Biochemia dla Biologii nr ETCS

Kwasy nukleinowe cz.I

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

1

ZADANIE 3

TYTUŁ: KWASY NUKLEINOWE CZ.I

Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ć

wiczeń

Materiały i urządzenia:

• Materiały

1. 0,1% roztwór DNA
2. 0,01 M bufor fosforanowy, pH=7,0
3. H

2

SO

4

4M

4. etanol
5. NaOH 2M
6. HCl 2M
7. CuSO

4

0,25M

8. nasycony NaHSO

3

9. odczynnik Dischego
10. molibdenian amonu
11. reduktor metolowy

• Urządzenia

1. probówki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety
5. łaźnie wodne
6. papierki lakmusowe

INFORMACJE TEORETYCZNE:.

Kwasy nukleinowe z powodu swojej wielkości tworzą w roztworach wodnych układy

koloidowe, a dzięki dużej zawartości reszt kwasu fosforowego mają odczyn kwasowy.
W efekcie tego dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, trudniej w wodzie
i rozcieńczonych kwasach. Silne obniżenie pH roztworu lub dodanie czynników
odwadniających doprowadza do odwracalnego wytrącania kwasów nukleinowych.

Hydrolizę kwasów nukleinowych przeprowadza się w podwyższonej temperaturze

w obecności odpowiednich kwasów, np. kwasu siarkowego, solnego lub nadchlorawego.
W tych warunkach zachodzi rozkład kwasów nukleinowych na podstawowe składniki: zasady
purynowe, zasady pirymidynowe, cukier (pentoza) i kwas fosforowy. W takich warunkach
znacznie łatwiej odszczepiają się zasady purynowe niż pirymidynowe, te ostatnie pozostają
w postaci nukleotydów. Można zastosować wyższą temperaturę, która sprzyja uwolnieniu
zasad pirymidynowych, ale jednocześnie powoduje rozkład zasad purynowych.

W środowisku kwaśnego siarczynu sodu NaHSO

3

kationy miedzi (II) Cu

2+

, ulegają

redukcji do kationów miedzi (I) Cu

+

, które wytrącają żółtobiały osad nierozpuszczalnych soli

miedzi (I) zasad purynowych.

Reakcja Dischego polega na tworzeniu w środowisku kwaśnym przez 2-deoksyrybozę

z difenyloaminą produktu kondensacji o barwie niebieskiej.

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Kwasy nukleinowe cz.I

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

2

Jony ortofosforanowe w środowisku kwaśnym reagują z molibdenianem amonu dając

fosforomolibdenian amonu o zabarwieniu żółtym. Jeżeli sól potraktuje się reduktorem,
np. metolem (siarczan metylo-p-aminofenolu) i siarczynem sodu, to następuje redukcja
molibdenianu związanego w soli kompleksowej do niższych tlenków molibdenu
z wytworzeniem błękitu molibdenowego. Reakcja tworzenia się błękitu molibdenowego
stanowi podstawę ilościowego oznaczania fosforu w materiale biologicznym.

Przebieg doświadczenia:

Podzadanie 1:

rozpuszczalność kwasów nukleinowych w wodzie

a)

Do 1 ml 0,1% roztworu DNA w 0,01M buforze fosforanowym o pH 7 dodać
kroplami 2M HCl. Zapisać obserwację i wyciągnąć odpowiednie wnioski.

b)

Do powstałego osadu dodawać stopniowo 2M NaOH. Zapisać obserwację
i wyciągnąć odpowiednie wnioski.

Podzadanie 2: rozpuszczalność kwasów nukleinowych w alkoholu

Do 1 ml 0,1% roztworu DNA w 0,01M buforze fosforanowym dodać 2 ml zimnego

etanolu. Zapisać obserwację i wyciągnąć odpowiednie wnioski.

Podzadanie 3:

hydroliza kwaśna kwasów nukleinowych

Do probówki odmierzyć 5 ml 0,1% roztworu DNA w 0,01M buforze

fosforanowym

o pH 7. Dodać 5 ml 4M H

2

SO

4

. Probówkę wstawić do łaźni wodnej

o temperaturze 80°C na 45 minut. Wyjąć, oziębić i zachować do podzadania nr 4
i 6.

Podzadanie 4: wytrącanie zasad purynowych

8 ml kwaśnego hydrolizatu 0,1% roztworu DNA z podzadania nr 3 zobojętnić 2M

NaOH do odczynu słabo kwaśnego (sprawdzić za pomocą papierka lakmusowego).
Ogrzać do wrzenia, a następnie dodać kilka kropli 0,25M roztworu CuSO

4

oraz

ostrożnie kroplami nasycony roztwór NaHSO

3

. Zapisać obserwację i wyciągnąć

odpowiednie wnioski.

Podzadanie 5: wykrywanie deoksyrybozy - reakcja Dischego

Do 1 ml 0,1% roztworu DNA w 0,01M buforze fosforanowym o pH 7 dodać 2 ml

odczynnika Dischego. Zamieszać i wstawić do wrzącej łaźni na 10 minut. Zapisać
obserwację i wyciągnąć odpowiednie wnioski.

Podzadanie 6: wykrywanie deoksyrybozy - reakcja dischego

Do probówki wprowadzić 1 ml kwaśnego hydrolizatu 0,1% roztworu DNA

z podzadania nr 3. Dodać 3 ml roztworu molibdenianu amonu i ogrzać do wrzenia.
Zapisać obserwację i wyciągnąć odpowiednie wnioski. Po oziębieniu probówki
dodać 1 ml reduktora metolowego. Zapisać obserwację i wyciągnąć odpowiednie
wnioski.

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Kwasy nukleinowe cz.I

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

3

LITERATURA

1. Biochemia”, L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze

2. „Biochemia Harpera”, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze

3. Cytobiochemia”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002

4. Biochemia- Krótkie Wykłady”, B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002

5. Genomy, Brown., PWN W-wa 2001

6. Genetyka molekularna, Węgleński P, PWN W-wa 1995 i nowsze

7. Ćwiczenia z biochemii”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003

8. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J wyd. ART. 1997

9. Ćwiczenia z biochemii, Logoń A. wyd. ART. 1997