bioch biol 4c

background image

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Ś

ledzenie przebiegu enzymatycznej hydrolizy białka

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

1

ZADANIE 5

TYTUŁ: ŚLEDZENIE PRZEBIEGU ENZYMATYCZNEJ HYDROLIZY BIAŁKA


Forma zaliczenia:
Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ć

wiczeń

Materiały i urządzenia:

• Materiały

1. pepsyna
2. żelatyna
3. ziemniak
4. ugotowane białko jaja kurzego
5. fenoloftaleina
6. czerwień metylowa
7. benzydyna
8. węglan sodu
9. NaOH 0,02N
10. HCl 0,2N
11. CH

3

COOH 0,2N

12. bufor pH=6 i pH=7
13. zobojętniony roztwór formaldehydu
14. 3% H

2

O

2

15. KCN
16. woda destylowana

• Urządzenia

1. probówki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety
5. łaźnie wodne

INFORMACJE TEORETYCZNE:.

Pepsyna jest to najważniejszy enzym trawienny soku żołądkowego działający w silnie

kwaśnym środowisku. Wykazuje ona specyficzność względem aminokwasów tworzących
rozkładane przez nią wiązania peptydowe, w które jest wprzęgnięta grupa aminowa
aminokwasów aromatycznych.

Trypsyna jest to hydrolaza peptydylopeptydowa o dużej specyficzności hydrolizująca

tylko wiązania peptydowe utworzone przez grupę karboksylowa lizyny lub argininy.
Wszystkie peptydy powstające pod działaniem trypsyny maja lizynę lub argininę jako
końcowe aminokwasy z wolna grupa karboksylowa. W miarę postępowania hydrolizy białka
przez trypsynę pojawia się w roztworze coraz więcej grup karboksylowych, które po
uprzednim zablokowaniu grup aminowych przez formaldehyd można oznaczyć ilościowo,
miareczkując wodorotlenkiem sodowym wobec fenoloftaleiny. Ilość zasady zużytej do
miareczkowania jest, wiec miara stopnia zhydrolizowania białka.

Katalaza jest jednym z najbardziej aktywnych enzymów zabezpieczających organizm

przed nagromadzeniem szkodliwego nadtlenku wodoru. Powoduje rozkład nadtlenku wodoru
niezależnie od obecności akceptora tlenu. Proces oksydoredukcyjny zachodzi pomiędzy
dwoma cząsteczkami nadtlenku wodoru:

background image

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Ś

ledzenie przebiegu enzymatycznej hydrolizy białka

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

2

H

2

0

2

+ H

2

0

2

=> 0

2

+ H

2

0

Peroksydaza jest enzymem roślinnym; w większych ilościach znajduje się w korzeniu
chrzanu. Rozkłada nadtlenek wodoru do wody przy wykorzystaniu elektronów i protonów
pobranych ze związku organicznego.

donor + H

2

O

2

==> utleniony donor + H

2

O

Donorami wodoru dla peroksydaz mogą być fenole, aminy i niektóre związki heterocykliczne.
Peroksydazy utleniają benzydynę do błękitu benzydynoweg


Przebieg do
świadczenia:

Podzadanie 1:

hydroliza białka przez pepsynę – wpływ pH na aktywność pepsyny

 Do sześciu probówek wlać roztwory odczynników według poniższego wykazu.

2 ml pepsyny przed dodaniem do probówki 5 zagotować przez 2 minuty i oziębić.
Do 2 ml pepsyny przed dodaniem do probówki 6 wprowadzić 2 krople
fenoloftaleiny i roztwór węglanu sodowego (odczynnik stołowy) do barwy różowej.
Pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 40°C przez 5 minut, następnie dodać
krople czerwieni metylowej i rozcieńczonego kwasu solnego do barwy różowej.

Objętość roztworów (ml) w poszczególnych

probówkach

Odczynniki

nr 1

nr 2

nr 3

nr 4

nr 5

nr 6

0,2 N HCl

2

2

2

0,2 N CH

3

COOH

2

Bufor pH=6

2

Bufor pH=7

2

Pepsyna natywna

2

2

2

2

Pepsyna zinaktywowana ciepłem

2

Pepsyna zinaktywowana zasadą

2

Do każdej probówki wrzucić krążek białka jaja ugotowanego na twardo. Wszystkie
próby umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 40°C na dwie godziny. Zapisać
obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski.

Podzadanie 2: oznaczanie szybkości reakcji trawienia żelatyny przez trypsynę

 Do 5 erlenmajerek na 100 ml wprowadzić po 10 ml zobojętnionego roztworu

formaldehydu. Do kolby na 100 ml wlać 6 ml roztworu enzymu ogrzanego
uprzednio do temperatury 37°C i 24 ml roztworu żelatyny. Po wymieszaniu pobrać
natychmiast 5 ml mieszaniny i wprowadzić do jednej z erlenmajerek zawierającej
formaldehyd i zmiareczkować 0,02 N NaOH wobec fenoloftaleiny do różowego
zabarwienia (próba kontrolna).
Resztę trawionej mieszaniny inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37°C
i pobierać po 5, 15, 30 i 60 minutach - 5 ml mieszaniny do analogicznego
miareczkowania jak przy próbie kontrolnej. Po odjęciu ilości mililitrów 0,02 N
NaOH przypadających na próbę kontrolna wykreślić zależność ilości mililitrów
roztworu NaOH zużytego na miareczkowanie prób badanych od czasu.

background image

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Ś

ledzenie przebiegu enzymatycznej hydrolizy białka

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

3

Podzadanie 3: wykrywanie katalazy

 Umyty i obrany ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włożyć do woreczka płóciennego

i zanurzyć w zlewce zawierającej 200 ml wody destylowanej. Otrzymuje się wodny
wyciąg z ziemniaka zawierający enzymy oraz wypłukana skrobie. Gdy skrobia
opadnie na dno zlewki płyn znad osadu pobrać do doświadczeń. Do dwóch
probówek wlać po 2 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej dodać kilka kropli
3% roztworu nadtlenku wodoru. Do drugiej kilka kropli KCN - zamieszać
i następnie dodać kilka kropli 3% roztworu nadtlenku wodoru. Zapisać obserwacje
i wyciągnąć odpowiednie wnioski.

Podzadanie 4: wykrywanie peroksydazy

 Do dwóch probówek wlać po 2 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej dodać

kilka kropli benzydyny oraz kilka kropli 3% roztworu nadtlenku wodoru. Do
drugiej kilka kropli KCN -zamieszać i następnie dodać kilka kropli benzydyny oraz
kilka kropli 3% roztworu nadtlenku wodoru. Zapisać obserwacje i wyciągnąć
odpowiednie wnioski.

LITERATURA

1. Biochemia”, L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze

2. „Biochemia Harpera”, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze

3. Cytobiochemia”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002

4. Biochemia- Krótkie Wykłady”, B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002

5. Zarys Biochemii Cz.1, Karlson P., Pwn W-Wa 1987

6. Fizjologia komórki, Giese A., PWN W-wa 1985

7. Chemia bionieorganiczna, Kafarski P., Lejczak B. PWN Warszawa 1994

8. Podstawy biofizyki, Pilawski, PWN Warszawa

9. Podstawy Cytofizjologii, Kawiak J. i inni PWN, Warszawa 1996

10. Ćwiczenia z biochemii”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003

11. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J wyd. ART. 1997

12. Ćwiczenia z biochemii, Logoń A. wyd. ART. 1997


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
bioch biol 2c
bioch biol 6c
bioch biol 5c
bioch biol 1c
bioch biol 3c
bioch biol 7c
bioch biol 2c
UP Bioch Biol 2014 wyniki kolokwiów
wyniki KOL BIOCH biol 2014
Biol kom cz 1
Biol Mol wyklad 9
czynn biol
MIKOLOGIA biol geol 2008 wyklad4 bez ilustracji
biol zmienione
arch biol 20092010 sz id 67616 Nieznany
biol MSZAKI i watrobowce
biol gielda od M
biol prob styczen 2012 id 87360 Nieznany

więcej podobnych podstron