Kultury kalusa
Naturze formowanie tkanki kalusowe (przyrannej) to odp. Rośliny na urazy mech., spowodowane infekcją mikroorg lub uszkodzeniami przez zwierzęta roślinożerne. Warunkach In vitro kalus może powstawać z każdego elementu żywej tkanki czy organu wyizolowanego z rośliny macierzystej i umieszczonego na pożywce zaw, odp. Subst. Odż. Oraz regulatory wzrostu i rozwoju, gł auksyny.
Tempo powstawania kalusa
Zal. m.in. od budowy explantatu.
Explantaty zaw tylko kom merystematyczne szybko tworzą kalus
Jeśli w explantacie najdują się gł kom zróżnicowane, ulegają one najpierw odróżnicowaniu i stają się merystematyczne a poźniej w wyniku powtórnego różnicowania siętw kalus (2-4tygodnie)
Kalus może powst. Tylko w miejscu cięcia rośliny jak tez całej pow explantatu.
Kultury kalusa
Po uformowaniu na explantacie, kalus zazwyczaj odcina się i przenosi się na nowe pożywki (pasażowanie) celem dalszego namnożenia kom. a potem stymuluje się regenerację roślin
Injekcja kalusa odbywa się zwykle w ciemności, natomiast regeneracja i namnażanie może zach. Zarówno w ciemności jak i na świetle .
POWSTAJĄCE W ULTURACH IN VITRO KALUSY RÓŻNIĄ SIĘ
Rodzajem i licbą tw go kom
Str.( zwartąlub luźną, jednolitą lub grudkowatą)
Barwą (biała=>żólta=>czerw=>zielon)
Konsystencją (twarde lub miękki, stos. Suche albo wilgotne)
Stabil;nościągen. (zmiany kariotypu dot liczby i budowy chromosomów)- poliploidy haploidy, aneuploidy
Zd. Rozwojowymi (kalus morfogenne-organogenne i embriogenie oraz niemorfogenne- proliferują
Kompetencją kom kalusa nie jest cecha stałą
Różnice te wynikają min z pochodzenie i rodzaju explantatu, skł chem. Pożywki, wieku kalusa oraz war prowadzenia kultury.
HABITUACJA (alergizacja)
To zjawisko stopniowego uniezależnienia siękalusa od egzogennych auksyn lub cytokinin oraz przystosowanie się do wzrostu na pożywce bez lub przy znacznym obniżeniu ich zawartości.
Zjawisko habituacji względem auksyn i cytokinin mogą występować niezależnie lub jednocześnie w tym samym kalusie.
Habituacja może takzę dotyczyć innych substancji odżywczych pożywce.
WYKORZYSTANIE KALUSA
Masowa regeneracja roślin drogą morfogenezy przybyszowej
Wytwarzanie na skalę przemysłową roślinnych prod naturalnych
Uzyskiwanie roślin zmor genetycznie czyli wyselekcjonowanych z uwagi na wybrane srtresow czynniki środowiskowe
Podstawa kultur zawiesin komórek
KULTURY ZAWIESIN KOMÓREK
Zawiesina komórek to populacja poj. Komórek lub niewielkic agregatów komórkowych, intensywnie rosnąca w rytmicznie wytrząsanej pożywce płynnej, char. Się powtarzalnymi war wzrostu.
Do inicjacji kultur zawiesinowych wykorzystuje się:
Luźny i podatny na rozbicie kalus
Drobno pocięte zarodki
Drobno pocięte blaszki liściowe
Kultury zawiesinowe prowadzi sięzwykle w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce rotacyjnej, zarówno w ciemności jak i na świetle o niezbyt dużym natężeniu.
ETAPY KULTURY ZAWIESINOWEJ
Zalożenie kultury - wielkości inokulum ustalaja sięeksperymentalnie, objętość pożywki nie powinna przekraczać ¼ do 1/5 objątości naczynia.
Wytrząsanie - rozbicie tkanek na mniejsze fragmenty i uwolnienie się[pojedynczych komóre:zapewnia jednolite warunki kultury
Filtrowanie - ma na celku usunięcie reszty eksplantatów i zbyt dużych agregatów kom.
Pasażowania zawiesiny - czyli przenoszenie do świeżej pożywki(zwykle co 7 - 21 dni) Pasażowanie powinno sięprzeprowadzaćzawsze w tym samym okresie cyklu życiowego zawiesin komórkowych, zwykle na początku fazy stacjonarnej.
Wyrost liczby komrek + parametr poywalajcz ocenic zachowanie się komórek w zawiesinie. Tempo wzrostu iczby kom w ciągu całego cyklu, od pasażu do pasażu, zminia sięw charakterystyczny sposób, tworząc krzywą wzrostu. Standardowa krzywa wzrostu - kształt sinusoidalny i można w niej wyznaczyć 5 faz:
Spoczynkowa
Wykładnicza
Wzrostu liniowego
Obniżonego wzrostu
Stacjonarna
KULTURY ZAWIESIN KOMÓREK SĄ DOBRY OBIEKTEM ROZMAITYCH BADAN
Metabolizmu komórek
Reakcji na czynniki stresowe (a- i biotyczne)
Mechanizmów różnicowanie siękomórek
Manipulacji genetycznych
W PRAKTYCE WYKORZYSTYWANE SĄ M.IN. DO:
Selekcji wybranych genotypów
Uzyskiwania i namnażania komórek embriogenny i organogennych, a następnie do regeneracji z nich całych roślin
Uzyskiwania dużej liczby transformantów
Do wytwarzania na dużą skalę w bioreaktorach roślinny prod naturalny
W procesach biotransformacji
KULTURZ PROTOPLASTÓW
Prostoplast to kom. roślinna bez ściany kom.
Żywy protoplast po przeniesieniu na odp. Pożywkę odtwarza scianękomórkową i rozpoczyna podziały mitotyczne. Początkowo torzą się małe agregaty komórek (mikrokalusy) a następnie, poprzez morfogenezę rzybyszow dochodzi do regeneracji roślin.
Protoplasty izoluje się z:
Mezofilu liści
Hipokotyli
Liścieni
Zawiesiny kom z fazy wzrostu wykładniczego
IZOLOWANIE PROTOPLASTÓW
Metody enzymatyczne - enzymy rozkładające ścianę komórkową t.j. celulozy, hemicelulozy i pektynazy. Wybrany materiał roślinny inkubuje się w roztworze zawierającym oprócz mieszaniny enzymów także regulatory ciśnienia osmotycznego np. mannitol, sorbitol i sacharozę oraz sole mineralne i witaminy. Izolację protoplastów prowadzi się w temp. 25-28 st.C przez 2-6 godz w ciemności.
Ocena i żywotności i liczebności protoplastów - prawidłowo wyizolowane i żywe protoplasty mająkształt kulisy z wraźnie widocznym ruchem cytoplazmy. Żywotność protoplastów sprawdza siębarwnikami cytoplazmatycznymi barwiącymi tylko żywe lub tylko martw protoplasty
Oczyszczanie protoplastów - usunięcie mieszaniny enzymów oraz resztek nierozłożonych kom i tkanek roślinnych. W tym celu protoplasty filtruje sięprzez sitka o bardzo małej średnicy oczek, a następnie wiruje, np. w roztworze sacharozy. W tym przypadu żywe protoplasty zbierają się na pow płynu a martwe opadają na dno. Po odwirowaniu czyste protoplasty kilkukrotnie przepłukuję się pożywką i dopiero wtedy przenosi się na pożywki odpowiednie dla dalszych etapów.
Kutury protoplastów
Założenie kultury wyizolowanych protoplastów.
Czystąfrakcję protoplastów zawiesza sięw pożywce agarozowej lub w postaci cienkiej warstwy zawiesiny umieszcza sięna powierzchni pożywki agarowej. Protoplastu odtworząsćiany komórkowe i w wyniku podziałów powstaną mikrokalusy. Dalszy etap jest uzależniony od założonego celu ( proliferacja kalusa, morfogeneza przybyszowa, regeneracja roślin).
Wszystkie etapy pracy wmagajązachowania maksymalnej sterylności, dokładności i delikatności - zapewnienie żywotności protoplastów.
KULTURY PROTOPLASTÓW
Prowadzi się celem:
Badań biochemiczno - fizjologicznych
Selekcji
Modyfikacji genetycznej
Fuzjnowania (łączenia z innymi protoplastami)
FUZJONOWANIE PROTOPLASTÓW
Fuzja jest to łączenia się (zlewanie się) protoplastów pochodzących z różnych komórek w kulturach In vitro możliwe jest przeprowadzenie fuzji pomiędzy protoplastami komórek somatycznych pochodzących od tej samej rośliny lub różnych roślin tego samego lub różnych gatunków.
Fuzja In vitro HYBRDYZACJA SOMATYCZNA (krzyżowanie somatyczne) pozwala ominąc naturalne bariery (przed- i pozygotyczne) zapobiegające krzyżowaniu sięrośłin między gatunkami, rodzajami czy rodzinami
Celem jest:
Otrzymanie mieszańców zygotycznych, czyli komórek i zregenerowanych z nich roślin, które powstały w wyniku fuzj protoplastów komórek somatycznych pochodzących od różnych osobników odmiennych gatunków.
Ułatwia także różnorodne modyfikacje genetyczne roślin rozmnażanych wegetatywnie, roślin sterylnych, z naturalnie długi cyklem życiowym czy badanie mechanizmów infekcji wirusowych.
ETAPY FUZJI:
Bezpośredni kontakt błon protoplastów ( neutralizacja ujemnego ładunku pow. Błon)
Czasowa destabilizacji błon (zmiana przepuszczalności, pofałdowania, tw. Się porów)
Wytworzenia połączeń (tzw. Mosty błonowe lub molekularne) między cytoplazmami stykających się protoplastów
Zlanie się cytoplazmy wraz z organellami
Odtworzenie i otoczenie produktu fuzji wspólną błoną komórkową
W WYNIKU FUZJI POWSTAJĄ
Heterokariony - po połączeniu komórek somatycznych pochodzących od różnych osobników (róznych komponentów) powstaje hybryd, mieszaniec jądrowy
Homokariony - efekt połączenia protoplastów tego samego komponenta fuzji
Ostatecznie po fuzji mogą powstać:
Symetryczny mieszanie jądrowy - ma kompletne jądra obu komponentów ( powstaje rzadko)
Asymetryczny mieszaniec jądrowy - powstaje w wyniku eliminacji chromosomów lub ich fragmentów. Asymetria może byćswoista (dot jednego genomu) lub nieswoista (dot. Obu jąder)
Cybrydy - mieszańce cytoplazmatyczne, zawierające jądro tylko jednego osobnika, a cytoplazmę drugiego, lub jądro jednego a cytoplazmę obu.
FUZJA (METODY)
Fuzja chemiczna - stymulatorem procesu jest glikol polietylenowy (PEG) w połączeniu z dużym stężniem jonów Ca i DMSO. Po krótkiej inkubacji w mieszaninie protoplasty przemywa się fosforem zawierającym jony Ca i wprowadza pożywkę, następuje odtworzenie ściany komórkowej oraz kolejne fazy rozwoju komórek.
Fuzja fizyczna (elektrofuzja) - wykorzystuje impulsy elektryczne do łączenia się protoplastów. Mieszaninę protoplastów umieszcza się w naczyniu pomiędzy dwiema elektrodami. W pierwszym etapie, pod wpływem prądu zmiennego protoplasty ustawiają się wzdłóż linii pola elektrycznego, tworząc charakterystyczne sznury a ich błony stykają sicze sobą. W drugim etapie w wyniku krótkotrwałego impulsu prądu stałego następuje elektroporacja błon.