VI. Chromatografia cieczowa.

Tu fazą ruchomą jest ciecz a fazą nieruchomą jest ciało stałe. Obecnie praktycznie stosowana jest głównie chromatografia cieczowa kolumnowa, prowadzona pod wysokim ciśnieniem (HPLC).

2. Faza ruchoma (eluent)

Stanowią ją pojedyncze rozpuszczalniki lub ich dwu-, albo więcej składnikowe mieszaniny. W kolumnie w skład fazy ruchomej oprócz eluentu mogą wchodzić także składniki rozdzielanej mieszaniny. Po rozdzieleniu składniki te są obecne w wycieku z kolumny (eluat).

Skład eluentu może być jednakowy podczas całego rozdzielania chromatograficznego i wtedy chromatografia jest określana jako izokratyczna. Jeśli skład eluentu zmienia się podczas chromatografowania próbki, to nazywa się gradientowa. Zmiana składu eluentu polega na stopniowym zwiększaniu ilości jednego rozpuszczalnika w drugim.

W celu ułatwienia wyboru właściwego rozpuszczalnika jako eluentu chromatograficznego rozpuszczalniki ułożono w szeregi eluotropowe. W przypadku polarnych faz stacjonarnych rozpuszczalniki są ułożone według rosnącej mocy eluowania.

W przypadku stosowania adsorbentów polarnych jako fazy ruchome używane są rozpuszczalniki mające mniejszą od nich polarność. Jest to tzw. normalny układ faz. Jako fazę ruchomą stosuje się tutaj n - heksan i jego mieszaniny z rozpuszczalnikami polarnymi.

Jeżeli adsorbent jest mało polarny lub niepolarny, to stosowana faza ruchoma jest bardziej od niego polarna. Taki układ nazywa się odwróconym układem faz. W tym układzie jako fazę ruchomą stosuje się mieszaniny metanolu i wody lub acetronitrylu i wody.

Najważniejszym czynnikiem charakteryzującym eluent w chromatografii jonowymiennej jest siła jonowa. Jednak na właściwości eluentu wpływają tutaj także: wartość pH oraz obecność modyfikatora organicznego.

3.Dozowniki - do dozowania próbek analizowanych stosuje się zawory dozujące. Zawór dozujący jest zbudowany tak, że w jednym położeniu dźwigni można przepłukać i napełnić wymienną pętlę dozowniczą o określonej objętości ciekłą próbką lub roztworem ciała stałego.

4. Kolumny

Kolumna jest rurką długości od 10cm do 25 cm, zamkniętą z 2 końców filtrami i końcówkami umożliwiającymi połączenia z dozownikiem i detektorem. Wykonuje się je ze stali nierdzewnej. Filtry są zwykle stalowe o średnicy porów 0,5 - 2 um.

Jako wypelnienie stosuje się żel krzemionkowy. Aktywność rozdzielcza żelu krzemionkowego jest związana z obecnością na jego powierzchni grup silanowych. Obecnośc tych grup powoduje, że na powierzchni żelu może adsorbować się woda, dezaktywując tę powierzchnię. Obecnie większe znaczenie niż żel krzemionkowy mają wypelnienia otrzymane przez jego modyfikację. Modyfikacja polega na związaniu z aktywnymi grupami żelu związków organicznych w reakcjach podobnych silanizowaniu nośników.

5. Detektory.

Używa się detektorów optycznych i elektrochemicznych. Zasada ich działania polega na rejestrowaniu różnicy określonej właściwości samego eluentu i roztworu substancji chromatografowanej w tym eluencie.

-detektor spektrofotometryczny UV - działa na zasadzie absorpcji światła nadfioletowego. Obecnie produkowane są detektory, w którym możliwa jest płynna regulacja dł. fali światła w całym zakresie nadfioletu i jego części widzialnej, czyli istnieje możliwość ustawienia tzw. Tabeli czasowej detekcji - różne dł. fali w czasie chromatografowania. Taki detektor po zatrzymaniu przepływu fazy ruchomej umożliwia rejestrację widma absorpcji substancji znajdującej się w detektorze i ustalenie dł. fali, przy której występuje max absorpcji. Detektor ten jest niewrażliwy na zmiany przepływu fazy ruchomej i zmiany temp..

-detektor fluorescencyjny - istota detekcji polega na pomiarze intensywności promieniowania o określonej dł. fali, emitowanego przez wykrywany związek w wyniku pobudzenia. Jest on bardzo czuły.

-detektor refraktometryczny - detekcja odbywa się na zasadzie pomiaru różnicy współczynnika załamania światła eluentu i eluata zawierającego w sobie substancję oznaczaną. Jest to detektor średniej czułości i jest wrażliwy na żmiany ciśnienia i temp.. Musi być starannie termostatowany.

-detektory elektrochemiczne - jest to grupa detektorów, których działanie oparte jest na polarografii, amperometrii, kulometrii lub konduktometrii. Są używane do wykrywania substancji podlegających reakcjom elektrochemicznego utlenienia i redukcji. Faza ruchoma musi przewodzić prąd elektryczny, co osiąga się przez dodawanie odpowiednich soli.

6. Przygotowanie próbek do analizy

-rozpuszczenie próbki w odpowiednim rozpuszczalniku

-usunięcie składników i mechanicznych zanieczyszczeń, które mogłyby niekorzystnie wpływać na działanie kolumny i innych części przyrządu,

-wzbogacenie próbki w określone substancje,

-przekształcenie próbki w postać sprzyjającą rozdzielaniu i dobremu wykryciu jej składników.

Metoda ekstrakcji do fazy stałej - polega na przepuszczeniu ciekłej analizowanej próbki przez złoże adsorbentu w kolumnie i adsorpcję oznaczanych związków w złożu. Zaadsorbowne substancje wymywa się następnie ilościowo niewielką objętością rozpuszczalnika.

W niektórych przypadkach etap przygotowania próbki jest ważniejszy, trudniejszy i może trwać dłużej niż właściwa analiza.

7. Zastosowanie.

Analiza jakościowa polega na identyfikacji pików odpowiadających poszczególnym składnikom próbki. Wykorzystuje się w tym celu wielkości retencyjne.

Pojawienie się pików substancji, których nie ma w analizowanej próbce może być wynikiem nie wymycia wszystkich składników poprzednio chromatografowanej próbki.

---