CCF20081011014 (2)

Do 3 probówek wirówkowych odmierzyć po 1 cm^J roztworu Taka-diastazy, do pierwszej probówki dodać 4 cm^J 96% alkoholu, do drugiej około 0,7 g (NH^SC^, do trzeciej kilka kropli AgNC>3. Po 15 minutach osady odwirować, zlać supematant, a osady rozpuścić w 3 cm'¹ wody. Osobno do 2 zwykłych probówek odmierzyć po 1 cm³ Taka-diastazy, jedną z nich zagotować i po ostudzeniu do obu dodać po 2 cm³ wody.

Przygotować 10 probówek z 2 cm I2 w KI każda oraz 5 probówek z 5 cm roztworu skrobi. Do pierwszej probówki ze skrobią dodać 1 cm³ białka wytrącanego alkoholem (włączyć stoper), do drugiej 1 cm³ białka wytrącanego (NH^SC^ - 1 min., do trzeciej 1 cnT białka wytrącanego AgNC>3 - 2 min., do czwartej 1 cm^J białka zagotowanego - 3 min., do piątej 1 cnT białka nie poddanego wytrącaniu - 4 min.

Po dodaniu białka probówki zatykać korkiem i dobrze mieszać. Po 5 min. od początku reakcji pobierać kolejno co 1 minutę z każdej probówki po 1 cnT roztworu skrobi i przenosić go do przygotowanych probówek z roztworem I2 w KI (z pierwszej probówki w 5, 15 min.). Obserwować zanik barwy z jodem.

5. Frakcjonowanie białek metoda elektroforezy bibułowej.

Wstęp:

Białka wykazują określony, wypadkowy ładunek elektryczny. Znak i wielkość tego ładunku zależy od rodzaju i ilości dysocjujących grup w cząsteczce. Cząsteczki obdarzone ładunkiem mogą wędrować w polu elektrycznym. Zjawisko to nosi nazwę elektroforezy. Elektroforeza jest bardzo ważną i powszechnie stosowaną metodą rozdzielania i oczyszczania białek. W elektroforezie bibułowej nośnikiem jest pasek bibuły chromatograficznej zwilżony odpowiednim buforem i zanurzony dwoma końcami w wanienkach wypełnionych buforem i zaopatrzonych w elektrody. Naładowane cząsteczki wędrują wzdłuż bibuły z prędkością zależną od ładunku, masy i kształtu cząsteczki, pH , rodzaju buforu, napięcia i natężenia przepływającego prądu oraz innych czynników. Budowę aparatu do elektroforezy bibułowej przedstawia schematycznie poniższy rysunek.

komora

bibuła

/

katoda

woda

bufor

Odczynniki:

białko jaja rozcieńczone 1:3 buforem o pH 3.0 lub 3% roztwór kazeiny w buforze o pH 3,0

bufor cytrynianowo-fosforanowy (Mc llvaine'a) 1715 MopH 3,0 -    0,1 % roztwór błękitu bromofenolowego w metanolowym roztworze HgCl₂

0,5% kwas octowy

Wykonanie ćwiczenia:

Z bibuły Whatman 1 wyciąć paski o wymiarach 33 x 4 cm. zaznaczyć linię środkowa oraz znaki "+" i i założyć ciężarki na końcach pasków. Zwilżyć cały pasek buforem o pil 7,6 i umieścić w aparacie do elektroforezy. Przy pomocy pręcików szklanych delikatnie ułożyć pasek bibuły w prawidłowym położeniu tj. prostopadle do ramy podtrzymującej paski.

5