2014-01-30

1

Immunologia zakażeń

- wybrane elementy

Ryszard Międzybrodzki

Zakład Immunologii Klinicznej

Instytut Transplantologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny

Samodzielne Laboratorium Bakteriofagowe

Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu

Mechanizmy powodujące uszkodzenie tkanek przez patogenne

drobnoustroje

Rodzaje cytokin

4

Typ

Działanie

Interferony

Regulacja j odporności wrodzonej, aktywacja odpowiedzi przeciw

wirusom, działanie antyproliferacyjne.

Interleukiny

Wzrost i różnicowanie leukocytów; wiele z nich ma działanie

prozapalne.

Chemokiny

Kontrolują chemotaksję, rekrutację leukocytów; wiele z nich ma

działanie prozapalne.

Czynniki stymulujące

wzrost kolonii

Stimulacja proliferacji i różnicowania progenitorowych komórek

hematopoetycznych.

Czynnik martwicy

nowotworu

Działanie prozapalne, aktywacja cytotoksycznych limfocytów T.

Przykład najwa

ż

niejszych miediatorów „burzy cytokinowej” bior

ą

cych udział w zapaleniu płuc.

Tisoncik J R et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012;76:16-32

6

2014-01-30

2

Interleukina 8

•

Jest najlepiej poznaną chemokiną.

•

Jej wydzielanie wzmaga IL-1 i TNF.

•

Jest wytwarzana przez monocyty (72 aminokwasy) i
środbłonek (77 aminokwasów).

•

Działa na neutrofile: powoduje ich chemoatraksję
(najsilniej ze wszystkich cytokin) i degranulację, zmianę
kształtu komórek, uwolnienie enzymów lizosomalnych,
działanie cytotoksyczne.

Inne czynniki chemotaktyczne działające na granulocyty

lub monocyty

•

fragmenty C5a i C3a dopełniacza,

•

N-formylowane peptydy uwalniane przez bakterie (np. N-
formylometionyloleucyno- fenyloalanina - FMLP),

•

defensyny wytwarzane przez komórki nabłonkowe i neutrofile,

•

IL-1, TNF-a, TGF-p, CXCL1 i CXCL5 i inne chemokiny uwalniane
przez monocyty i makrofagi,

•

tripeptyd prolina-glicyna-prolina uwalniany enzymatycznie z
kolagenu,

•

leukotrien LTB

4

i czynnik aktywujący płytki (PAF) uwalniane przez

różne komórki, w tym również przez neutrofile,

•

chemeryna (działa chemotaktycznie na makrofagi i komórki
dendrytyczne oraz uczestniczy w różnicowaniu komórek tkanki
tłuszczowej),

•

osteopontyna (występuje w kościach i bierze udział w ich
przebudowie).

•

Interleukina 1 (IL-1)

•

Interleukina 2 (IL-2)

•

Interleukina 6 (IL-6)

•

Interleukina 17 (IL-17)

Najważniejsze

interleukiny o działaniu

prozapalnym

9

•

Interleukina 4 (IL-4)

•

Interleukina 10 (IL-10)

•

Interleukina 6 (IL-6)

•

Interleukina 17 (IL-17)

Najważniejsze

interleukiny o działaniu

przeciwzapalnym

Także rozpuszczalne
receptory jak np. sIL-1R

•

Należy do nadrodziny, która obejmuje kilkadziesiąt związków o podobnej
budowie (najważniejszym obok TNF-

α

określanego obecnie jako kacheksyna

lub po prostu jako TNF jest TNF-

β

określany jako limfotoksyna).

•

Wydzielany jest głównie przez monocyty i makrofagi, ale może być także
produkowany przez limfocyty T i B, fibroblasty czy keratynocyty.

•

Występuje zarówno w formie błonowej na powierzchni komórki, jak i w formie
rozpusz-czalnej. Ma dwa receptory, które również mogą występować w formie
rozpuszczonej.

•

Receptor TNFR1 znajduje się na większości ko-mórek organizmu i wiąże obie
formy TNF aktywując m.in. czynnik transkrypcyjny NF-kappaB i/lub apoptozę
(np. komórek nowotworowych).

•

TNFR2 jest obecny głównie na powierzchni leukocytów i ko-mórek śródbłonka.
Reaguje przede wszystkim z formą błonową TNF, co najprawdopodobniej
prowadzi z jednej strony do pobu-dzenia komórek układu immunologicznego
oraz z drugiej strony do zahamo-wania apoptozy.

Czynnik martwicy nowotworu (TNF) a zajmuje centralne

miejsce wśród cytokin regulujących odpowiedź zapalną

10

•

Najsilniejszym bodźcem do wydzielania tej cytokiny jest endotoksyna, w
mniejszym stopniu także GM-CSF i sam TNF.

•

Indukuje syntezę cytokin przez inne komórki (limfocyty T pobudza do syntezy
m.in. IL-2, IFN-gamma, IL-6, makrofagi - do produkcji TNF, IL-1, IL-6, GM-CSF).

•

Pobudza uwalnianie przeciwciał przez limfocyty B.

•

Zwiększa ekspresję molekuł adhezji na komór-kach śródbłonka.

•

Stymuluje produkcję białek ostrej fazy w wątrobie (w tym białka C-
reaktywnego) i procesy resorpcji kości.

•

Bierze udział w proteolizie komórek mięśniowych i regulacji metabolizmu
tkanki tłuszczowej,

•

Jest jedmym z ważniejszych endogennych pirogenów.

Czynnik martwicy nowotworu (TNF) - cd.

11

Etanercept

(Enbrel

®

)

Infliximab

(Remicade

®

)

•Rekombinowane białko

fuzyjne receptor/fragment Fc

IgG1

•Przeciwciało

monoklonalne

Adalimumab

(Humira

®

)

= mysie

= ludzkie

Hamowanie TNF w praktyce klinicznej

IgG1

Fc

IgG1

Fc

Fab

Receptor

•PEGylowny Fab′ fragment, brak

Fc

•40 kDa PEG

•(2x20 kDa)

Certolizumab pegol

(Cimzia™)

PEG

12

2014-01-30

3

COOH

kwas arachidonowy

PGG

2

PGH

2

PGD

2

PGE

2

PGF

2

α

αα

α

TXA

2

PGI

2

szlak lipoksygenazy

SYNTAZA TROMBOKSANU

SYNTAZA PROSTACYKLINY

IZOMERAZA
PGH-PGD

IZOMERAZA
PGH-PGE

REDUKTAZA

reakcja

cyklooksygenacji

CYKLOOKSYGENAZA

reakcja

peroksydacji

OH

COOH

O

O

szlak epoksygenazy

Prostanoidy uwalniane podczas procesu zapalnego

– „szlak cyklooksygenazy”

(uwalniany z fosfolipidów błony komórkowej przez fosfolipazę A

2

- PLA

2

)

PGI

2

-

hamowanie agregacji płytek krwi

-

rozszerzanie naczyń - w stężeniach nanomolowych

-

obkurczanie naczyń - w stężeniach mikromolowych

-

pobudzanie sekrecji jelit

-

powodowanie nadwrażliwości na ból

PGD

2

-

skurcz mięśni gładkich oskrzeli

-

hamowanie agregacji płytek krwi

-

rozszerzenie naczyń (rumień alergiczny)

-

hamowanie uwalniania neuroprzekaźników

-

spadek ciśnienia, ból głowy i tachykardia (w dużych dawkach)

PGE

2

-

wpływ na napięcie mięśni gładkich (skurcz lub rozkurcz w zależności od pobudzanego receptora)

-

rozszerzanie naczyń (powodowanie niedociśnienia)

-

wzmaganie przepuszczalności naczyń mediowanej przez autakoidy

-

powodowanie nadwrażliwości na ból

-

gorączka

-

immunomodulacja (m .in. hamowanie aktywności granulocytów, makrofagów i limfocytów T w małych stężeniach)

-

działanie cytoprotekcyjne (wzmaganie wydzielania śluzu), nasilanie produkcji wodorowęglanów w błonie śluzowej
żołądka

PGF

2

α

-

skurcz mięśni gładkich oskrzeli, macicy i naczyń

-

indukcja luteolizy (regresji ciałka żółtego)

TXA

2

-

skurcz mięśni gładkich naczyń (tętnic, żył i naczyń limfatycznych)

-

skurcz mięśni gładkich dróg oddechowych

-

powodowanie agregacji płytek krwi

-

filtracja kłębkowa w nerkach

-

wydzielanie jelitowe

Aktywność biologiczna prostanoidów

Opracowano na podstawie Schröra i Smitha, (1990), Tchórzerzewskiego (1998), Davies i współpr. (1984), Salmona i Higgsa, (1987).

receptor dla IgG Fc

receptory zmiatacze

receptor dopełniacza (CR)

receptor Toll-podobny (TLR)

Neutrofile i fagocytoza

Cz

ą

steczki PAMP s

ą

starannie wybranym i strategicznym

celem. Maj

ą

one kilka charakterystycznych cech:

• s

ą

niezb

ę

dne do prze

ż

ycia drobnoustrojów,

• s

ą

niezmienne ewolucyjnie,

• s

ą

typowe dla du

ż

ych grup drobnoustrojów,

• nie wyst

ę

puj

ą

u człowieka.

Wzorce molekularne zwi

ą

zane z patogenami

(pathogen associated molecular patterns - PAMP)

• PRM to białka wi

ążą

ce PAMP.

• Pełni

ą

funkcje receptorów rozpoznaj

ą

cych wzorce

(pattern recognition receptors – PRR) - w błonie
komórkowej leukocytów, w ich wn

ę

trzu (najcz

ęś

ciej w

błonie lizosomów i siateczki

ś

ródplazmatycznej, tak

ż

e

w cytoplazmie).

• Mog

ą

by

ć

wydzielane do kr

ąż

enia b

ą

d

ź

do przestrzeni

ś

ródmi

ąż

szowej otaczaj

ą

cej komórki.

• Geny koduj

ą

ce PRM s

ą

niezmienne i zachowane przez

całe

ż

ycie osobnika w konfiguracji zarodkowej (w

przeciwie

ń

stwie do TCR i BCR) dlatego liczba ró

ż

nych

cz

ą

steczek PRM jest relatywnie niewielka (setki).

Cz

ą

steczki rozpoznaj

ą

ce wzorce

(pattem recognition molecules - PRM)

Receptor

Cząsteczka PAMP

TLR1/TLR6 Triacylowane peptydy

mikobakterii

TLR2

Peptydoglikan bakterii G(+)
Poryny N. meningitidis i N.
gonorrhaeae
Lipoarabinomannan mikobakterii
Fosfolipomannan drożdżaków
Hemaglutynina wirusa odry

TLR3

dsRNA niektórych wirusów

TLR4

LPS
Mannan drożdżaków
Glikoinozytolofosfolipidy
Trypanosoma
Białka otoczki wirusów RSV,
MMTV
Białka szoku cieplnego HSP60,
HSP70

Receptor

Cząsteczka PAMP

TLR6/TLR2 Diacylowane lipopeptydy

Mycoplasma
Kwasy tejchojowe paciorkowców
grupy B
Zymosan drożdżaków

TLR7

Wirusowe ssRNA

TLR8

Wirusowe ssRNA

TLR9

CpG-DNA większości bakterii
Hemozoina zarodźców malarii
DNA wirusów

TLR10

nieznana

Receptory Toll-podobne

2014-01-30

4

Wiązanie LPS z TLR4

Mechanizmy zabijania wewnątrzkomórkowego neutrofili

1.

Tlenowe:

a) wytwarzanie reaktywnych form tlenu:

•

anionorodnik ponadtlenkowy (O

2

•−

),

•

nadtlenek wodoru (H

2

O

2

),

•

rodnik hydroksylowy (OH

•

),

b) wytwarzanie reaktywnych form azotu:

•

tlenek azotu (NO)

•

dwutlenek azotu (NO2)

•

kwas nadtlenoazotawy (HONO

2

)

•

jon nadtlenoazotynowy (ONOO

-

)

c) kwas podchlorawy (HOCl)

2.

Beztlenowe (białka i enzymy o działaniu bakteriobójczym):

•

obecne w lizosomach, czy ziarnach neutrofilów, np. lizozym, elastaza,
proteazy, kolagenaza, laktoferyna, fosfolipazy, mieloperoksydaza, czynnik
bakteriobójczy zwiększający przepuszczalność (BPI),

•

działające na fagocytowane mikrooorganizmy w fagolizosomie.

• Niszczenie drobnoustrojów

• Działanie chemotaktyczne na komórki

dendrytyczne i limfocyty T

• Udział w gojeniu

• Aktywacja dopełniacza

• Aktywacja wła

ś

ciwo

ś

ci

ż

ernych makrofagów

• Zahamowanie wytwarzania glikokortykosteroidów

• Degranulacja komórek tucznych

• Hamowanie fibrynolizy

DEFENSYNY

peptydy kationowe

Rola eozynofili

w obronie przed

patogenami

Bazofile i mastocyty

Ich zadanie polega na bardzo szybkim
(natychmiastowym) uwolnieniu media-
torów

ułatwiaj

ą

cych

(m.in.

przez

odpowiednie

zmiany

w

tkankach)

komórkom (i przeciwciałom) bior

ą

cym

udział w reakcji zapalnej napływ do
miejsca wytargni

ę

cia drobnoustrojów i

efektywne działanie.

Superantygeny

•

Mogą być pochodzenia bakteryjnego,
mikoplazmatycznego, wirusowego lub
roślinnego.

•

Należą do nich m.in..:

- egzotoksyny wytwarzane przez

paciorkowce (np.: białko M),

- enterotoksyny gronkowcowe.

•

Wykazują niespecyficzny sposób wiązania
się z kompleksem TCR - cząsteczka MHC
klasy II.

•

Reagują z zewnętrzną powierzchnią odcinka
V łańcucha beta.

•

Mogą pobudzać zarówno limfocyty T CD4,
jak i limfocyty T CD8.

•

Stymulują wydzielanie silnie „toksycznych”
cytokin TNF, IL-2 i IFN-

γ

.

MHC II

TCR

limfocyt

T

APC

V

β

V

α

superantygen

Pobudzanie limfocytów T przez

antygeny, superantygeny i mitogeny

• Zwykłe antygeny: 0.001% to 0.01% populacji komórek

• Alloantygeny: 1% to 5% populacji komórek

• Superantygeny: 5% to 25% populacji komórek

• Mitogeny: prawie 100% populacji komórek

2014-01-30

5

25

Odpowiedź immunologiczna

przeciwko bakteriom

zewnątrzkomórkowym

A. Elementy odpowiedzi nieswoistej:

•

aktywacja dopełniacza

•

fagocytoza

•

reakcja zapalna

B. Odpowiedź swoista:
1. głównie odpowiedź humoralna –
przeciwciała:

•

neutralizujące toksyny bakteryjne,

•

wiążące się do powierzchni bakterii i
działające jako,opsoniny ułatwiające
fagocytozę (>100x),

•

hamujące adhezję bakterii do komórek
docelowych aktywujące dopełniacz i
lizę bakterii,

•

aglutynujące bakterie,

2. mniejsze znaczenie odpowiedzi
komórkowej:

•

antygeny sfagocytowanych przez APC,
bakterii są prezentowane limfocytom
pomocniczym,

•

aktywacja limfocytów cytotoksycznych
prowadzi do:

- pobudzenia fagocytozy,
- stymulowania produkcji przeciwciał,
- indukcji miejscowej reakcji zapalnej.

26

Dotyczy np. prątków gruźlicy, pratków trądu i pałeczek Listeria monocytogenes.

1) Odpowiedź nieswoista – głównie z udziałem komórek NK:

- niszczą zakażone komórki i wydzielają IFN-γ

- IFN-γ pobudza fagocytozę i zabijanie wewnątrzkomórkowych bakterii

2) Odpowiedź swoista – głównie odpowiedź odpornościowa typu komórkowego prowadzi do:

- stymulowania makrofagów do zabijania wewnątrzkomórkowych bakterii,

- lizy zainfekowanych komórek przez limfocyty cytotoksyczne,

- ponieważ większość tego typu bakterii jest oporna na fagocytozę prowadzi to do
przewlekłego zakażenia i tworzenia ziarniniaków.

Eliminacja bakterii wewnątrzkomórkowych

Niektóre mechanizmy zapobiegania indukcji reakcji immunologicznej przez bakterie

Unikanie wywołania du

ż

ej odpowiedzi przeciwciał.

Przeciwciała, które powstaj

ą

, blokuj

ą

funkcj

ę

przeciwciał uszkadzaj

ą

cych. Wytwarzanie

proteaz uszkadzaj

ą

cych przeciwciała slgA.

Uwalnianie błonowych p

ę

cherzyków maj

ą

cych zdolno

ść

adsorbowania miejscowych

przeciwciał.
Zmiana składu antygenowego:

przez sializacj

ę

LPS (przypomina wtedy oligosacharydy ssaków i ułatwia szybkie

usuwanie dopełniacza
przez zmian

ę

fazy ekspresji antygenu, co powoduje alternatywne umiejscowienie

cz

ą

steczek powierzchniowych

geny koduj

ą

ce piliny, podjednostki rz

ę

ski bakteryjnej, przechodz

ą

homologiczne

rekombinacje, aby wytworzy

ć

warianty

Zaburzanie aktywacji limfocytów T przez produkowanie białek hamuj

ą

cych ich

koreceptory (np. CEACAM-1) na powierzchni limfocytów.
Unikanie uszkodzenia przez dopełniacz:

przez tworzenie zewn

ę

trznej otoczki,

budowa powierzchni zewn

ę

trze w sposób uniemo

ż

liwiaj

ą

cy dost

ę

p makrofagów i ich

receptorów do C3b zwi

ą

zanego z bakteri

ą

wytwarzanie struktur powierzchniowych uniemo

ż

liwiaj

ą

cych si

ę

przył

ą

czenie MAC do

błony komórkowej
wytwarzanie enzymów degraduj

ą

cych dopełniacz lub go usuwaj

ą

cych z powierzchni

komórek,,
wydzielanie białek wabikowych wi

ążą

cych si

ę

z dopełniaczem.

28

Odpowiedź immunologiczna przeciwko wirusom

Interferon (IFN)

Typ I interferonów:

• IFN

α

(leukocytarny) - wytwarzany jest w nast

ę

pstwie zaka

ż

enia wirusowego;

• IFN

β

(fibroblastyczny) - wytwarzany jest w nast

ę

pstwie zaka

ż

enia wirusowego;

• IFN

τ

/

ε

(trofoblastyczny);

• FN

κ

(keratynocyty).

Typ II interferonów:

• IFN

γ

- jest wytwarzany tylko po antygenowym lub mitogenowym pobudzeniu

limfocytów T i komórek NK.

Typ III interferonów:

• IFN

λ

.

NK

IFN II

IFN I

IFN I

IL-12

IL-12

komórka

dendrytyczna

zaka

ż

ona

komórka

makrofag

wirus

Aktywno

ść

przeciwwirusowa

IFN

α

, IFN

β

obrona wewn

ą

trzkomórkowa

PKR

(kinaza białkowa)

syntetaza

2’,5’-oligoadenylowa

białko Mx

chroni s

ą

siaduj

ą

ce,

niezaka

ż

one komórki

apoptoza

blokowanie

syntezy

białek

wirusa

RNazaL

(latentna

endonukleaza)

blokuje

transkrypcj

ę

wirusa

degraduje

wirusowe dRNA

2014-01-30

6

Mechanizmy zapobiegania indukcji reakcji immunologicznej przez wirusy Herpes

Mechanizmy zapobiegania indukcji reakcji immunologicznej przez wirusy Herpes

Mechanizmy zapobiegania indukcji reakcji immunologicznej przez wirusy Herpes

Mechanizmy pozwalające grzybom przetrwać

•

Cryptococcus neoformans - wytwarza otoczkępolisacharydową, która
hamuje fagocytozę (zasada podobna do tej, która dotyczy bakterii
otoczkowych); przeciwdziała temu opsonizacyjny wpływ dopełniacza i
przeciwciał.

•

Histoplasma capsulatum - jest wewnątrzkomórkowym patogenem, który
unika zabijania przez makrofagi poprzez wejście do komórki przez CR3 i
następnie zaburzenie prawidłowego dojrzewania fagosomu (podobnie jak
M. tuh\berculosis).

•

Dermatofity hamują odpowiedź limfocytów T gospodarza, opóźniając
destrukcję zależną od odpowiedzi komórkowej.

36

Odpowiedź immunologiczna przeciw pasożytom

•

Przewlekłe zakażenia pasożytami cechują się słabą odpowiedź immunologiczną
oraz dużą zdolności pasożytów do unikania jej indukowania.

•

Pasożyty mogą unikać zniszczenia przez dopełniacz.

•

Pierwszą linią obrony jest odpowiedź nieswoista (receptory Toll, i receptory
zmiatacze.

•

W przypadku pierwotniaków, które stymulują komórki dendrytyczne do produkcji
IL-12 rozwija się odpowiedź typu T

H

1 (co objawia się produkcją głównie IFNγ i IL-2)

i pobudzane są makrofagi.

•

Cząsteczki PAMP pasożytniczych robaków nie stymulują komórek dendrytycznych
do produkcji dlatego rozwijana jest odpowiedź typu T

H

2 (co objawia się produkcją

głównie IL-4, IL-5, IL-9, IL-13), a to prowadzi do aktywacji eozynifili, produkcji IgE
oraz pobudzenia komórek tucznych i bazofilów.

•

Obrona gospodarza może zależeć od szczególnych cech genetycznych (np. malaria).

•

Szczepionki przeciwko ludzkim pasożytom nie są jeszcze dostępne. GlaxoSmithKline
ukończyło pomyślnie badania i zamierza zarejestrować pierwszą szczepionkę
przeciwko malarii (RTS).

2014-01-30

7

•

Ilość mikroorganizmów flory jelitowej przekracza 10-
krotnie liczbę komórek budujących nasze ciało.

•

Bakterie flory jelitowej znajdują się przede wszystkim
w jelicie grubym i stanowią 60% masy kału.

•

300-1000 gatunków bakterii wchodzi w skład flory
jelitowej z czego najczęściej wymienia się ok. 500
gatunków.

•

30-40 gatunków składa się na 99% wszystkich bakterii flory jelitowej.

•

Większość bakterii należy do rodzaju Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium,
Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus i Bifidobacterium

•

W mniejszej ilości występują Escherichia i Lactobacillus.

•

Gatunki należące do rodzaju Bacteroides stanowią około 30 % wszystkich bakterii w jelitach.

•

Oprócz bakterii w skład mikroflory jelitowej mogą wchodzić:

•

grzyby ( Candida, Saccharomyces, Aspergillus) i pierwotniaki .

•

Obecne są również bakteriofagi – najczęściej w postaci profagów.

Mikroflora jelitowa

•

Badania dotyczące flory jelitowej ludzi cierpiących na cukrzycę typu 2 wykazały spadek
liczebności bakterii Firmicutes i Clostridia (Larsen i wsp. 2010). Również Fueret i wsp.
(2010) wykazali zredukowaną liczebność bakterii Faecalibacterium prausnitzii należących
do typu Firmicutes u osób chorujących na cukrzycę typu 2. Natomiast analiza składu
bakteryjnego kału osób chorych na cukrzycę typu 2 i zdrowych, wykonana metodami PCR
przez Wu i wsp. (2010) wykazała, że w kale osób z cukrzycą było mniej bakterii
Bacteroides vulgatus i Bifidobacterium.

•

Proporcja bakterii Bacteroides do Firmicutes znajdujących się w przewodzie pokarmowym
może także odgrywać ważną rolę w pojawieniu się cukrzycy typu 1. Eksperyment
przeprowadzony na szczurach rasy BB-DP (Bio-Breeding diabetes-prone) genetycznie
predysponowanych do spontanicznego zachorowania na cukrzycę typu 1 wykazał, że
zwierzęta u których rozwinęła się cukrzyca miały znacznie wyższy odsetek bakterii
Bacteroides ssp niż osobniki zdrowe (Brugman et al. 2006).

•

Badania przeprowadzone przez Brugman i wsp. wskazały, że doustne podanie
antybiotyków może zmniejszać prawie o 50% zachorowalność na cukrzycę u szczurów
rasy BB-DP genetycznie predysponowanych do spontanicznego zachorowania na cukrzycę
typu 1. Również w przypadku cukrzycy typu 2 (myszy ob/ob) podawanie antybiotyków
prowadziło do poprawy tolerancji glukozy (Membrez et al. 2008).

Mikroflora jelit a cukrzyca

Rola limfocytów T

γδ

w obronie przed patogenami przewodu pokarmowego

Rola IgA w obronie przed patogenami przewodu pokarmowego

IgA nie wiąże dopełniacza!

Bakteriofagi:

-

biologia

-

wpływ na układ immunologiczny

-

możliwości zastosowania w terapii

Prof. Ludwik Hirszfeld, Immunology, 1949:

„The anti-bacterial activity of the immune system is
much weaker than bacteriophages.

The practical implications of this phenomenon
should be further explored.”

Bakteriofagi (w skrócie fagi) s

ą

wirusami

infekuj

ą

cymi tylko komórki bakteryjne.

S

ą

najliczniejsz

ą

grup

ą

wirusów (na Ziemi

wyst

ę

puje 4-6 x10

30

wirionów).

Dotychczas opisano ponad 5000 ró

ż

nych

bakteriofagów.

Wi

ę

kszo

ść

fagów (ponad 95%) to fagi

ogonkowe, ale mog

ą

te

ż

by

ć

wielo

ś

cienne,

włókienkowe i pleomorficzne.
Wyst

ę

puj

ą

powszechnie w

ś

rodowisku:

-

ś

rodowiska wodne - 10

4

-10

7

cz

ą

stek/ml,

- gleba - nawet 10

7

cz

ą

stek/g.

Mog

ą

naturalnie wyst

ę

powa

ć

w pokarmie i

organizmie człowieka (np. w kale w proporcji
1 cz

ą

stka faga na 1 bakteri

ę

).

Nie wykazano ich niekorzystnego działania na
komórki ludzkie.

BAKTERIOFAGI

(wg. Ackermanna

i Dubowa, 1987)

2014-01-30

8

Cykle

ż

yciowe bakteriofagów: cykl lityczny

●

W ten sposób namna

ż

aj

ą

si

ę

zarówno

fagi lityczne (tzw. fagi zjadliwe) jak i fagi
lizogenizuj

ą

ce (tzw. fagi łagodne).

●

Prowadzi do szybkiego zniszczenia
komórki bakteryjnej.

●

Proces oparty jest na kaskadowej
transkrypcji genów fagowych.

●

W fazie wczesnej syntezowane s

ą

białka

regulatorowe faga, nast

ę

pnie

syntetyzowane s

ą

białka strukturalne a w

fazie pó

ź

nej składane kompletne wiriony.

●

Przykładem faga litycznego jest
bakteriofag T4.

adsorpcja

faga

infekcja

namnożenie

materiału

genetycznego

i białek

kapsydu

formowanie

nowych

fagów

uwolnienie fagów

potomnych - liza

Liza komórki bakteryjnej - uwolnienie fagów potomnych.
Zdj

ę

cie z archiwum IITD PAN.

Cykle

ż

yciowe bakteriofagów: cykl lizogenny

●

W ten sposób namna

ż

aj

ą

si

ę

wył

ą

cznie

fagi lizogenizuj

ą

ce.

●

Materiał genetyczny faga wł

ą

czany jest do

chromosomu bakteryjnego (profag) i jest
powielany jednocze

ś

nie z namna

ż

aj

ą

c

ą

si

ę

bakteri

ą

.

●

Wi

ę

kszo

ść

genów fagowych ulega

czasowej supresji, a jedynym
ekspresjonowanym wydajnie genem jest
represor.

●

Warunki stresowe (typu fizycznego lub
chemicznego) doprowadzaj

ą

do

uwolnienia kwasu nukleinowego wirusa,
wej

ś

cia w cykl lityczny i zniszczenia

bakterii.

●

Profagi mog

ą

przenosi

ć

m.in. geny

koduj

ą

ce toksyny (np. werotoksyn

ę

).

●

Przykładem faga lizogennego jest fag

λ

.

infekcja

lizogenia

indukcja

liza

PROFAG

Bakteriofagi terapeutyczne

●

W terapii zastosowanie znajduj

ą

fagi lityczne, które szybko niszcz

ą

bakterie.

●

Ich farmakokinetyka jest trudna do scharakteryzowania.

●

Mog

ą

mno

ż

y

ć

si

ę

w miejscu zaka

ż

enia.

●

Mechanizm bakteriobójczego działania bakteriofagów jest odmienny od
antybiotyków.

●

Posiadaj

ą

zdolno

ść

zabijania bakterii opornych na antybiotyki (MRSA,

VRE, E. coli ESBL, MDR P. aeruginosa).

●

Niektóre fagi terapeutyczne s

ą

wra

ż

liwe na niskie pH (< 4) – podawane

doustnie mog

ą

by

ć

inaktywowane przez sok

ż

oł

ą

dkowy.

●

Istnieje mo

ż

liwo

ść

rozwoju oporno

ś

ci bakterii na faga. W niektórych

przypadkach, rozwój oporno

ś

ci na bakteriofagi wi

ąż

e si

ę

ze zmniejszeniem

zjadliwo

ś

ci bakterii.

●

Działanie lityczne fagów jest swoiste tzn. fagi s

ą

aktywne wobec jednego

lub kilku spokrewnionych szczepów bakterii (najcz

ęś

ciej w obr

ę

bie tego

samego gatunku). Jest to jednak korzystne, gdy

ż

umo

ż

liwia eliminacj

ę

bakterii patogennych bez naruszenia równowagi naturalnej mikroflory, co
mo

ż

e by

ć

konsekwencj

ą

antybiotykoterapii.

Penetracja fagów do krwi i w

ą

troby u myszy

po podaniu doustnym

Kłak M., Mi

ę

dzybrodzki R., Bubak B., Jo

ń

czyk E., Weber-D

ą

browska B., Górski A. Studies on the

gastrointestinal transit and blood penetration of a therapeutic staphylococcal bacteriophage. First
International Congresss on Viruses of Microbes, Pary

ż

21-25 czerwiec 2010

Lizat fagowy (10

7

pfu/ml) podawano w obj

ę

to

ś

ci 0,2 ml. Do

neutralizacji soku

ż

oł

ą

dkowego u

ż

yto zawiesiny Alugastrinu

(dihydroxyaluminum sodium carbonate), który podawano
doustnie 10 min. rzed podaniem fagów.
Myszom w grupie kontrolnej podano tylko preparat fagowy.
Po 1 godz. myszy u

ś

miercano i pobierano do oznacze

ń

próbk

ę

pełnej heparynizowanej krwi i fragment w

ą

troby,

który homogenizowano i zawieszano w PBS w stosunku
1:1.

Hamuj

ą

cy wpływ fagów na tworzenie wolnych rodników przez granulocyty

stymulowane endotoksyn

ą

Mi

ę

dzybrodzki R.,

Ś

witała-Jele

ń

K., W. Fortuna, Weber-D

ą

browska B., Przerwa A., Kurz

ę

pa A., Łusiak-Szelachowska M.,

D

ą

browska K., Boraty

ń

ski J., Syper D., Ługowski C., Po

ź

niak G., Górski A.: Bacteriophage inhibition of reactive oxygen

species generation by endotoxin-stimulated polymorphonuclear leukocytes. Virus Res. 2008; 131: 233-242.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

A

U

C

C

L

[R

L

U

××××

m

in

]

p<0.05

p<0.001

p<0.01

p<0.05

p<0.001

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

A

UC

C

L

[RL

U

××××

m

in

]

p<0.001

p<0.001

p<0.001

p<0.001

p<0.001

Wpływ faga T4 na chemiluminescencj

ę

ludzkich granulocytów

stymulowanych

lipopolisacharydem

(LPS)

izolowanym

ze

ś

ciany bakteryjnej.

Komórki

były

stymulowane

LPS

izolowanym

z

bakterii

homologicznych - E. coli J5 lub heterologicznych - E. coli R4
preinkubowanymi (30 min) w 37°C lub nie preinkubowanymi (0
min) z fagiem T4 (oczyszczony). Stymulacj

ę

komórek samym

LPS lub mieszanin

ą

fagów i LPS rozpoczynano 15 min przed

dodaniem luminolu.

Kontrola: komórki

nie stymulowane.

Nat

ęż

enie chemiluminescencji wyra

ż

ano jako

ś

rednie pole pod

krzyw

ą

(AUC

CL

) mierzone w czasie od “0” do 60 min po

dodaniu luminolu. Pokazano tylko istotne warto

ś

ci p.

Wpływ faga T4 na chemiluminescencj

ę

ludzkich granulocytów

stymulowanych bakteriami.

Komórki były stymulowane

ż

ywymi bakteriami homologicznymi

E. coli J5 lub heterologicznymi E. coli R4 preinkubowanymi (30
min) w 37°C lub nie preinkubowanymi (0 min) z fagiem T4
(oczyszczony). Referencyjna zawiesina bakterii w PBS była
inkubowana przez 30 min w 4

°°°°

C w celu wstrzymania namna

ż

ania

si

ę

bakterii.

Stymulacj

ę

komórek

zawiesin

ą

bakterii

lub

mieszaniny fagów i bakterii rozpoczynano 15 min przed dodaniem
luminolu.

Kontrola:

komórki

nie

stymulowane.

Nat

ęż

enie

chemiluminescencji wyra

ż

ano jako

ś

rednie pole pod krzyw

ą

(AUC

CL

) mierzone w czasie od “0” do 60 min po dodaniu

luminolu. Pokazano tylko istotne warto

ś

ci p.

Wpływ podawania terapeutycznego preparatu oczyszczonego faga T4
na przebieg zapalenia stawów indukowanego kolagenem (CIA) u myszy

Mi

ę

dzybrodzki R. i współpr. In vivo studies on the influence of bacteriophage preparations on inflammatory

process. XI Kongres Polskiego Towarzystwa Transplantologicznego, Bydgoszcz 29-30 listopad 2013 r.

Łapa zdrowa

Łapa z zapaleniem

stawów

0

2

4

6

8

10

12

0

7

14

21

28

35

42

49

56

a

rt

h

ri

ti

s

s

c

o

re

days since arthritis induction

Control

Purified T4 preparation

Methotrexate

**

*

*

preparation administration

*

control (0,25 ml PBS i.p.)

purified T4 phage (2x10

9

pfu/mouse i.p. once daily)

MTX (10 mg/kg i.v. 3 times a week)

Immunizacja kolagenem w dniu 0, dawka przypominaj

ą

ca w dniu 21 (strzałka).

Dawkowanie faga T4: 2x10

9

pfu/mysz i.p. (w 0,25 ml PBS) codziennie od dnia 21 do 41.

Kontrola: 0,25 ml PBS (i.p.) Ilo

ść

myszy w grupach: n=10-11.

Dla porównania przedstawiono efekt przeciwzapalny metotreksatu podawanego w dawce 10 mg/kg m.c. (i.v.)
3 razy w tygodniu (co 2-3 dni) od dnia 21 do 41 (n=7).

* p<0,05 w porównaniu do kontroli.

2014-01-30

9

• Analizowano dane pochodz

ą

ce od 37 pacjentów z zapaleniem ko

ś

ci i szpiku, zaka

ż

eniem okołoprotezowym,

zaka

ż

eniem tkanek mi

ę

kkich lub infekcj

ą

dolnych dróg oddechowych wywołanych przez S. aureus, S. epidermidis,

E. faecalis, E. coli, lub P. aeruginosa przed i w trakcie stosowania preparatów fagowych.

• Preparaty fagowe (naturalne lizaty fagowe) były podawane doustnie (10-ml trzy razy dziennie po neutralizacji soku

ż

oł

ą

dkowego za pomoc

ą

10 ml zawiesiny w

ę

glanu dihydroksysodowo-glinowego) i/lub miejscowo (dwa razy

dziennie przymoczki lub płukanie przetoki).

• Na rycinie poni

ż

ej przedstawiono

ś

rednie warto

ś

ci (±SE) st

ęż

enia CRP w surowicy, OB i liczby leukocytów we krwi

obwodowej chorych mierzone przed oraz pomi

ę

dzy 9 a 32 dniem leczenia. Ró

ż

nice analizowano za pomoc

ą

testu

Wilcoxona (n – ilo

ść

analizowanych przypadków).

Mi

ę

dzybrodzki R, Fortuna W , W eber-D

ą

browska B, Górski A. A retrospective analysis of changes in

inflammatory markers in patients treated with bacterial viruses. Clin Exp Med. 2009, 9(4): 303-312

Zmiany markerów zapalnych u pacjentów w czasie
terapii fagowej

CRP w surowicy

OB

Leukocyty we krwi obwodowej

Phage day 8 post-TX Saline day 8 post-TX

Górski, A., Kniotek, M., Perkowska-Ptasi

ń

ska, A., Mróz, A., Przerwa, A., Gorczyca, W., D

ą

browska, K., Weber-D

ą

browska, B.,

Nowaczyk, M. Bacteriophages and transplantation tolerance. Transplant Proc 2006: 38: 331-333.

Effect of bacteriophages on skin allograft survival in mice

Effect T4 phage and HSV-1 on NF-

κ

B activity

in HUVEC and A549 line

The HUVEC and human epithelial-like lung cancer line A549 cells were incubated for 8 hours
at 37°C either in the absence (control) or in the presence of phage T4 (10

2

–10

3

pfu/cell).

HSV-1 (2 virions/cell) was added after 1 hour of preincubation with or without the phage, and
the cells were incubated for 7 consecutive hours. Then the NF-

κ

B activity was determined by

means of electromobility shift assay (EMSA).

Górski, A., Kniotek, M., Perkowska-Ptasi

ń

ska, A., Mróz, A., Przerwa, A., Gorczyca, W., D

ą

browska, K., Weber-

D

ą

browska, B., Nowaczyk, M. (2006). Bacteriophages and transplantation tolerance. Transplant Proc 38, 331-333.

Badanie wpływu bakteriofagów na zdolność wirusów do
zakażania komórek nabłonkowych człowieka in vitro

n

Ś

redni

CPE

SE

A. Komórki zaka

ż

ane wirusem VSV:

1. nie inkubowane z fagiem (kontrola)

12

2,08

0,15

2. preinkubowane z fagiem przed zaka

ż

eniem

8

2,31

0,09

3. inkubowane z fagiem przed, w trakcie i po zaka

ż

eniu

10

2,35

0,11

4. inkubowane po zaka

ż

eniu

10

2,10

0,19

B. Komórki zaka

ż

ane wirusem HSV-1:

1. nie inkubowane z fagiem (kontrola)

12

2,29

0,11

2. preinkubowane z fagiem przed zaka

ż

eniem

8

2,63

0,13

3. inkubowane z fagiem przed, w trakcie i po zaka

ż

eniu

10

2,55

0,17

4. inkubowane po zaka

ż

eniu

8

2,25

0,27

C. Komórki zaka

ż

ane adenowirusem typu 5:

1. nie inkubowane z fagiem (kontrola)

11

1,86

0,12

2. preinkubowane z fagiem przed zaka

ż

eniem

7

1,86

0,18

3. inkubowane z fagiem przed, w trakcie i po
zaka

ż

eniu

10

1,45 *

0,14

4. inkubowane po zaka

ż

eniu

10

1,70

0,15

Wpływ faga T4 na efekt cytopatyczny (CPE) ró

ż

nych wirusów na komórki

A549. * p<0,05 (test U Manna-Whitneya)

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

Ko

nt

ro

la

Fa

g

T4

A

5

A

5

+

Fa

g

e

k

s

ty

n

k

c

ja

*

Ż

ywotno

ść

komórek A549

preinkubowanych przez 24 godz. z
fagiem T4 (8x10

8

pfu/dołek), a

nast

ę

pnie 45 min. z adenowirusem

typu 5 (A5) oznaczana metod

ą

z

u

ż

yciem MTT po 24 godz. od

zaka

ż

enia. Przedstawiono

ś

redni

ą

ekstynkcj

ę

z 4 powtórze

ń

(±SE). *

p<0,05 w porównaniu do A5 (test
Scheffego).

Mi

ę

dzybrodzki R. i współpr. The in vitro studies on bacteriophage influence on the ability of human viruses to

infect epithelial cells. 20

th

Biennial Evergreen International Phage Meeting. USA, sierpie

ń

2013 r.

Praca przegladowa
Mi

ę

dzybrodzki R., Fortuna W., Weber-D

ą

browska B., Górski A.: Bacterial

viruses against viruses pathogenic for man? Virus Res. 2005; 110: 1-8.

Phage inactivation by sera from patients receiving
phage therapy

Łusiak-Szelachowska M., Weber-D

ą

browska B., Mi

ę

dzybrodzki R.,

Ż

aczek M., Mazur A., Górski A. Phage neutralization by

sera of patients receiving phage therapy (poster presentation No. 230). Viruses of Microbes, 16-20 July, 2012 , Brussels

Rates of phage inactivation (K) by serum of patient treated topically
with S. aureus phage 676/Z.

Praktyczne zastosowanie bakteriofagów

Identyfikacja bakterii

Dochodzenia epidemiologiczne

Badania taksonomiczne

Rolnictwo i przemysł spo

ż

ywczy

Leczenie i profilaktyka zaka

ż

e

ń

bakteryjnych u ludzi i zwierz

ą

t

2014-01-30

10

HISTORIA TERAPII FAGOWEJ

Odkrycie bakteriofagów:

W roku 1896 Ernest Hankin, zwalczaj

ą

cy epidemi

ę

cholery w Indiach, opublikował swoje obserwacje o
tym,

ż

e Hindusi pij

ą

cy wod

ę

z Gangesu rzadziej

zapadaj

ą

na t

ę

chorob

ę

.

W roku 1915 Frederick William Twort, a w roku
1917 Felix d’Herelle opisali niezale

ż

nie nieznany

czynnik niszcz

ą

cy bakterie, który przechodzi przez

filtry zatrzymuj

ą

ce komórki bakteryjne i daje si

ę

seryjnie pasa

ż

owa

ć

na bakteriach.

Felix d’Herelle jako pierwszy zastosował fagi do
leczenia czerwonki w 1919 roku.

F. W. Twort

F. d’Herelle

Pocz

ą

tkowy okres stosowania terapii fagowej:

Szybkie pojawienie si

ę

na rynku komercyjnych preparatów

fagowych ju

ż

w latach 20. XX wieku produkowanych przez du

ż

e

koncerny (np. przez Eli Lilly and Company w USA, L'Oréal we
Francji).

Niedostateczna wiedza w zakresie biologii fagów, co powodowało,

ż

e stosowano je nie tylko w leczeniu zaka

ż

e

ń

bakteryjnych.

Zmniejszenie zainteresowanie bakteriofagami w medycynie
zachodniej po wprowadzeniu do lecznictwa antybiotyków.

Kontynuacja terapii fagowej w Europie

Ś

rodkowo-Wschodniej:

Instytut im. Eliavy w Tbilisi (zało

ż

ony przez Georgija Eliaw

ę

i

otwarty w 1923 roku);

Instytut Immunologii i Terapii Do

ś

wiadczalnej PAN we

Wrocławiu (od 2005 – O

ś

rodek Terapii Fagowej).

HISTORIA TERAPII FAGOWEJ

Próby zastosowania bakteriofagii w chirurgii

Dr Jerzy Jasie

ń

ski

POLSKA GAZETA LEKARSKA 1927, 4: 67-73

HISTORIA TERAPII FAGOWEJ

Komercyjne preparaty fagowe dopuszczone do
stosowania w przemy

ś

le spo

ż

ywczym i do ochrony

ro

ś

lin

• LISTEX

TM

P100 (EBI Food Safety) i LPM-102

TM

(Intralytix, Inc.) –

preparaty oczyszczonych

ż

ywych fagów swoistych dla szerokiego

spektrum szczepów Listeria dopuszczone w 2006 roku przez
Administracj

ę

Leków i

Ż

ywno

ś

ci USA (FDA) do stosowania jako

dodatek do gotowych do spo

ż

ycia produktów

ż

ywno

ś

ciowych do

eliminacji Listeria monocytogenes.

• Finalyse









(Elanco Food Solutions) – mieszanina fagów przeciwko E. coli O157:H7 do

redukcji zanieczyszczenia bydła t

ą

bakteri

ą

. Podobny preparat, EcoShield™, został

wprowadzany przez firm

ę

Inralytix do stosowania w celu zmniejszenia zanieczyszczenia

mi

ę

sa t

ą

bakteri

ą

.

• AgriPhage

TM

(OmniLytics, Inc.) – preparat

ż

ywych fagów

fagowy przeciwko Xanthomonas campestris pv. vesicatoria i
Pseudomonas syringae pv. tomato dopuszczony w 2006 roku
przez Agencj

ę

Ochrony

Ś

rodowiska USA do ochrony plantacji

papryki i pomidorów przed plamisto

ś

ci

ą

bakteryjn

ą

.

Nazwa badania

Sponsor

Realizacja

Opis wyników i

ź

ródło

A single-center
randomized and
placebo-controlled
trial on the safety
and the
bioavailability
measure of oral
phage

Nestlé Research
Center, Nestec Ltd.,
Lausanne,
Switzerland

VI 2003

Fifteen healthy adult volunteers received two doses (10

3

and 10

5

PFU/ml) of purified Escherichia coli T4 phage, and placebo in 150
ml of drinking water. Neither adverse events nor significant change in
population of commensal E. coli related to phage application were
observed. Phages were detected in stools 1 day after exposure in all
volunteers receiving the higher phage dose but a week after a 2-day
course of phage application no phage was detected.

Ref.: Bruttin A and Brüssow H. Antimicrob Agents Chemother
2005;49: 2874-2878

A double-blind
placebo-controlled
initial phase I/II
clinical trial
targeting chronic
ear infections
caused by P.
aeruginosa

Biocontrol Ltd.,
London, UK

VII 2006

– X 2007

Twelve patients suffering from otitis media caused by antibiotic
refractory P. aeruginosa were treated with a single dose of
bacteriophage mixture prepared by Biocontrol Ltd. and another
twelve with placebo. It was presented that phage administration was
safe, and there was significant reduction of clinical symptoms at day
42 in bacteriophage treated group (55% of total clinical score at the
day zero) compared to the control group (104%). There was also
76% decrease in mean count of bacteria in samples taken from the
patient’s ears 6 weeks after phage application when in controls even
small increase (9%) was observed.

Ref.: Wright A et al. Clin Otolaryngol. 2009;34:349-57.

A prospective,
randomized,
double-blind
controlled study of
WPP-201 for the
safety and efficacy
of treatment of
venous leg ulcers

Southwest Regional
Wound Care Centre
in Lubbock, Texas,
USA

IX 2006

– V 2008

This was a phase I study of WPP-201 - a cocktail of 8 lytic
bacteriophages against P. aeruginosa, S. aureus, and E. coli.
developed by Intralytix Inc., USA. It contained a concentration of
approximately 1

×

10

9

PFU/ml of each of the component monophages

isolated from environment and not genetically modified. The primary
objective of this study was to evaluate the safety of the topical use of
WPP-201 on the healing of the full thickness venous leg ulcers of
greater than 30 days duration.

Ref.: Rhoads DD et al. J Wound Care. 2009;18:237-8, 240-3.

Randomizowane badania kliniczne w zakresie terapii fagowej

Nazwa badania

Sponsor

Opis badania i

ź

ródło

A limited clinical trial
using bacteriophages
against methycyllin-
resistant S. aureus and
multi drug-resistant P.
aeruginosa on burn
wounds

Burn Wound Centre of
the Queen Astrid Military
Hospital, Brussels,
Belgium

A well-defined cocktail of lytic bacteriophages against methycyllin-
resistant S. aureus and multi drug-resistant P. aeruginosa will be
applied on burn wounds in 20 patients at the Burn Wound Centre of
the Queen Astrid Military Hospital. Phages will be characterized by the
fingerprint and electron microscopy and targeted against bacteria
occurring in the Hospital. Sterility and apyrogenicity of the phage
preparation will be certified.

Ref.: Verbeken G et al. Future Microbiol 2007;2(5):485-91.

Merabishvili M et al. PLoS ONE 2009;4(3): e4944.

Randomized, Double
Blind Placebo-
controlled Studies to
Evaluate the Effect of
an Orally-fed
Escherichia Coli (E.
Coli) Phage in the
Management of ETEC
and EPEC Induced
Diarrhea in Children

Nestlé Nutrition
Corporate,
Lausanne, Switzerland

This trial aims to evaluate the effect of oral administered E. coli phage
in children aged 4-60 months of age with proven ETEC and EPEC
diarrhea. Enrolled children will be randomly assigned, in equal
numbers, to receive either: (i) a new T4 phage cocktail or (ii)
Russian anti-E. coli phage cocktail (Microgen) at the dose
recommended by the manufacturer or (iii) only oral rehydration
solution (placebo) for 5 days in addition to management of dehydration
and continued feeding in accordance with WHO guidelines.

Ref.: ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00937274

Badania kliniczne w trakcie realizacji

2014-01-30

11

1.

Ś

lopek

S.,

Weber-D

ą

browska

B.,

D

ą

browski

M.,

Kucharewicz-Krukowska

A.:

Results

of

bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections in the years 1981-1986. Arch Immunol
Ther Exp 1987; 35: 569-583 (analiza 550 przypadków).

2.

Ś

lopek

S.,

Kucharewicz-Krukowska

A.

Weber-D

ą

browska

B.,

D

ą

browski

M.:

Results

of

bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. V. Evaluation of the results obtained
in children. Arch Immunol Ther Exp 1985; 33: 241-259 (analiza 114 przypadków).

3. Weber-D

ą

browska B., Mulczyk M., Górski A.: Bacteriophage therapy of bacterial infections: an

update of our Institute`s experience. Arch Immunol Ther Exp 2000; 48: 547-551 (podsumowanie
wyników leczenia 1307 przypadków).

4. Weber-D

ą

browska B., Mulczyk M., Górski A. Bacteriophages as an efficient therapy for antibiotic-

resistant septicemia in man. Transplant Proc. 2003; 35: 1385-1386 (podsumowanie wyników leczenia
94 przypadków).

HISTORIA TERAPII FAGOWEJ

Oto najwa

ż

niejsze prace podsumowuj

ą

ce wyniki leczenia z tego okresu:

W latach 80. - 90. XX wieku we współpracy z klinikami Akademii Medycznej we
Wrocławiu i innymi szpitalami preparaty bakteriofagowe przygotowywane w
Instytucie Immunologii i Terapii Do

ś

wiadczalnej PAN stosowano szeroko u

dorosłych i dzieci w leczeniu ró

ż

nych zaka

ż

e

ń

o charakterze ostrym i

przewlekłym (wywołanych głównie przez Staphylococcus, Klebsiella, Echerichia,
Pseudomonas i Proteus).

●

Terapia fagowa prowadzona jest w ramach projektu „Eksperymentalna terapia fagowa infekcji
bakteryjnych

opornych

na

antybiotykoterapi

ę

,

w

tym

zaka

ż

e

ń

MRSA”,

według

protokółu

zatwierdzonego przez komisj

ę

bioetyczn

ą

.

●

Poniewa

ż

dotychczas nie s

ą

dost

ę

pne wyniki standardowych bada

ń

klinicznych preparatów fagowych ta

forma terapii dost

ę

pna jest wył

ą

cznie w ramach eksperymentu leczniczego.

●

Jego celem jest leczenie za pomoc

ą

bakteriofagów dorosłych pacjentów z objawowym zaka

ż

eniem

bakteryjnym skóry lub tkanki podskórnej, ko

ś

ci i szpiku, stawów, przetok, ran i odle

ż

yn, dróg moczowo-

płciowych, przewodu pokarmowego, ucha

ś

rodkowego, zatok, migdałków, górnych lub dolnych dróg

oddechowych,

u

których

intensywna

antybiotykoterapia

okazała

si

ę

nieskuteczna

lub

istniej

ą

przeciwskazania do stosowania celowanych antybiotyków.

●

Leczenie prowadzone jest w trybie ambulatoryjnym.

●

Preparaty fagowe s

ą

stosowane doustnie, doodbytniczo lub miejscowo (w formie przymoczek, kompresów

nas

ą

czonych preparatem, aerozolu, kropli do nosa lub ucha, oraz do płukania gardła, pochwy, przetok i

jam ropni).

O

ś

rodek Terapii Fagowej

Centrum Medyczne Instytutu Immunologii i Terapii Do

ś

wiadczalnej PAN

ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław

Kierownik:
prof. dr hab. n. med. Andrzej Górski
e-mail: [e-mail]

Informacja/Rejestracja:

tel. [phone]

e-mail: [e-mail]

Bank fagowy IITD PAN w 2013 roku

Lp.

Rodzaj/gatunek gospodarza bakteryjnego

Liczba fagów

1.

Staphylococcus

7

2.

Enterococcus (faecalis i faecium)

73

3.

Escherichia coli

121

4.

Klebsiella (pneumoniae i oxytoca)

95

5.

Enterobacter cloacae

48

6.

Shigella (flexneri i sonnei)

39

7.

Citrobacter freundii

38

8.

Pseudomonas (aeruginosa i fluorescens)

37

9.

Salmonella (enteritidis i typhimurium)

32

10.

Stenotrophomonas maltophilia

18

11.

Serratia (marcescens i liquefaciens)

17

12.

Proteus mirabilis

17

13.

Morganella morganii

14

14.

Acinetobacter baumannii

5

15.

Burkholderia cepacia

2

Typowanie fagowe
i przygotowanie preparatu fagowego

1. Izolacja patogennego szczepu

bakteryjnego z materiału
biologicznego od pacjenta
i dostarczenie do Laboratorium
Bakteriofagowego.

2. Typowanie fagowe – dobranie swoistego

faga z dost

ę

pnej w laboratorium kolekcji tj.

takiego który najsilniej lizuje dan

ą

bakteri

ę

.

3. Przygotowanie preparatu fagowego - tzw. lizatu

fagowego - namno

ż

enie fagów efektywnych na

szczepie chorobotwórczym od pacjenta lub
szczepie laboratoryjnym, przes

ą

czenie przez filtry

bakteryjne i ampułkowanie. Preparaty najcz

ęś

ciej

stosowanych bakteriofagów przygotowywane s

ą

w

warunkach GMP w firmie BIOMED S.A. w
Krakowie.

Kategoria odpowiedzi na leczenie

Analiza ogólna

(n=153)

n

%

A – eradykacja patogenu/wyleczenie

28

18.3%

B – dobra odpowied

ź

kliniczna

13

8.5%

C – poprawa kliniczna

20

13.1%

D – w

ą

tpliwa poprawa

10

6.5%

E – przej

ś

ciowa poprawa

33

21.6%

F – brak odpowiedzi na leczenie

39

25.5%

G - pogorszenie

10

6.5%

Dobra odpowied

ź

(total A-C):

61

39.9%

Niewystarczaj

ą

ca odpowied

ź

(total D-G):

92

60.1%

Mi

ę

dzybrodzki R, Borysowski J, W eber-D

ą

browska B, Fortuna W , Letkiewicz S, Szufnarowski K, Pawełczyk Z, Rogó

ż

P, Kłak M, W ojtasik E, Górski A. Clinical aspects of phage therapy. Advances in Virus Research, 2012; 83:73-121

• 157 pacjentów zakwalifikowanych do

terapii (w 4 przypadkach brak informacji o
wyniku leczenia) w latach 2008-2010.

• 447

pacjentów

zdyskwalifikowanych

(spo

ś

ród

tych,

którzy

zgłosili

si

ę

w

analizowanym okresie czasu).

• 68 kobiet, 85 m

ęż

czyzn

• Mediana wieku: 46 lat (zakres: 20-82 lat).

• Mediana czasu trwania choroby przed

rozpocz

ę

ciem

terapii

fagowej:

43

miesi

ą

ce (zakres: 4-600 mies.)

• Mediana

skumulowanego

czasu

stosowania preparatu fagowego: 55 dni
(zakres: 3-328 dni).

• Monoinfekcje (80%, z tego 50% zaka

ż

enie

S. aureus), infekcje mieszane (20%)

Wyniki terapii fagowej w OTF w latach 2008-2010

Mi

ę

dzybrodzki R. et al. Advances in Virus Research, 2012; 83:73-121.

Szczegółowa analiza wyników terapii

Kategoria odpowiedzi na leczenie

Zaka

ż

enia

układu

moczowo-

płciowego u

m

ęż

czyzn

(n=29)

Zaka

ż

enia

układu

moczowo-

płciowego u

kobiet
(n=22)

Infekcje

tkanek

mi

ę

kkich

(n=30)

Zaka

ż

enia

skóry

(n=10)

Zaka

ż

enia

układu

kostno-

stawowego

(n=37)

Zaka

ż

enia

układu

oddechowe-

go

(n=24)

n

%

n

%

n

%

n

%

n

%

n

%

A – eradykacja patogenu/wyleczenie

11

37.9%

3

13.6%

5

16,7%

0

0.0%

7

18.9%

2

8.3%

B – dobra odpowied

ź

kliniczna

2

6.9%

0

0.0%

2

6,7%

2

20.0%

3

8.1%

3

12.5%

C – poprawa kliniczna

1

3.4%

5

22.7%

4

13,3%

1

10.0%

7

18.9%

2

8.3%

D – w

ą

tpliwa poprawa

2

6.9%

0

0.0%

2

6,7%

0

0.0%

3

8.1%

3

12.5%

E – przej

ś

ciowa poprawa

5

17.2%

4

18.2%

8

26,7%

5

50.0%

8

21.6%

3

12.5%

F – brak odpowiedzi na leczenie

8

27.6%

10

45.5%

6

20,0%

1

10.0%

7

18.9%

7

29.2%

G - pogorszenie

0

0.0%

0

0.0%

3

10,0%

1

10.0%

2

5.4%

4

16.7%

Dobra odpowied

ź

(A-C):

14

48.3%

8

36.4%

11

36,7%

3

30.0%

17

45.9%

7

29.2%

Niewystarczaj

ą

ca odpowied

ź

(D-G):

15

51.7%

14

63.6%

19

63,3%

7

70.0%

20

54.1%

17

70.8%

2014-01-30

12

• Analizowano dane pochodz

ą

ce od 37 pacjentów z zapaleniem ko

ś

ci i szpiku, zaka

ż

eniem okołoprotezowym,

zaka

ż

eniem tkanek mi

ę

kkich lub infekcj

ą

dolnych dróg oddechowych wywołanych przez S. aureus, S. epidermidis,

E. faecalis, E. coli, lub P. aeruginosa przed i w trakcie stosowania preparatów fagowych.

• Preparaty fagowe (naturalne lizaty fagowe) były podawane doustnie (10-ml trzy razy dziennie po neutralizacji soku

ż

oł

ą

dkowego za pomoc

ą

10 ml zawiesiny w

ę

glanu dihydroksysodowo-glinowego) i/lub miejscowo (dwa razy

dziennie przymoczki lub płukanie przetoki).

• Na rycinie poni

ż

ej przedstawiono

ś

rednie warto

ś

ci (±SE) st

ęż

enia CRP w surowicy, OB i liczby leukocytów we krwi

obwodowej chorych mierzone przed oraz pomi

ę

dzy 9 a 32 dniem leczenia. Ró

ż

nice analizowano za pomoc

ą

testu

Wilcoxona (n – ilo

ść

analizowanych przypadków).

Mi

ę

dzybrodzki R, Fortuna W , W eber-D

ą

browska B, Górski A. A retrospective analysis of changes in

inflammatory markers in patients treated with bacterial viruses. Clin Exp Med. 2009, 9(4): 303-312

Zmiany markerów zapalnych u pacjentów w czasie
terapii fagowej

CRP w surowicy

OB

Leukocyty we krwi

●

Chorzy: 22 m

ęż

czyzn z rozpoznanym PZBGK.

●

Czynniki patogenne izolowane z wydzieliny gr. krokowego: E. faecalis (n=16), E. coli (n=5), K. pneumoniae
(n=2), P. aeruginosa (n=1), S. haemoliticus (n=1)

●

Droga stosowania preparatów specyficznych bakteriofagów: doodbytnicza (n=20), doustna (n=5), i/lub
miejscowa na błon

ę ś

luzow

ą ż

oł

ę

dzi pr

ą

cia (n=2).

● Ś

redni czas trwania leczenia: 47 dni (22-99 dni).

Wynik: Eradykacj

ę

patogennej bakterii (potwierdzon

ą

co najmniej 2 ujemnymi wynikami posiewów wydz. gr.

krokowego wykonanymi w trakcie lub po zako

ń

czeniu terapii w odst

ę

pach nie mniejszych ni

ż

2 tyg.)

uzyskano u 50% chorych (11/22). U sze

ś

ciu chorych (6/22) eradykacj

ę

potwierdzono w jednym

posiewie. Poza tym obserwowano statystycznie istotne zmniejszenie ilo

ś

ci komórek w wydzielinie

gruczołu krokowego, zmniejszenie obj

ę

to

ś

ci gr. krokowego i wzrost maksymalnego przepływu

cewkowego (Qmax).

Wyniki zastosowania terapii fagowej u pacjentów z przewlekłym
bakteryjnym zapaleniem gruczołu krokowego (PZBGK)

Letkiewicz S., Mi

ę

dzybrodzki R., Kłak M., Weber-D

ą

browska B., Górski A. Pathogen eradication by phage therapy in patients

with chronic bacterial prostatitis (CBP).25

th

Anniversary EAU Congress,Barcelona 2010. DOI: 10.3252/pso.eu.25eau.2010

leukocyty w wydz. gr. krok. obj

ę

to

ść

gr. krokowego Qmax

p<0.05

n=6

p<0.05

n=11

p<0.05

n=9

Z ogółu 157 chorych zakwalifikowanych do terapii fagowej w OTF w latach 2008-2010
dane dotycz

ą

ce tolerancji terapii były dost

ę

pne dla 153 chorych. Ich retrospektywna

analiza wykazała,

ż

e:

- dobr

ą

tolerancj

ę

(brak skarg w zwi

ą

zku ze stosowaniem preparatów fagowych,

brak objawów niepo

żą

danych lub wyst

ę

powanie objawów niepo

żą

danych nie

powoduj

ą

cych dolegliwo

ś

ci u pacjenta) obserwowano u 77,8% chorych;

- dostateczn

ą

tolerancj

ę

(pacjent zgłaszał skargi w zwi

ą

zku ze stosowaniem

preparatów fagowych ale nie miały one charakteru działa

ń

niepo

żą

danych – np.

skar

ż

ył si

ę

na zły smak preparatu, wyst

ę

powały objawy niepo

żą

dane powoduj

ą

cych

dolegliwo

ś

ci u pacjenta) obserwowano u 18,3% chorych;

- brak tolerancji (wyst

ą

pienie objawów niepo

żą

danych o charakterze lub nasileniu

wymagaj

ą

cym przerwania terapii) obserwowano u 3,9% chorych.

BEZPIECZE

Ń

STWO TERAPII FAGOWEJ

Najcz

ę

stsze działania niepo

żą

dane

(których prawdopodobn

ą

przyczyn

ą

mogło by

ć

stosowanie preparatów fagowych)

Reakcje miejscowe (18,4% chorych) wyst

ę

powały w okolicy gdzie był stosowany preparat

fagowy (miejscowo i/lub doodbytniczo). Obejmowały one uczucie dyskomfortu przy
stosowaniu dopochwowym, zaczerwienienie, pieczenie a nawet ból, szczypanie, sw

ę

dzenie

i podra

ż

nienie skóry, wysychanie/podra

ż

nienie błon

ś

luzowych górnych dróg oddechowych,

pojawienie si

ę

b

ą

bli pokrzywkowych i p

ę

cherzyków ropnych, zaostrzenie atopowego

zapalenia skóry. W wi

ę

kszo

ś

ci przypadków dolegliwo

ś

ci były krótkotrwałe (do

kilkudziesi

ę

ciu minut) lub ust

ę

powały po kilku dniach stosowania preparatu albo jego

zamianie na inny.

Wzrost temperatury ciała (stan podgor

ą

czkowy lub gor

ą

czka bez objawów choroby

przezi

ę

bieniowej) zanotowano u 6,5% chorych, przy czym gor

ą

czka wyst

ę

powała u połowy

z nich. Z reguły wzrost temperatury ciała obserwowano po podaniu kilku pierwszych dawek
preparatu fagowego. Temperatura wracała do normy w ci

ą

gu kilku dni: samoistnie, po

podaniu leków przeciwgor

ą

czkowych lub zmianie preparatu.

Nadka

ż

enie wymagaj

ą

ce modyfikacji leczenia (przerwania terapii lub zastosowania

antybiotyków lub leków przeciwgrzybicznych) wyst

ą

piło u 4,6% chorych. Najcz

ęś

ciej

pojawiało si

ę

w przypadku miejscowego stosowania preparatów fagowych.

52 19 40 26 52 19 40 26 52

19 40 26 = n

Wpływ terapii fagowej na układ immunologiczny (1)

Górski A., Mi

ę

dzybrodzki R., Borysowski J., D

ą

browska K., Wierzbicki P., Ohams M., Korczak-Kowalska G.,

Olszowska-Zaremba N., Łusiak-Szelachowska M., Kłak M., Jo

ń

czyk E., Kaniuga E., Goła

ś

A., Purchla S.,

Weber-D

ą

browska B., Letkiewicz S., Fortuna W., Szufnarowski K., Pawełczyk Z., Rogo

ż

P., Kłosowska D.

Phage as a modulator of immune responses: practical implications for phage therapy. Adv Virus Res. 2012;
83:41-71

52 19 40 26 52 19 40 26 52

19 40 26 = n

Górski A., Mi

ę

dzybrodzki R., Borysowski J. et al.Phage as a modulator of immune responses: practical

implications for phage therapy. Adv Virus Res. 2012; 83:41-71

Wpływ terapii fagowej na układ immunologiczny (2)

Ponadto obserwowano m.in.,

ż

e wzrost fagocytozy w pierwszych 7-20 dniach terapii

fagowej był zwi

ą

zany z dobr

ą

prognoz

ą

leczenia (stopie

ń

C-A odpowiedzi na terapi

ę

).

2014-01-30

13

Inne kierunki i „cele bakteryjne”

Poszukiwanie bakteriofagów Helicobacter pylori
(Proteon Pharmaceuticals S.A.)

Badania fagów przeciwko Clostridium difficile
(

Ropp P. Treatment of Clostridium difficile infection by use of novel phage therapy. Basic

Biotechnology. 2011;7:1-5)

PhagoBioDerm™ - opatrunek zawirej

ą

cy fagi przeciwko

Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, E. coli, Proteus, oraz
antybiotyk (ciprofloksacyn

ę

),

ś

rodek miejscowo znieczulaj

ą

cy

(benzokain

ę

), chymotrypsyn

ę

i wodorow

ę

glan sodu opracowany przez

Intralytix, Inc. (USA), Instytut im. Eliavy w Tibilisi i Politechnik

ę

Gruzi

ń

sk

ą

(

Markoishvili K, Tsitlanadze G, Katsarava R, Morris JG Jr, Sulakvelidze A: A novel

sustained-release matrix based on biodegradable poly(ester amide)s and impregnated
with bacteriophages and an antibiotic shows promise in management of infected venous
stasis ulcers and other poorly healing wounds. Int J Dermatol. 2002;41:453-458)

Endolizyny

(Fischetti V. Phage factor. Interview by Brendan Borrell. Sci Am. 2012;307:80-83)