wymagania7 bmp

^    Z.y IZł fŁa. [\-,j (£_tx4-ner~ U,^

\ my kilką kolejnych rozcieńczeń: 0,4 %, 0,21 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05%, 0,025% i dla każdego z nich wykonujemy następujące czynności: do probówki pobieramy 1 cm³ roztworu, dodajemy 1,4 cm³ buforu octanowego o pH = 5,1 i 0,1 cm³, roztworu enzymu o c = = 10 pg/l cm³. Następnie mieszaninę reakcyjną poddajemy inkubacji przez 10 min w temp. 37°C (wskazane jest, aby wszystkie roztwory pobierane do reakcji .miały temp. ok. 37°C), po czym reakcję przerywamy przez dodanie 0,5 cm³ roztworu octanu uranylu i wstawiamy probówkę do łaźni z lodem na 15 min. Odwirowujemy zawartość probówki (w roztworze pozostają rozerwane cząsteczki RNA), pobieramy znad osadu 0,1 cm³ roztworu i wlewamy do 3 cm³ H₂0 (lub 0,2 cm³ roztworu do 6 cm³ H₂0), a następnie mierzymy'ekstynkcję (E) dla tego roztworu przy X - 260 nm.

Dla każdej próbki należy przeprowadzić analizę kontrolną: pobieramy do probówki 1 cm³ roztworu RNA o tym samym stężeniu co próbka badana, dodajemy 1,4 cm³ buforu octanowego i roztwór poddajemy inkubacji, następnie dodajemy 0,5 cm³ octanu uranylu w HC10₄ i na koniec 0,1 cm³ roztworu enzymu (w ten sposób reakcja rozkładu RNA nie następuje), wstawiamy do łaźni z lodem na 15 min, odwirowujemy i pobieramy znad osadu 0,1 cm³ roztworu do 3 ml H₂0. Mierzymy E przy X = = 260 nm, obliczamy AE będącą różnicą ekstynkcji próbki badanej (E_b) i ekstynkcji próbki kontrolnej (E^ dla każdego kolejnego stężenia RNA:

Tabela 8.4.3. Wyniki pomiarów, szybkości reakcji enzymatycznej

%RNA •	Bi	Et	AE	1/C	I jAE
0,8	0,453	0,085	0,368	1.25	2.72
0,4	0,427	0,079	0,348	2,5	2,88
0,27	0,385	0,076	0,310	3,7	3,23
0,2	0,303	0,065	0,238	5,0	4,29
0,1	0,176	0,030	0,146	10,0	6,85
0,05	0,144	0,023	0,091	20,0	10,98
0,025	0,076	0,022	0,054	40,0	18,68

Rys. 8.43. Zależność zmian ekstynkcji (X - 260 mm) od stężenia sobstratu dla reakcji enzymatycznego rozpadu RNA—po upływie 10 min

AE = E_b-E_k

Przedstawienie wyników pomiarów

W tabeli 8.4.3 przedstawiono wyniki bezpośrednich odczytów oraz wielkości potrzebne do wykreślenia zależności 1 [AE = /(1/c). Na podstawie uzyskanych wyników sporządzamy wykresy AE = f(c) (rys. 8.4.3) oraz \JAE = /(1/c) (rys. 8.4.4). Stałą Michaelisa wyznaczamy graficznie z rys. 8.4.4, na którym wykreślona prosta jest równoważna równaniu (8.4.14). AE odpowiada bowiem szybkości reakcji (d[S]/dr), natomiast [S] = <\ Z nachylenia prostej wyznaczamy AW^. ale ponieważ 1/K_w równe jest odcinkowi wyznaczonemu przez przecięcie się prostej przez oś l/E, znajdujemy też stalą k_u: fc_M — 0,171 w g/100 g

a więc w takich jednostkach, w jakich wyrażaliśmy stężenie substratu, tj. RNA.

Omówienie wyników

Zachowanie się badanej, reakcji jest typowe dla większości reakcji enzymatycznych, tzn. ich rząd jest bliski zeru.

W 4', : E-k(j?enjlv\^ chemi i    cc^ji

8.5. Reakcje fotochemiczne

2) Dysocjacji cząsteczki na atomy lub rodniki (fotolizą)

Reakcjami fotochemicznymi nazywamy takie reakcje, które zapoczątkowane są przez absorpcję kwantów promieniowania elektromagnetycznego. Z reguły chodzi o takie kwanty energii, które prowadzą do wzbudzeń elektronowych. Może to być wzbudzenie bezpośrednie cząsteczek podlegających reakcji chemicznej, ale mogą być też przypadki reakq'i fotochemicznych, w których wzbudzeniu optycznemu podlegają cząsteczki nie biorące udziału w przemianie. Przekazywanie energii promienistej do cząsteczek reagujących odbywa się wtedy za pośrednictwem związków noszących nazwę fotosensybilizatorów. W tym wypadku wzbudzona optycznie cząsteczka sensybilizatora przekazuje energię cząsteczce reagującej nie na drodze optycznej.

Pierwszym aktem reakcji fotochemicznej jest więc wzbudzane stanu elektronowego cząsteczki substratu w wyniku działania kwantów promieniowania. Efektywne są tylko te kwanty promieniowania, które prowadzą do wzbudzenia cząsteczki reagenta do stanu chemicznie reaktywnego.

Ten tzw. pierwotny proces fotochemiczny polega na tworzeniu różnorakich stanów:

1) Aktywnego chemicznie wzbudzenia elektronowego cząsteczki lub jonu AB+ńv -*■ AB* '

AB-l-Av-> A^x+B*

3) Reakcji przekazywania elektronu (redox) np.

1“ • H₂0+ńv -► I+H+OH-

W zależności od przebiegu krzywych energii poten-galng stanu wzbudzonego, pierwotny efekt fotochemiczny może prowadzić do różnych rezultatów:.

—    osiągany jest stabilny chemicznie stan wzbudzony,

—    następuje przejście bezpromieniste ze stanu stabilnego do niestabilnego i dochodzi do dysocjacji (fotołizy) lub powstania aktywnego chemicznie stanu trypletowego,

—    następuje wzbudzenie do tak wysokich stanów oscylacyjnych, że dochodzi do osłabienia wiązań i łatwiejszego przereagowania

—    osiągany jest wprost niestabilny stan elektronowy, w którym następuje bezpośredni rozpad na rodniki lub atomy.

Ponadto zachodzi jeszcze jedna możliwość pierwotnego efektu fotochemicznego, a mianowicie jonizacja cząsteczek. Przypadek ten spotyka się jednak rąpzej podczas napromieniowania kwantami o bardzo wysokiej energii (np. kwanty 7).

449

28 —Eksperymentalna...