroby

• metaboliczna

• detoksykacyjna

• wydzielnicza/wydalnicza

• magazynująca

funkcje metaboliczne:

• przemiany węglowodanów

• metabolizm białek

• metabolizm tłuszczowców

• przemiana porfirynowa

• powstawanie i wydalanie barwników żółciowych

• regulacja gospodarki wodnej i kwasowo-zasadowej

• regulacja gospodarki hormonalnej

funkcja magazynująca:

• magazynowanie glikogenu, lipidów, białek, żelaza, miedzi, witamin

funkcje detoksykacyjne i wydalnicze:

• przemiana i usuwanie z organizmu substancji zbędnych lub toksycznych

• endogennych:

• deaminacja aminokwasów i synteza mocznika

• wydalanie cholesterolu z żółcią lub jego wykorzystanie do syntezy kwasów żółciowych

• udział w przemianie bilirubiny

• metabolizm hormonów steroidowych

• egzogennych:

• dostających się do organizmu z pożywieniem

• zanieczyszczenia

• środki konserwujące

• produkty bakteryjnego rozkładu substancji organicznych

• składniki roślinne

• w postaci zanieczyszczeń środowiskowych

• leki

Biotransformacja - przemiana substancji niepolarnych

1. Mikrosomalne przemiany związków polarnych (enzymatyczne reakcje oksydo-redukcyjne)

1. istotną cechą mikrosomalnych układów enzymatycznych jest mała swoistość substratowa oraz niepolarny charakter substratów

2. do działania wymagają obecności zarówno czynnika redukującego (NADPH + H⁺) jak i utleniającego (tlen cząsteczkowy)

3. głównymi składnikami tego układu są cytochromy P-450 oraz reduktaza cytochromowa współdziałająca z NADPH

4. są to reakcje hydroksylacji ^{(reakcja dołączenia grupy hydroksylowej -OH do substratu)}

5. w wyniku przemian mikrosomalnych następuje wprowadzenie grup polarnych w cząsteczkę hydrofobowej, litofilnej substancji

6. rzadko zwiększa to rozpuszczalność w wodzie na tyle, aby umożliwić skuteczne wydalanie przez nerki, stwarza jednak w cząsteczce odpowiednie ugrupowania chemiczne, które zostają wykorzystane w następnym etapie przemian.

2. Tworzenie tzw. związków sprzężonych (sprzęganie z kwasem glukuronowym, resztami siarczanowymi lub acetylacja)

Przemiany te polegają na tworzeniu sprzężonych połączeń z bardzo polarnymi metabolitami tkankowymi.

Powstające połączenia są na ogół dobrze rozpuszczalne w wodzie, tracą zdolność rozpuszczania w lipidach, wydalają się z moczem.

Związki aktywne biorące udział w sprzęganiu:

• aktywny kwas glukuronowy - kwas urydynodifosfoglukuronowy (UDPGA)

• aktywny kwas siarkowy - kwas fosfoadenozynofosfosiarkowy (PAPS)

• aktywny kwas octowy - acetylo-CoA - reakcje acetylacji

• aktywna metionina - adenozynometionina - reakcje metylacji

• glicyna, tauryna

Przemiany hemoprotein - wytwarzanie bilirubiny

1. Synteza porfiryn

• porfiryny to związki heterocykliczne utworzone przez połączenie 4 pierścieni pirolowych mostkami metynowymi (-CH=)

• z atomami azotu pierścieni pirolowych wiąże się

jon metalu
↓
Fe →	żelazoporfiryny
	↓
	hem

• hem tworzy z białkami sprzężone połączenia = hemoproteiny

• do hemoprotein należą:

• hemoglobina (90%)

• mioglobina

• cytochromy

• hemoglobina jest zbudowana z 4 łańcuchów peptydowych i zawiera 4 pierścienie hemu z żelazem Fe²⁺

cząsteczka porfiryny	cząsteczka hemu
pierścień pirolowy (porfobilinogen)	hemoglobina

2. Powstawanie i przemiana bilirubiny

• rozpad hemoprotein i katabolizm pierścienia hemowego odbywa się w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego, głównie wątroby, śledziony i szpiku kostnego

• w tych narządach odbywa się wychwytywanie i niszczenie starych krwinek czerwonych

hemoglobina
↓
hem + globina + Fe
↓	utlenienie wiązania α-metynowego (oksygenaza hemowa) z wyłączeniem atomu C (CO)
biliwerdyna
↓	reduktaza biliwerdyny
bilirubina

• z układu siateczkowo-śródbłonkowego bilirubina przechodzi do krwiobiegu

• wolna bilirubina jest nierozpuszczalna w wodzie i jest transportowana w postaci kompleksu z albuminą (bilirubina pośrednia, wolna)

• połączenie to jest na tyle trwałe, że zapobiega przesączaniu przez kłębuszki nerkowe i wolna bilirubina praktycznie nie przechodzi do płynu kanalikowego

• stężenie bilirubiny we krwi jest wypadkową dwóch procesów:

• wytwarzania w układzie siateczkowo-śródbłonkowym

• wychwytywania przez komórki wątrobowe

• bilirubina jest usuwana z krążenia przez wątrobę; proces ten obejmuje 3 niezależne etapy:

1. Wychwytywanie bilirubiny z krwiobiegu

2. Przemianę w komórkach wątrobowych

3. Wydzielanie sprzężonych pochodnych bilirubiny do kanalików żółciowych

Ad.1 Wychwytywanie bilirubiny z krwiobiegu

Kompleks albuminy z bilirubiną dyfunduje swobodnie przez ścianę naczyń włosowatych wątroby (zatoki) i styka się bezpośrednio z błoną komórkową hepatocytów. Następuje wiązanie bilirubiny przez receptor znajdujący się w błonie komórkowej i wykazujący silniejsze od albumin powinowactwo do bilirubiny.

Ad.2 Przemiana w komórkach wątrobowych

W obrębie komórki wątrobowej bilirubina tworzy sprzężone połączenia, głównie z kwasem glukuronowym i siarkowym, z udziałem UDPG-transferazy (bilirubina bezpośrednia, związana).

Diglukuronidy stanowią około 75% sprzężonej bilirubiny,

około 15% stanowią siarczany,

pozostałe 10% - sprzężone połączenia z glicyną i tauryną oraz pochodne metylowe.

Ad.3 Wydzielanie sprzężonych pochodnych bilirubiny do kanalików żółciowych

Sprzężona bilirubina jest wydalana z żółcią do światła jelita, gdzie przez stadium mezobilirubiny i mezobilirubinogenu jest bakteryjnie redukowana do sterkobilinogenu =urobilinogenu.

Większość sterkobilinogenu nie wchłania się zwrotnie z jelita, lecz wydala się z kałem, w którym pod wpływem światła utlenia się do sterkobiliny.

Część jego jest wchłaniana zwrotnie i dostaje się do wątroby (urobilinogen). Nie ulega tu przemianie i ponownie wydala się z żółcią do jelita.

Nieznaczna część przechodzi do krążenia i wydala się przez nerki jako urobilina.

Bilirubina praktycznie nie wydala się z moczem.

Wartości referencyjne

bilirubina całkowita: 0,3 - 1,2 mg/dl (5,1-20,5 μmol/l)

w tym:

• bilirubina wolna (pośrednia): 0,2-0,8 mg/dl (3,4-13,7 μmol/l)

• bilirubina związana (bezpośrednia): 0,1-0,4 mg/dl (1,7-6,8 μmol/l)

u noworodków w pierwszych dniach życia nawet do 12 mg/dl (200 μmol/l)

wydalanie urobilinogenu z moczem: 0-4 mg/dobę

wydalanie sterkobilinogenu z kałem: 30-300 mg/dobę

Zakresy wartości referencyjnych dla stężenia bilirubiny całkowitej u noworodków

U osób dorosłych i dzieci: <1,0 mg/dl

U noworodków:

	urodzonych w terminie	wcześniaków
24 godz. 48 godz. 3-5 dni	2 - 6 mg/dl 6 - 7 mg/dl 4 - 12 mg/dl	1 - 6 mg/dl 6 - 8 mg/dl 10 - 15 mg/dl

Przyczyny hiperbilirubinemii z przewagą bilirubiny wolnej:

• nadmierne wytwarzanie bilirubiny

• upośledzona absorpcja bilirubiny do hepatocytów

• zaburzenia sprzęgania z kwasem glukuronowym

Przyczyny hiperbilirubinemii sprzężonej:

• wrodzone zaburzenia w transporcie glukuronianów bilirubiny

• uszkodzenia komórek wątrobowych

• obturacja dróg żółciowych

Wzrost stężenia bilirubiny w surowicy prowadzi do żółtaczki i może być spowodowany:

• w przypadku wzrostu stężenia bilirubiny wolnej (pośredniej) najczęściej nasileniem procesów hemolitycznych w stopniu przekraczającym zdolność estryfikacyjną wątroby ⇒ żółtaczka hemolityczna

• w przypadku wzrostu stężenia obydwu postaci, a zwłaszcza związanej (bezpośredniej) wewnątrz- lub pozawątrobowym upośledzeniem wydalania bilirubiny do przewodu pokarmowego ⇒ żółtaczka miąższowa i żółtaczka mechaniczna

• Wzrost stężenia bilirubiny wolnej nie powoduje bilirubinurii, wzrasta natomiast wydalanie urobilinogenu z moczem i sterkobilinogenu z kałem

• Wzrost stężenia bilirubiny związanej powyżej 0,5 mg/dl (8,5 μmol/l) występujący w żółtaczkach miąższowych i mechanicznych prowadzi zwykle do wydalania bilirubiny z moczem

Bilialbumina - biliproteina - bilirubina delta

surowica „żółtaczkowa”

⇓

nagromadzenie bilirubiny sprzężonej

⇓

połączenia kowalencyjne (amidowe) z albuminą

⇓

bilialbumina (biliproteina, bilirubina delta)

⇓

odczyn Van den Bergha bezpośredni

⇓

bilirubina bezpośrednia

⇓

długi okres półtrwania (17-20 dni)

Żółtaczka - objaw polegający na zażółceniu powłok skórnych, błon śluzowych, białkówki oczu wskutek nagromadzenia się bilirubiny w surowicy krwi i tkankach organizmu.

Żółtaczka przedwątrobowa

1. hemoliza, nieefektywna erytropoeza

• komórkowa niedokrwistość hemolityczna

• niedokrwistość hemolityczna osoczowa (reakcja po transfuzji krwi, leki)

• żółtaczka noworodków

• choroba hemolityczna noworodków

• większe krwiaki

• pierwotna hiperbilirubinemia typu shunt (rzadkie)

• mioliza, oparzenia

Żółtaczka miąższowa

1. wskutek zaburzeń:

• przechodzenia bilirubiny do komórki

• jej sprzęgania

• wydzielania poza komórkę wątrobową

2. wskutek uszkodzenia miąższu wątroby - wtórne zaburzenia przemiany bilirubiny:

• zapalenie wątroby

• marskość wątroby

• stłuszczenie wątroby

• rak komórek wątrobowych

• przerzuty do wątroby

• zatrucia

• polekowe uszkodzenia wątroby

• alergiczne i toksyczne uszkodzenia wątroby

• posocznica (endotoksyny)

• zapalenie dróg żółciowych

• salmonelloza

• leptospiroza

Żółtaczka pozawątrobowa

1. wskutek zaburzeń odpływu żółci:

• kamica przewodu żółciowego wspólnego

• rak przewodów żółciowych

• rak głowy trzustki

• zarośnięcie dróg żółciowych

• reakcja odrzucania po przeszczepie wątroby

• glistnica

Diagnostyka różnicowa żółtaczek

Parametr	Żółtaczka hemolityczna	Żółtaczka wątrobowa	Żółtaczka mechaniczna
bilirubina w surowicy	umiarkowanie zwiększona	umiarkowanie zwiększona	znacznie zwiększona
próba Van den Bergha	pośrednia	dwufazowa	bezpośrednia
bilirubina w moczu	bez zmian	umiarkowanie zwiększona	znacznie zwiększona
urobilinogen w moczu	umiarkowanie zwiększony	znacznie zwiększony	brak
sterkobilinogen w kale	znacznie zwiększony	umiarkowanie zwiększony	brak
próba tymolowa	ujemna	dodatnia	ujemna
Alb/Glob	bz	znacznie zmniejszony	bz
ALP, GGT	bz	bz	znacznie zwiększone
AST, ALT	bz	znacznie zwiększone	zwiększone
Lpx	bz	bz	zwiększony
Fe	zwiększone	bz	bz
Cu	bz	zwiększone	zwiększone

Hiperbilirubinemia noworodków

• jest stanem fizjologicznym charakteryzującym się miernym zwiększeniem stężenia bilirubiny wolnej w pierwszych 7-10 dniach życia

• zwiększenie to osiąga wartość szczytową w 7 dniu, zmniejszając się do wartości prawidłowych na początku 3 tygodnia życia

• przyczyny:

1. nadmierna hemoliza ⇒ wymiana HbF (płodowej) na HbA₁

2. przyczyna „wątrobowa”

1. niedostateczny wychwyt bilirubiny przez białka receptorowe hepatocytów

2. upośledzona koniugacja bilirubiny przez „niedojrzały” aparat detoksykacyjny ergastoplazmy gładkiej

3. niedostatecznie sprawne wydalanie barwnika na biegunie żółciowym hepatocytów

• fizjologiczna żółtaczka nie wymaga leczenia

Przedłużająca się żółtaczka u noworodków

• może być wynikiem:

• wrodzonych anomalii w drogach żółciowych

• obecności pregnandiolu w mleku matki lub innego steroidowego inhibitora UDPG-transferazy w surowicy noworodka

• przeważnie samo odstawienie karmienia piersią wywołuje szybką normalizację, w przypadkach żółtaczki wywołanej pregnandiolem

• przy obecności innego inhibitora UDPG-transferazy hiperbilirubinemia może przekroczyć stężenie 25 mg/dl, stając się przyczyną wystąpienia objawów żółtaczki jąder podkorowych mózgu (skurcze spastyczne mięśni, niedorozwój umysłowy). Ponieważ zwiększenie stężenia bilirubiny jest tu spowodowane przez bilirubinę niesprzężoną, może ona przenikać przez barierę krew-mózg, gdy jej stężenie w osoczu przekroczy ilość silnie wiązaną przez albuminę (20-25 mg/dl). Następstwem toksycznego działania bilirubiny jest kernicterus (żółtaczka jąder podkorowych mózgu).

• leczenie polega na podawaniu induktorów enzymów mikrosomalnych (fenobarbital) oraz na naświetlaniu skóry lampą kwarcową.

Pierwotne zaburzenia przemiany bilirubiny - hiperbilirubinemie czynnościowe

choroba Gilberta - choroba Meulengrachta (często) zespół Criglera-Najjara

zespół Dubina-Jonsona zespół Rotora

Zespół Gilberta

Żółtaczka przerywana młodzieńcza Meulengrachta

• zaburzenie uwarunkowane genetycznie, dziedziczy się autosomalnie dominująco

• jest to najczęstsza hiperbilirubinemia czynnościowa, rokowanie jest dobre, łagodny charakter

• jest to zaburzenie sprzęgania bilirubiny, przyczyny:

• zmniejszony klirens wątrobowej bilirubiny

• zmniejszona aktywność transferazy UDP-glukuronylowej

• zmniejszona glukuronidacja bilirubiny

• nadmierny rozpad erytrocytów

• nadmierny rozpad prekursorów hemu do bilirubiny

• choroba charakteryzująca się miernym zwiększeniem stężenia bilirubiny wolnej surowicy (najczęściej <6 mg/dl)

• hiperbilirubinemia wykrywana jest często przypadkowo

• nasila się ona znacznie w czasie głodzenia i podczas różnych sytuacji stresowych (np. zakażenia, zatrucie ciążowe)

• chorzy najczęściej nie zgłaszają żadnych dolegliwości

• spośród najczęściej podawanych skarg należy wymienić:

• ogólne zmęczenie i osłabienie

• zaburzenia trawienia

Zespół Criglera-Najjara

Wrodzona niehemolityczna żółtaczka

• genetycznie uwarunkowane zaburzenie przemiany bilirubiny, charakteryzujące się niedoborem transferazy glukuronylowej w wątrobie

• defekt dziedziczony jest genem autosomalnym jako cecha recesywna

• przeważa bilirubina wolna (>6 mg/dl)

• wyróżnia się zespół Criglera-Najjara typu I i II

• Typ I

• całkowity brak enzymu

• stężenie bilirubiny najczęściej >20 mg/dl

• najczęściej kończy się letalnie w dzieciństwie

• bardzo rzadki zespół

• leczenie polega na stosowaniu: fototerapii, plazmaferezy, cholestyraminy

• stosowanie fenobarbitalu nie daje żadnego skutku

• encefalopatia bilirubinowa

• Typ II

• śladowa aktywność enzymatyczna

• bilirubina najczęściej 6-20 mg/dl

• rokowanie lepsze

• objawy najczęściej dopiero w okresie dojrzewania

• fenobarbital obniża stężenie bilirubiny

Zespół Dubin-Johnsona

• genetycznie uwarunkowany defekt przemiany bilirubiny, dziedziczony genem autosomalnym jako cecha recesywna

• istota zaburzenia polega na:

• upośledzonym wydalaniu bilirubiny sprzężonej na biegunie żółciowym hepatocytów oraz

• gromadzeniu się w komórkach wątrobowych, częściowo również w komórkach siateczkowo-śródbłonkowych, złogów barwnika melaninopodobnego

• zespół charakteryzuje się hiperbilirubinemią z przewagą bilirubiny związanej, całkowite stężenie bilirubiny najczęściej dochodzi do 5 mg/dl, niekiedy do 20 mg/dl

• wzrost powodują: stres, alkohol, doustne środki antykoncepcyjne, menstruacja

• klinicznie najczęściej przebiega bezobjawowo

• niekiedy chorzy skarżą się na:

• ogólne osłabienie

• szybkie męczenie się

• zaburzenia żołądkowo-jelitowe

• wątroba może być powiększona i tkliwa na ucisk

• wydalanie z moczem koproporfirynogenu izomeru I > izomeru III

Zespół Rotora

• jest genetycznie uwarunkowanym zaburzeniem przemiany bilirubiny podobnym do zespołu Dubina-Johnsona

• różni się jedynie nieobecnością złogów barwnikowych w hepatocytach

• wydalanie z moczem koproporfirynogenu izomeru III > izomeru I

• przewaga bilirubiny sprzężonej (najczęściej do 5 mg/dl)

Metody oznaczania bilirubiny

Metody oparte na reakcji diazowania bilirubiny (reakcja diazo; reakcja Van den Bergha)

Większość metod oznaczania bilirubiny wykorzystuje reakcję diazo:

bilirubina + odczynnik diazo → barwnik azowy

bilirubina + diazowany kwas sulfanilowy → azobilirubina

Bilirubina zawarta w surowicy reaguje z diazowanym kwasem sulfanilowym tworząc rozpuszczalną w wodzie azobilirubinę, która ma różowe zabarwienie w środowisku kwaśnym.

W reakcji tej możliwe jest rozróżnienie:

• bilirubiny bezpośredniej reagującej bez udziału akceleratora (bilirubina rozpuszczalna w wodzie) i

• bilirubiny pośredniej, która reaguje w jego obecności (nierozpuszczalna w wodzie i utrzymywana w środowisku wodnym wskutek fizykochemicznych połączeń z albuminami)

Suma obu form powstająca w reakcji w obecności akceleratora nazywana jest bilirubiną całkowitą.

Akceleratorami mogą być:

- dimetylosulfotlenek (DMSO),

- benzoesan kofeiny,

- detergent

Intensywność zabarwienia powstającej azobilirubiny jest wprost proporcjonalna do odpowiedniej formy bilirubiny w surowicy. Pomiar fotometryczny przy λ=546 (540 nm).

Modyfikacje metody diazowania bilirubiny

Od czasu wprowadzenia przez Ehrlich (1883) metody diazo do oznaczania bilirubiny, zaproponowano kilka modyfikacji tej reakcji.

Malloy i Evelyn (1937) → metoda Malloya-Evelyna

• metanol jako katalizator reakcji diazowania bilirubiny pośredniej,

• wada tej metody: białko strącone przez metanol fałszywie zaniża wyniki

• odczynnik diazo: diazowany kwas sulfanilowy

• pomiar fotometryczny przy λ=546 nm

Jendrassik i Grof (1938) → metoda Jendrassika-Grofa

- akcelerator: benzoesan kofeiny

- odczynnik diazo: diazowany kwas sulfanilowy

- pomiar fotometryczny przy λ=546 nm

Walters i Gerarde (1970) → metoda Walters-Gerarde'a

• akcelerator: dimetylosulfotlenek (DMSO)

• odczynnik diazo: diazowany kwas sulfanilowy

• pomiar fotometryczny przy λ=555 nm

Metoda DPD (Wahlefeld et al.-1972)

• akcelerator: detergent

• odczynnik diazo: DPD (2,5-dichlorophenyldiazonium tetrafluoroborate)

• pomiar fotometryczny przy λ=546 nm

Zmodyfikowana metoda Van den Bergh & Müller'a

- akceleratory: kofeina i detergent

- odczynnik diazo: 3,5-dichlorophenyldiazonium tetrafluoroborate

- pomiar fotometryczny przy λ=540 nm

Metoda DCA

- akcelerator: detergent

- odczynnik diazo: DCA (2,4-dichloroanilina)

- pomiar fotometryczny przy λ=546 nm

Wielowarstwowa technika pomiaru (Vitros)

Metoda VITROS NBIL DT Slide NBIL - neonatal bilirubin

• metoda oparta jest na klasycznej reakcji diazo

• akcelerator: dyfilina (dyphylline)

• odczynnik diazo: 4-(N-carboxymethylsulfonyl) benzodiazonium hexafluorophosphatate

• reakcja: pomiar absorbancji przy λ=555 nm

Metoda enzymatyczna

Z oksydazą bilirubinową (E.C.1.3.3.5)

bilirubina + ½ O₂ → biliwerdyna + H₂O

oksydaza

bilirubinowa

Utlenianiu bilirubiny do biliwerdyny towarzyszy spadek absorbancji przy 460 nm, który jest proporcjonalny do stężenia bilirubiny w badanej próbce.

Spektrofotometria bezpośrednia

Bilirubina absorbuje światło przy 454 nm dając żółtawe zabarwienie.

Stężenie bilirubiny mierzy się bezpośrednio przez pomiar absorbancji przy 454 nm.

Interferencja HbO₂ z bilirubiną jest korygowana przez pomiar absorbancji przy dwóch długościach fal 454 nm i 540 nm (punkty izobestyczne).

Uwagi

W oznaczeniach bilirubiny w surowicy krwi interferuje hemoliza (podwyższa stężenie), natomiast ekspozycja surowicy na światło słoneczne zmniejsza wyniki na skutek rozkładu bilirubiny.

Stężenie bilirubiny podwyższa wiele leków wykazujących działanie hepatotoksycznne, m.in.:

• erytromycyna

• nitrofurantoina

• fenotiazyna

• fenobutazon

• kwas etakrylowy

W związku z tym przy interpretacji wyników oznaczania bilirubiny konieczne jest uwzględnienie ewentualnego wpływu stosowanego leczenia.

CHOLESTEROL
	prekursor
↓	↓	↓	↓
kortykosteroidy	hormony płciowe	kwasy żółciowe	witamina D

Wydalanie cholesterolu

Cholesterol
↓
żółć
↓	↓
cholesterol	sole kwasów żółciowych

Kwasy żółciowe

• kwasy żółciowe są głównym produktem końcowym przemiany cholesterolu powstałego w wątrobie

• ponad połowa cholesterolu usuwanego z organizmu jest wydalana z kałem w postaci kwasów żółciowych

• ich rola polega na rozpuszczaniu cholesterolu w żółci, a w jelitach - ułatwianiu trawienia i wchłaniania tłuszczów i substancji rozpuszczalnych w tłuszczach, jak niektóre witaminy (A, D, E, K, F).

Synteza kwasów żółciowych

• pierwotne kwasy żółciowe:

• kwas cholowy (trihydroksylowy) - w żółci występuje w największej ilości

• kwas chenodeoksycholowy (dihydroksylowy).

• pierwotne kwasy żółciowe są syntetyzowane w wątrobie z cholesterolu w kilku etapach pośrednich

cholesterol
↓ 7 alfa - hydroksylaza	(enzym mikrosomalny, monooksygenaza, wymaga udziału tlenu, NADPH, cytochromu P-450, witaminy C)

7 alfa - hydroksycholesterol
↓ kwas cholowy	↓ kwas chenodeoksycholowy
sprzęganie z glicyną lub tauryną
↓ kwas glikocholowy	↓ kwas glikochenodeoksycholowy
kwas taurocholowy	kwas taurochenodeoksycholowy

Stosunek związków z glicyną do związków z tauryną wynosi 3:1.

• Ponieważ żółć zawiera znaczne ilości jonów sodowych i potasowych, a jej pH jest zasadowe, przyjmuje się, że kwasy żółciowe i ich połączenia występują w postaci soli, dlatego określane są jako sole kwasów żółciowych.

• Pewna część pierwotnych kwasów żółciowych może podlegać dalszym przemianom w jelicie, dzięki aktywności bakterii jelitowych (enzymy bakteryjne).

• Te przemiany obejmują:

• odszczepienie przyłączonej uprzednio glicyny i tauryny (dekoniugacja),

• odszczepienie grupy 7 alfa-OH.

• W ten sposób powstają wtórne kwasy żółciowe:

↓ kwas dezoksycholowy

↓ kwas litocholowy

Krążenie jelitowo-wątrobowe kwasów żółciowych

• Pierwotne i wtórne kwasy żółciowe są wchłaniane w jelicie krętym.

• W krążeniu wrotnym wraca do wątroby około 98 - 99% kwasów żółciowych wydzielonych do światła jelita => krążenie jelitowo - wątrobowe.

• Kwas litocholowy ze względu na jego nierozpuszczalność, wchłania się w niewielkich ilościach.

• Niewielka część soli kwasów żółciowych nie ulega zwrotnemu wchłanianiu i jest eliminowana z kałem.

• Jakkolwiek jest to niewielka ilość, to jest to główna droga eliminacji cholesterolu.

• Krążenie jelitowo - wątrobowe jest tak wydajne, że każdego dnia stosunkowo mała pula kwasów żółciowych (ok. 3-5 g) cyklicznie przechodzi przez jelito 6 - 10 razy z niewielką ich utratą z kałem, wynoszącą nie więcej niż 1-2% ilości, która przeszła przez krążenie jelitowo - wątrobowe.

• Jednak każdego dnia taka sama ilość kwasów żółciowych, jaka została utracona z kałem jest syntetyzowana w wątrobie z cholesterolu, tak że wielkości puli kwasów żółciowych jest stała, nad czym czuwa układ kontrolny oparty na sprzężeniu zwrotnym.

• Synteza kwasów żółciowych jest regulowana na etapie 7 alfa-hydroksylazy, a synteza cholesterolu na etapie reduktazy HMG-CoA.

• Kwasy żółciowe wywierają zwrotny wpływ hamujący na aktywność 7 alfa - hydroksylazy.

Stężenie kwasów żółciowych w surowicy krwi

• Niewielka część kwasów żółciowych, mimo bardzo skutecznego wychwytu wątrobowego z krążenia wrotnego, przedostaje się do krążenia ogólnego.

• Stężenie kwasów żółciowych w surowicy wynosi na czczo 1 - 9 μmol/l.

• W związku z przyspieszeniem krążenia jelitowo - wątrobowego kwasów żółciowych po każdym posiłku, zwiększa się także ich stężenie w surowicy, osiągając szczyt po 2 - 4 godz. od przyjęcia posiłku (1 - 12 μmol/l).

• Stężenie całkowite kwasów żółciowych we krwi zmienia się w niektórych chorobach wątroby, np. jest szczególnie duże w stanach żółtaczki mechanicznej, wtedy drażnią one skórę i powodują świąd.

Metody oznaczania kwasów żółciowych

Metoda enzymatyczna

3alfa-HSDH

3alfa-hydroksy-kwasy żółciowe + NAD⁺ → 3 alfa-keto-kwasy żółciowe + NADH + H⁺

diaforaza

NADH + H⁺ + NBT → NAD⁺ + formazan

3alfa-hydroksy-kwasy żółciowe zostają utlenione do 3alfa-keto-kwasów żółciowych pod wpływem dehydrogenazy 3alfa-hydroksysteroidowej przy udziale NAD⁺ .

W reakcji katalizowanej przez diaforazę, NADH reaguje z błękitem nitrotetrazoliowym (NBT) do formazanu, który charakteryzuje się trwałym niebieskim zabarwieniem o maksimum absorbancji przy 540 nm.

Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do stężenia kwasów żółciowych w badanej próbce.

Metoda enzymatyczna (kinetyczna)

3-alfa HSDH

3-alfa-hydroksy-kwasy żółciowe + Tio-NAD ^→_← 3-oxo-kwasy żółciowe + Tio-NADH

3-alfa HSDH

W obecności Tio-NAD, 3-alfa HSDH przekształca kwasy żółciowe w 3-keto steroidy i Tio-NADH.

Reakcja jest odwracalna, 3-alfa HSDH może przekształcać 3-keto steroidy w kwasy żółciowe.

Przy nadmiarze NADH, krążenie enzymu jest bardzo sprawne i szybkość tworzenia Tio-NADH jest oznaczana przez pomiar specyficznej zmiany absorbancji przy 405 nm.

Metoda spektrofotometryczna

Kwasy żółciowe mogą być oznaczane przez pomiar absorbancji w zakresie długości fali

290-310 nm lub 370-390 nm, po reakcji przeprowadzonej z kwasem siarkowym, w temp. 70^oC, przez 30 minut.

Inne metody

• chromatografia gazowa

• wysokosprawna chromatografia cieczowa

• wysokosprawna chromatografia cieczowa ze spektrometrią masową

Porfirie. Metody laboratoryjne w diagnostyce porfirii

Porfirie wrodzone - ogólna charakterystyka

• Porfirie to grupa chorób, które polegają na genetycznie uwarunkowanych niedoborach enzymów toru biosyntezy hemu.

Prowadzi to do:

1. upośledzenia powstawania hemu

2. akumulacji toksycznych substratów poszczególnych enzymów w komórkach wątroby i szpiku

• ze względu na umiejscowienie zaburzeń rozróżnia się porfirie:

• wątrobowe i

• erytropoetyczne

• obie grupy zawierają w sobie wiele innych odmian

Porfiria (główne miejsce ekspozycji choroby)	Synteza hemu	enzym
	Glicyna + Bursztynylo-CoA
	↓	← syntaza ALA
	Kwas δ-aminolewulinowy (ALA)
porfiria z niedoboru dehydratazy ALA (wątroba)	↓	← dehydrataza ALA
	Porfobilinogen (PBG)
ostra przerywana porfiria (wątroba)	↓	← deaminaza PBG
	Hydroksymetylobilian
wrodzona porfiria erytropoetyczna (szpik kostny)	↓	← kosyntaza uroporfirynogenu III
	Uroporfirynogen III
porfiria skórna późna (typy I, II, III; wątroba) porfiria wątrobowo-erytropoetyczna (wątroba i szpik kostny)	↓	← dekarboksylaza uroporfirynogenu
	Koproporfirynogen III
dziedziczna koproporfiria (wątroba)	↓	← oksydaza koproporfirynogenu
	Protoporfirynogen IX
porfiria mieszana (wątroba)	↓	← oksydaza protoporfirynogenu
	Protoporfiryna
protoporfiria erytropoetyczna (szpik kostny)	↓	← ferrochelataza
	Hem

Odmiany porfirii wrodzonej

1. Porfirie erytropoetyczne:

• wrodzona porfiria erytropoetyczna (niedobór kosyntazy uroporfirynogenu III)

• protoporfiria erytropoetyczna (niedobór ferrochelatazy)

• porfiria wątrobowo-erytropoetyczna (niedobór dekarboksylazy uroporfirynogenu)

2. Ostre porfirie wątrobowe:

• typ 1: niedobór dehydratazy ALA

• typ 2: niedobór deaminazy PBG - porfiria ostra przerywana

• typ 3: niedobór oksydazy koproporfirynogenu - dziedziczna koproporfiria

• typ 4: niedobór oksydazy protoporfirynogenu - porfiria mieszana

3. Przewlekłe porfirie wątrobowe

• porfiria skórna późna (typy I, II, III) (niedobór dekarboksylazy uroporfirynogenu)

Porfirie erytropoetyczne:

• są trzecią co do częstości występowania,

• ujawniają się w wieku dziecięcym,

• złoża porfiryny w skórze działają jako światłouczulacz, co przy ekspozycji na światło prowadzi do jej uszkodzenia (fotodermatozy),

• w przebiegu choroby rozwija się niedokrwistość hemolityczna.

Metody laboratoryjne w diagnostyce porfirii:

Metody jakościowe do diagnostyki wstępnej:

1. Jakościowa próba Hoescha:

Polega na wykryciu porfobilinogenu w moczu z użyciem odczynnika Ehrlicha (dimetyloaminobenzaldehyd); wynik dodatni, gdy roztwór barwi się od razu na czerwono; próba dodatnia świadczy o napadzie ostrej porfirii wątrobowej.

Materiał badany: dobowa zbiórka moczu, chronić przed światłem.

2. Porfiryny (całkowite) w moczu i kale:

Jakościowo można wykazać przy użyciu alkoholu amylowego i lodowatego kwasu octowego; próba jest dodatnia, gdy roztwór wykazuje żywoczerwoną fluorescencję w świetle lampy Wooda.

Metody ilościowe do diagnostyki podstawowej:

1. Oznaczanie w moczu kwasu δ-aminolewulinowego (ALA),

• fotometrycznie po rozdzieleniu za pomocą wymieniacza jonowego,

• HPLC

2. Oznaczanie w moczu porfobilinogenu (PBG),

• fotometrycznie po rozdzieleniu za pomocą wymieniacza jonowego,

• HPLC

3. Oznaczanie w moczu całkowitych porfiryn,

• fotometrycznie po rozdzieleniu za pomocą wymieniacza jonowego

4. Różnicowanie rodzaju porfiryn w moczu (uroporfiryna, hepta-, heksa-, pentakarboksyporfiryny, porfiryny, izomery I i III),

• HPLC,

• HPTLC po ekstrakcji.

Materiał badany: dobowa zbiórka moczu, chronić przed światłem.

Badania specjalistyczne:

1. oznaczanie aktywności enzymów,

2. oznaczanie porfiryn w stolcu,

3. oznaczanie porfiryn w erytrocytach (krew pełna heparynizowana lub krew-EDTA),

4. oznaczanie porfiryn w osoczu (materiał jak wyżej) - metodami chromatograficznymi:

- HPLC,

- HPTLC po ekstrakcji.

Diagnostyka laboratoryjna porfirii:

W przypadku podejrzenia porfirii:

1. ostrych wątrobowych (ostra przerywana porfiria, porfiria mieszana, koproporfiria dziedziczna) wykonuje się następujące badania:

• w okresie występowania objawów klinicznych:

• kwas δ-aminolewulinowy, porfobilinogen i porfiryny w moczu

oraz

• celem zróżnicowania typu porfirii dodatkowo porfiryny w kale i widmo fluorescencji porfiryn w osoczu.

• po ustąpieniu objawów klinicznych:

• aktywność odpowiedniego enzymu biosyntezy hemu celem ostatecznego potwierdzenia typu ostrej porfirii.

2. porfirii erytropoetycznych wykonuje się następujące badania:

1. wrodzona porfiria erytropoetyczna:

• porfiryny we krwi i w moczu,

2. erytropoetyczna protoporfiria:

• porfiryny we krwi i w kale,

• widmo fluorescencji porfiryn w osoczu,

• aktywność ferrochelatazy w leukocytach.

3. porfirii skórnej późnej wykonuje się następujące badania:

1. postać rodzinna:

• porfiryny w moczu,

• widmo fluorescencji porfiryn w osoczu,

• aktywność dekarboksylazy uroporfirynogenu w erytrocytach,

2. postać nabyta:

• porfiryny w moczu,

• widmo fluorescencji porfiryn w osoczu.

1

---