Biochemia dla Biologii nr ETCS

Badanie właściwości białek

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

1

ZADANIE 2

TYTUŁ: BADANIE WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK

Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ć

wiczeń

Materiały i urządzenia:

• Materiały

1. roztwór kazeiny
2. roztwory odpowiednich białek
3. białko jaja kurzego
4. CuSO

4

10%

5. NaOH 0,01M
6. HCl 0,01M
7. chlorek cyny (II)
8. octan ołowiu (II)
9. bufor octanowy, pH=7,4
10. stężony kwas azotowy
11. żelazocyjnek potasu
12. kwas trójchlorooctowy 6%

• Urządzenia

1. probówki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety
5. łaźnie wodne

INFORMACJE TEORETYCZNE:.

Przy pewnej określonej wartości pH cząsteczki białka obdarzone są jednakowa liczba

ładunków elektrycznych dodatnich i ujemnych, czyli są elektrycznie obojętne. Takie pH
roztworu nazywa się punktem izoelektrycznym danego białka. Oznaczanie oparte jest na
najmniejszej rozpuszczalności kazeiny w punkcie izoelektrycznym. Przez dobór
odpowiednich stężeń kwasu octowego i octanu sodu w poszczególnych probówkach, uzyskuje
się roztwory o różnych wartościach pH. Wartość pH w probówce, w której wystąpi
najobfitszy osad odpowiada punktowi izoelektrycznemu kazeiny.

Białka, ze względu na charakter amfoteryczny, mogą reagować zarówno z kationami

jak też anionami tworząc odpowiednie sole. Z kationami metali alkalicznych dają sole dobrze
dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, natomiast z kationami metali ciężkich tworzą sole
nierozpuszczalne. Aniony białkowe tworzą nierozpuszczalne białczany z metalami ciężkimi,
natomiast kationy białkowe dają nierozpuszczalne sole z anionami kwasowymi

Denaturację białka wywołują niektóre czynniki fizyczne takie jak: ogrzewanie,

wysychanie, ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe i wstrząsanie wodnych roztworów
białka w atmosferze powietrza. Denaturacja cieplna prowadzi do koagulacji, której istota jest
rozwiniecie łańcuchów polipeptydowych i zlepienie ich w duże agregaty. Denaturacja białek
nie jest równoznaczna z koagulacja, ponieważ wiele białek zdenaturowanych pozostaje
w roztworze. Spowodowane to jest odpowiednim pH środowiska, różnym od pH
punktuizoelektrycznego. Chemiczne czynniki denaturujące to: kwasy, zasady, jony metali
ciężkich, detergenty, fenol, chloroform, alkohol i aceton.

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Badanie właściwości białek

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

2

Przebieg doświadczenia:

Podzadanie 1:

oznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

Przygotować 9 suchych i czystych probówek, oznaczyć je kolejno numerami. Do

pierwszej odmierzyć 3,2 ml l M roztworu CH

2

COOH i 6,8 ml wody destylowanej, a

do pozostałych ośmiu - po 5 ml wody. Zawartość pierwszej probówki dokładnie
wymieszać, następnie pobrać z niej 5 ml roztworu i przenieść do drugiej probówki.
Z tej, po dokładnym wymieszaniu 5 ml do probówki trzeciej. Czynność te powtarzać
dochodząc kolejno do probówki dziewiątej, z której po zmieszaniu zawartości
odrzucić 5 ml roztworu.. Do każdej probówki wprowadzić l ml roztworu kazeiny
dokładnie wymieszać zawartość. Odstawić i po 20 minutach odczytać wynik. Brak
zmętnienia (-) lub różne stopnie zmętnienia (+, ++, +++) wpisać do tabelki. Podać
punkt izoelektryczny kazeiny.

Nr probówki

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Liczba ml 1 M
CH

3

COOH

1,6

0,8

0,4

0,2

0,1

0,05

0,025

0,012

0,006

pH roztworu

3,5

3,8

4,1

4,4

4,7

5,0

5,3

5,6

5,9

Zmętnienie

Podzadanie 2: strącanie białek kationami metali ciężkich i anionami kwasowymi

Do trzech probówek odmierzyć po 2 ml białka kationowego, anionowego lub

obojnaczego. Do każdej probówki dodać ostrożnie po l kropli 10% CuS04.
Obserwować czy powstaje osad. Unikać nadmiaru odczynnika, gdy_ stracony osad
rozpuszcza się w nim. Wynik zanotować w tabelce oznaczając powstanie osadu (+)
lub brak osadu (-). Doświadczenie powtórzyć z pozostałymi odczynnikami.

Odczynnik

Białko anionowe

Białko obojnacze

Białko kationowe

Siarczan miedzi (II)

Chlorek cyny (II)

Octan ołowiu (II)

Żelazocyjanek potasu

Wyjaśnij:
1. Czy białka w punkcie izoelektrycznym reagują z kationami metali i anionami kwasowymi?
2. Jaka forma białka wytraca się w obecności kationów a jaka w obecności anionów?
3. Czy białko kationowe reaguje z kationami metali?
4. Dlaczego w zatruciach metalami ciężkimi podaje się mleko lub białko jaja?

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Badanie właściwości białek

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

3

Podzadanie 3:

Cieplna denaturacja i koagulacja białka

Do probówek odmierzyć po 2 ml 1% roztworu białka jaja kurzego i dodać kolejno:

do pierwszej probówki 0,2 ml 0,01 M roztworu HC1 (pH 3), do drugiej - 0,2 ml
buforu octanowego o pH 4,7, do trzeciej - 0,2 ml 0,01 M roztworu NaOH (pH 11).
Wszystkie probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Oziębić.
Zapisać wynik obserwacji. Następnie do probówek l i 3 dodać po 2 ml 0,01 M
buforu octanowego o pH 4,7. Zaobserwować wynik doświadczenia.

Podzadanie 4: Chemiczna denaturacja białka – wpływ kwasu trójchlorooctowego

Do l ml roztworu białka jaja kurzego dodać 10 ml 6% kwasu trójchlorooctowego.

Szklana bagietka przenieść stracony osad białkowy do probówki z woda lub zasada.
Zapisać wyniki obserwacji i podać odpowiednie wnioski.

Podzadanie 5: Chemiczna denaturacja białka – odczyn Hellera

Wlać do probówki l ml stężonego kwasu azotowego, następnie próbówkę nachylić i

wolno po ściance wprowadzić l ml białka jaja kurzego, tak aby płyny nie zmieszały
się. Wyjaśnić wynik obserwacji oraz porównać próbę Hellera z próbą
ksantoproteinową.

LITERATURA

1. Biochemia”, L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze

2. „Biochemia Harpera”, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze

3. Cytobiochemia”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002

4. Biochemia- Krótkie Wykłady”, B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002

5. Zarys Biochemii Cz.1, Karlson P., Pwn W-Wa 1987

6. Biochemia kręgowców”, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa 1998, 2004

7. Ćwiczenia z biochemii”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003

8. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J wyd. ART. 1997

9. Ćwiczenia z biochemii, Logoń A. wyd. ART. 1997