Wewnątrz jądra komórkowego:

- enzymy replikujące muszą odnajdywać miejsca

inicjacji syntezy DNA

- czynniki transkrypcyjne i polimerazy RNA –

promotory i enhancery

- czynniki splicingowe - miejsca wycinania intronów

- mRNA – pory przez które opuści jądro.

Można założyć, że czynniki te swobodnie poruszają się

w soku jądrowym, a przypadkowe spotkania z substratami

doprowadzają do zajścia pożądanych reakcji.

Alternatywny model zakłada, że RNA jest transkrybowane na

stałej „platformie” gromadzącej wszystkie enzymy

potrzebne do transkrypcji, dojrzewania RNA i jego

transportu (Wei i in. 1998). Istnieją powody do takiego

myślenia: mitochondrialny łańcuch transportu elektronów

zachodzi w takim uporządkowanym agregacie, a u bakterii

enzymy syntetyzujące DNA skupione są na wewnętrznej

powierzchni błony komórkowej.

Pytania:

Czy w jądrze istnieje rodzaj retikulum, na którym znajdują

się te enzymy?

Jeśli istnieje, czy geny aktywne transkrypcyjnie lokują się na

nim i czy są tam enzymy syntezy RNA?

jądro komórkowe jest wysoce uporządkowaną

dynamiczną strukturą

chromosomy zajmują określone terytoria

chromosomowe

białka biorące udział w replikacji

bądź transkrypcji grupują się

razem w

jądrowe fabryki

kopiujące DNA bądź

transkrybujące geny

w przestrzeniach pomiędzy

chromosomami znajdują się

miejsca przechowywania białek

biorących udział w dojrzewaniu

RNA

dynamiczna struktura, zwana

macierzą jądrową (NM ang.

nuclear matrix), aranżuje

organizację jądrowego DNA

i rozmieszczenie fabryk

białkowych w przestrzeni jądra

NM jest strukturą widoczną albo po ekstrakcji solnej jąder

trawionych nukleazą albo elektroforetycznym usunięciu

z jąder fragmentów chromatyny w fizjologicznych

warunkach jonowych

NM jest dynamicznym strukturalnym zrębem jądra złożonym

z sieci włókien RNAP połączonych z białkami laminy

(Capco et al., 1982) pow. 47 000

włókna chromatynowe są zorganizowane w pętlowe

domeny

geny aktywne transkrypcyjnie znajdują się w pętlach

chromatyny wrażliwych na DNazę I, dostępnych dla

czynników transkrypcyjnych i maszynerii

transkrypcyjnej

geny nieaktywne są w bardziej zaplecionych obszarach

chromatynowych

u podstaw pętli znajdują się sekwencje DNA zwane

S/MARami (ang. scaffold/matrix attachment

regions), które wiążą się z białkami NM

a:

CT mają kompleksowo

ufałdowane powierzchnie –

olbrzymia pętla z kilkoma

aktywnymi genami

wystaje

z powierzchni CT

do

przestrzeni IC

model funkcjonalnej architektury jądrowej zawierającej

terytoria

chromosomowe CT (ang. chromosome-territory)

i

przestrzenie

międzychromosomowe IC (ang. interchromatin compartment)

b: CT zawierają oddzielne

domeny dla ramion

p

i

q

chromosomów i

centromerów

;

geny aktywnie transkrybowane

są w pętli odległej od hetero-

chromatyny centromerowej,

a umieszczenie tych genów

w heterochromatynie powoduje

ich wyciszenie

c: CT mają różną gęstość

chromatyny:

wysoką

lub

niską;

luźna

chromatyna wychodzi

do IC,

gęsta

jest z dala od IC

model funkcjonalnej architektury jądrowej zawierającej

CT

(ang. chromosome-territory) i

IC

(ang. interchromatin compartment)

e: wyższorzędową strukturę

chromatyny stanowi hierarchia

włókien chromatynowych;

geny aktywne

znajdują się na

powierzchni ufałdowanych

włókien,

geny wyciszone

mogą być

wewnątrz struktur

chromatynowych

d: CT z 1 Mb domenami

wcześnie

i

późno

replikującymi;

chromatyna

uboga w geny

lokuje się na obrzeżu jądra

blisko

laminy

, jej wpukleń

i wokół jąderka,

bogata w

geny

- lokuje się pomiędzy

przedziałami ubogimi w geny

f: model zakłada, że IC

zawiera

kompleksy

(pomarań-

czowe kropki)

i większe nie-

chromatynowe domeny

(skupienia pomarańczowych

kropek)

transkrypcyjne,

splicingowe, replikacyjne i

naprawy DNA

g: CT z 1-Mb

domenami chro-

matynowymi

i IC pomiędzy nimi,

najmniejsze rozgałęzienia IC

kończą się między 100-kb

domenami chromatyny,

geny

aktywne

są na powierzchni tych

domen,

geny wyciszone

wewnątrz nich, alternatywnie

zamknięte 100-kb domeny

z wyciszonymi genami zmieniają

konfigurację na otwartą przed

aktywacją transkrypcyjną

model funkcjonalnej architektury jądrowej zawierającej

CT

(ang. chromosome-territory) i

IC

(ang. interchromatin compartment)

Terytoria chromosomowe

dwa

jasne terytoria 11p

leżą pod powierzchnią jądra,

użycie krótszej sondy odpowiadającej subtelomerowemu

regionowi

11ptel

zawierającemu wyłącznie aktywne geny np.

IGF2

daje sygnał poza terytorium 11p

(A) ludzkie limfocyty (B) ludzkie fibroblasty

Cremer & Cremer, 2001

Mahy i in. 2002 J Cell Biol 159: 753-763

Hipotetyczny model

organizacji interfazowej

chromatyny, pokazujący NM

jako sieć wewnętrznych

kanałów

(Razin i Gromova, 1995.)

Jądra komórkowe erytrocytów potraktowano

DNazą I - wprowadza to 1-niciowe nacięcia w

regiony chromatyny zawierające aktywne geny.

Nacięcia „naprawiono” wewnątrz jądra przy

użyciu metody „nick translation” w obecności

fluorescencyjnie znakowanych nukleotydów.

Fluorescencja pojawiła się pod powierzchnią

jądra i wzdłuż struktur prowadzących od

otoczki jądrowej w głąb jądra.

(Hutchinson i Weintraub, 1985 )

Wyższorzędowa struktura genomu

sama natura oddziaływań promotor–enhancer nie zapewnia

przestrzennej i czasowej specyficzności ekspresji genów

specyficzność ustanawia chromatyna – podział na domeny

transkrypcja ze specyficznego promotora jest wynikiem

aktywacji tylko poprzez enhancery położone w tej samej

domenie chromatynowej

http://140.116.60.1/mdlai/Handout/chromatin-domain-99/sld001.htm

Hipotetyczny region zawierający dwa geny

tkankowo specyficzne i jeden gen

metabolizmu podstawowego (ang.

housekeeping gene). Gen X (eksony

niebieskie) ulega ekspresji w tkankach

oczu, gen Y (e. fioletowe) w mózgu, gen Z

(e. zielone) w każdej tkance. Tkankowo

specyficzna aktywność transkrypcyjna

zależy od utworzenia takiego centrum

aktywnej chromatyny ACH, która obejmuje

tkankowo specyficzne elementy

cis ze

związanymi kompleksami czynników i

umożliwia wybiórczą interakcję z

promotorem danego genu. Utworzenie ACH

zapewnia lokalne wysokie nagromadzenie

czynników transkrypcyjnych i czynników

pozytywnie modelujących chromatynę.

Aktywność genu metabolizmu

podstawowego nie wymaga tworzenia ACH.

Kleinjan DA, van Heyningen V 2005 Am J Hum Genet 76: 8–32.

Model współistnienia w tym samym rejonie genomu

fizycznie zachodzących, ale niezależnie regulowanych genów

Domeny chromatynowe i elementy graniczne

transformacja egzogennego DNA do komórek linii hodowlanych

lub transgeniczne zwierzęta służą do identyfikacji elementów

cis

, które zapewniają aktywację transkrypcyjną niezależnie od

miejsca integracji w genomie

zidentyfikowano 2 typy takich sekwencji:

LCR

y (ang. Locus Control Region) definiują aktywne domeny

ekspresji genowej w sposób dominujący i są wymagane do

tkankowo specyficznie regulowanej transkrypcji wielu

genów u kręgowców

elementy graniczne/izolatory

(ang. insulator) to sekwencje,

które zapewniają transkrypcję niezależną od pozycji

poprzez izolowanie ekspresji genu od sekwencji sąsiednich

izolatory buforują ekspresję genu od

represji/wyciszającego wpływu przyległej

heterochromatyny

En – enhancer

Prm – promotor

Ins - izolator

Efekt polarny izolatorów

na oddziaływania promotor-enhancer

Inne (niż dostępność czynników transkrypcyjnych)

mechanizmy regulacji transkrypcji mogące powodować

otwieranie lub represję całych regionów DNA:

* regulacja transkrypcji poprzez przyczepienie

DNA do macierzy jądrowej

* buforowanie przez izolatory
* heterochromatynizacja/remodelowanie chromatyny
* współzawodnictwo enhancerów w LCRach

Jeden ze sposobów wykrywania udostępniania DNA dla czyn-

ników transkrypcyjnych (co oznacza brak blokowania przez

upakowanie i/lub nukleosomy) jest badanie wrażliwości na

DNazę I.

Brown TA Genomy 2009 PWN

otrzymywanie macierzy jądrowej (NM) - ekstrakcja jąder

komórkowych za pomocą:

* LIS (

ang. lithium-3’,5’ diiodosalicylate – łagodny detergent

) lub

* TRITON X-100 + 1 M NaCl (

detergent+wysokie stężenie soli

)

S/MARy (ang. Scaffold/Matrix Attachment Region)

sekwencje DNA o dużym powinowactwie wiązania NM; zwykle zawierają

70% par A+T; co najmniej 200pz; zakotwiczają pętle chromatyny w NM

białka wiążące S/MARy:

gr.I wiążą kooperatywnie (topoizomeraza II, laminy, hnRNP, histon H1)

gr.II rozpoznają specyficzne sekwencje (np. ARBP ang. attachment

region binding protein)

gr.III rozpoznają regiony niesparowanych zasad w S/MARach

(np. STAB1 i nukleolina)

gr.IV wiążące DNA w sposób podobny do distamycyny – wiążą rowek

mniejszy sekwencji oligoA-oligoT (HMGI/Y ang. high mobility group

protein)

w genie lizozymu rolę izolatora pełni

sekwencja

SAR A

•

W przejściowej transfekcji (transgen na

plazmidzie) miejsce

SAR A

ulokowane po

obu stronach nie zwiększa ekspresji genu

CAT kierowanej przez sam

pr

omotor ani

pr

omotor-

e

nhancer, jednakże interferuje

we wzajemna interakcję

pr

omotora i

e

nhancera, gdy znajduje się pomiędzy nimi

CAT act.

---

A

---

Pr

CAT-

A

5%

---

E

---

Pr

CAT---- 100%

A

-

E

---

Pr

CAT-

A

-

112%

E

-

A

---

Pr

CAT----

29%

E

------

Pr

CAT----

67%

• W transfekcji stabilnej (transgen zintegrowany z genomem) miejsce

SAR A

zapewnia ekspresję niezależną od miejsca integracji, a poziom

ekspresji odpowiada liczbie zintegrowanych kopii. Bez

SAR A

poziom

ekspresji transgenu zależy od sekwencji flankujących miejsce

integracji.

• SAR A

pełni rolę elementu granicznego dla funkcji enhancera.

(a) komórki, w których locus β-globiny jest wyciszony – uważa się, że

w hamowaniu ekspresji bierze udział przyczepienie regionu

LCR/5'HS do NM, oddzielenie i wyciszenie tego locus wzmacnia

przyczepienie dwu innych regionów pomiędzy LCRem a genem

β-globiny

(b) komórki z ekspresją genów

ε γ

G

γ

A

– w odpowiedzi na sygnał

wyzwalający ich dojrzewanie uwalniane są z NM regiony

pomiędzy LCRem a genem β-globiny uprzednio związane z NM,

a domena chromatynowa ulega remodelowaniu.

MARy a regulacja

locus β-globiny

locus β-globiny składa się

z genów 5‘ ε γ

G

γ

A

δ β 3’,

które ulegają ekspresji

w sposób rozwojowo

i komórkowo zależny

NM a nowotwory

Białka NM służą jako markery do odróżniania komórek

normalnych i nowotworowych.

Wykazano, że białka NM można wykryć w surowicy i moczu pacjentów

nowotworowych.

W metastatycznych komórkach mysich transformowanych onkogenem

obserwowano duże zmiany kształtu jądra skorelowane ze zmianami

w białkach NM.

NM i czynniki transkrypcyjne

Czynniki transkrypcyjne są zasocjowane z NM.

Uważa się, że NM rekrutuje czynniki transkrypcyjne ułatwiając ich

oddziaływanie z elementami regulatorowymi.

W linii komórek raka sutka MCF-7 receptor estrogenu (czynnik

transkrypcyjny istotny dla ich hormono-zależnej proliferacji)

oraz HET/SAF-B, białko wiążące MAR będące represorem genu

hsp27, są związane

in situ

z sekwencją MAR.

Czynniki transkrypcyjne związane z NM

in situ

związane są też

z MARami, a NM nie jest po prostu magazynem nieaktywnych

czynników/kofaktorów.

http://www.umanitoba.ca/institutes/manitoba_institute_cell_biology/MICB/davie_jim_2.htm

NM a acetylacja histonów

Dynamicznie acetylowane histony są powiązane z

transkrypcyjnie aktywnym DNA. W kurzych komórkach

erytroidalnych najbardziej dynamicznie acetylowane

histony są związane z chromatyną, która prawdopodobnie

jest przyczepiona do NM.

Enzymy katalizujące

acetylację HAT

i

deacetylację HDAC

histonów są związane z NM.

Tylko regiony aktywnie

transkrybowanej chromatyny

są związane z NM poprzez

wiele dynamicznych miejsc

wiązania zapewne dzięki

HAT i HDAC.

http://www.umanitoba.ca/institutes/manitoba_institute_cell_biology/MICB/davie_jim_2.htm

Traktowanie cisplatyną ludzkiej linii komórek raka sutka

sprzęga HDAC1 (enzym deacetylujący histony) z sekwencjami

MAR, co sugeruje, że HDAC1 jest związany z MAR przy

podstawie pętli.

W kurzych erytrocytach, dynamicznie acetylowane histony H3 i H4 są

selektywnie metylowane. Metylacja nie jest zależna od właśnie

zachodzącej acetylacji i

vice versa

. Można przypuszczać, że enzymy

HAT, HDAC i HMT kolokalizują w przestrzeni jądrowej.

http://www.umanitoba.ca/institutes/manitoba_institute_cell_biology/MICB/davie_jim_2.htm