CCF20081011014

r •

Do 3 probówek wirówkowych odmierzyć po 1 cm^J roztworu Taka-diastazy, do pierwszej probówki dodać 4 cm^J 96% alkoholu, do drugiej około 0,7 g (NH^SC^, do trzeciej kilka kropli AgNC>3. Po 15 minutach osady odwirować, zlać supematant, a osady rozpuścić w 3 cm wody. Osobno do 2 zwykłych probówek odmierzyć po 1 cm³ Taka-diastazy, jedną z nich zagotować

i po ostudzeniu do obu dodać po 2 cm^J wody.

•> •>

Przygotować 10 probówek z 2 cm I2 w KI każda oraz 5 probówek z 5 cm roztworu skrobi.

Do pierwszej probówki ze skrobią dodać 1 cm^J białka wytrącanego alkoholem (włączyć sto-

■>

per), do drugiej 1 cm białka wytrącanego (NEETSCfi - 1 min., do trzeciej 1 cm białka wytrą-canego AgN(>3 - 2 min., do czwartej 1 cm białka zagotowanego - 3 min., do piątej 1 cm’ białka nie poddanego wytracaniu - 4 min.

Po dodaniu białka probówki zatykać korkiem i dobrze mieszać. Po 5 min. od początku reakcji pobierać kolejno co 1 minutę z każdej probówki po 1 cnr’ roztworu skrobi i przenosić go do przygotowanych probówek z roztworem h w KI (z pierwszej probówki w 5, 15 min.). Obserwować zanik barwy z jodem.

5. Frakcjonowanie białek metoda elektroforezy bibułowej.

Wstęp:

Białka wykazują określony, wypadków)' ładunek elektryczny. Znak i wielkość tego ładunku zależy od rodzaju i ilości dysocjujących grup w cząsteczce. Cząsteczki obdarzone ładunkiem mogą wędrować w polu elektrycznym. Zjawisko to nosi nazwę elektroforezy. Elektroforeza jest bardzo ważną i powszechnie stosowaną metodą rozdzielania i oczyszczania białek. W elektroforezie bibułowej nośnikiem jest pasek bibuł)’ chromatograficznej zwilżony odpowiednim buforem i zanurzony dwoma końcami w wanienkach wypełnionych buforem i zaopatrzonych w elektrody. Naładowane cząsteczki wędrują wzdłuż bibuły z prędkością zależną od ładunku, masy i kształtu cząsteczki, pH , rodzaju buforu, napięcia i natężenia przepływającego prądu oraz innych czynników'. Budowę aparatu do elektroforezy bibułowej przedstawia schematycznie poniższy rysunek.

bibuła

komora

anoda

katoda

woda

bufor

Odczynniki:

-    białko jaja rozcieńczone 1:3 buforem o pil 3.0 lub 3% roztwór kazeiny w buforze

o pH 3,0    O.d

bufor cytrynianów o-fosforanowy (Mc llvainc'a) 1715 M o pH 3,0

-    0,1% roztwór błękitu bromofenoIow'ego w metanolowym roztworze 1 IgCB

0.5% kwas octowv

*

Wykonanie ćwiczenia:

Z bibuły Whatman 1 wyciąć paski o wymiarach 33 x 4 cm. zaznaczyć linię środkową oraz znaki "+" i i założyć ciężarki na końcach pasków'. Zwilżyć cały pasek buforem o pi I 7,6 i umieścić w aparacie do elektroforezy. Przy pomocy pręcików szklanych delikatnie ułożyć pasek bibuły w prawidłowym położeniu tj. prostopadle do ramy podtrzymującej paski.

5