3582334343

małych. W konsekwencji uzyskuje się określoną zależność funkcyjną między wartością logarytmu masy molekularnej rozdzielanych cząsteczek i objętością ich elucji z kolumny (Rys. 1.)

Rys. 1. Zależność logarytmu masy cząsteczkowej od objętości elucji (log Mw=j{V,) podczas badania rozkładu masy cząsteczkowej mieszaniny metodą chromatografii żelowej.

Należy podkreślić w tym miejscu, że separacja cząstek na kolumnie żelowej jest procesem czysto mechanicznym, podobnym do działania sita. W warunkach chromatografii żelowej dąży się do wyeliminowania jakichkolwiek oddziaływań sorpcyjnych, mających kluczowe znaczenie w chromatografii cieczowej i gazowej (oddziaływania dipolowe, różnice polamości, tworzenie wiązań wodorowych) między powierzchnią wypełnienia kolumny i cząsteczkami rozdzielanych substancji. W przeciwnym razie oddziaływania konkurencyjne wobec prostego mechanizmu wykluczania będą prowadzić do pogorszenia selektywności kolumny, a w skrajnych przypadkach do całkowitego zafałszowania wyników - cząstki silniej wiążące się z wypełnieniem będą opuszczać kolumnę później, niezależnie od wielkości.

Kolumnę żelową dobiera się w ten sposób, aby rozkład wielkości porów był dostosowany do rozkładu wartości hydrodynamicznych średnic cząsteczek rozdzielanych substancji, a więc do rozkładu masy cząsteczkowej badanej próbki. Wypełnienia kolumn do chromatografii żelowej przygotowuje się w ten sposób, że rozkład średnic porów mieści się w określonym wąskim zakresie i jest podany w świadectwie jakości kolumny. W praktyce częste jest łączenie kolumn o różnych zakresach rozkładu wielkości porów'. Wskazane jest zachowanie następującej kolejności: dozow nik - kolumna o największych porach - kolumna o pośrednich porach - kolumna o najmniejszych porach - detektor. Alternatywą jest zastosowanie kolumny wypełnionej mieszaniną ziaren o różnych zakresach wielkości porów (tzw. kolumny typu ,jtiix" lub ,jnixed bed"). Stosowanie mieszanych wypełnień jest mniej korzystne ze względu na poszerzenie i rozmycie sygnałów w detektorze, lecz ze względu na niższy koszt kolumny mix bywają jednak często stosowane dla wstępnego oszacowania zakresu mas cząsteczkowych.

Faza stacjonarna w chromatografii żelowej

Rodzaje faz stacjonarnych w chromatografii żelowej (ze względu na oddziaływanie z eluentem):

1) Pęczniejące - (wymagają przygotowania - spęcznienia). Zmiana wartości przepływni (i w konsekwencji ciśnienia w kolumnie) bardzo silnie wpływa na opory przepływu i zmienia warunki wymywania.