2906542986

206 A. PRZYKORSKA [9]

ponieważ nie znaleziono niesparowanych zasad w kołowym DNA, który został pozbawiony trzeciorzędowej struktury superheliksu.

W a n g (15) wykazał, że podatność kolistego DNA na przecinanie przez enzymy specyficzne wobec jednoniciowych fragmentów wzrasta wraz ze wzrostem liczby zwojów superheliksu. W pewnym zakresie zależność ta jest prostoliniowa tak, że na podstawie podatności DNA na przecinanie przez nukleazę można określić stopień jego skręcenia w strukturę trzeciorzędową. Na przykład nukleaza z fasoli złocistej około 75 razy szybciej nacina ściśle skręcony w superheliks DNA faga PM2 o gęstości superheli-kalnej równej 0,06, niż ten sam DNA ale nie posiadający struktury trzeciorzędowej.

Nukleaza I z kiełków pszenicy katalizuje hydrolizę dwuniciowego DNA wirusowego i wysokocząsteczkowego, natywnego DNA z Escherichia coli do mniejszych fragmentów, które są oporne na dalsze działanie enzymu (12). Fragmenty te są dwuniciowymi polimerami bez nacięć w pojedynczej nici, co stwierdzono porównując ciężary cząsteczkowe dwuniciowych fragmentów z ich ciężarami cząsteczkowymi po denaturacji. Fragmenty zdena-turowane miały ciężar cząsteczkowy równy połowie ciężaru natywnych polimerów. Znakując radioaktywnym fosforem nukleotydy na 5'-końcach powstających fragmentów autorzy wykazali, że produkowane polimery zakończone są na ogół dezoksyguanozyną i dezoksycytozyną. Wyznaczono również ciężar cząsteczkowy powstających fragmentów, stwierdzając, że są one jednakowej wielkości. Obserwacja ta pozwala na wniosek, że podatne na działanie enzymu miejsca w natywnym DNA rozmieszczone są w równych odstępach. Kroeker i wsp. (12) sugerują, że tak wysoki stopień specyficzności nukleaz typu I wobec określonych struktur w cząsteczce DNA przypomina analogiczne właściwości enzymów restrykcyjnych.

III-3. Działanie na dwuniciowy, liniowy DNA

Dwuniciowe, liniowe cząsteczki są bardzo złym substratem nukleaz specyficznych wobec fragmentów jednoniciowych. W trakcie inkubacji z enzymem dwuniciowego, liniowego DNA obserwuje się jednak zwykle powstawanie pewnej ilości kwaso-rozpuszczalnych nukleotydów. Badając wielkość produktów degradacji natywnego DNA z grasicy cielęcej przez nukleazę z fasoli złocistej Kroeker i wsp. (9) stwierdzili, że mono-i oligonukleotydy pojawiają się od razu bez uprzedniego powstawania produktów o pośredniej długości. Świadczy to o degradacji liniowego DNA ,,od końców”. Autorzy wykazali, że produkty działania nukleaz typu I na liniowe, dwuniciowe DNA są również wynikiem endonukleolitycznego przecinania przez enzymy specyficzne wobec jednoniciowych fragmentów niesparowanych lub częściowo zdenaturowanych końców w natywnym