SEKWENCJONOWANIE

ANALIZY MOLEKULARNE

ANALIZY MOLEKULARNE

pozwalają na wykrycie osób

pozwalają na wykrycie osób

z wysokim ryzykiem

z wysokim ryzykiem

zachorowania na nowotwory

zachorowania na nowotwory

(bezobjawych nosicieli

(bezobjawych nosicieli

mutacji), co umożliwia

mutacji), co umożliwia

skuteczną i tańszą

skuteczną i tańszą

profilaktykę.

profilaktykę.

G.K.

W czasie średniego życia
człowieka ma miejsce 10

17

podziałów komórkowych.

Każdy wymaga wprowadzenia
we właściwe miejsce 6x10

9

nukleotydów

10

17

x 6x10

9

= 6x10

26

- okazji

do błędów

600000000000000000000
000000

W czasie średniego życia
człowieka ma miejsce 10

17

podziałów komórkowych.

Każdy wymaga wprowadzenia
we właściwe miejsce 6x10

9

nukleotydów

10

17

x 6x10

9

= 6x10

26

- okazji

do błędów

600000000000000000000
000000

POZIOMY

WYKRYWANIA

MUTACJI

1. DNA

2. RNA

3. BIAŁKO

BADANIE DNA

IZOLACJA DNA

PCR

SEKWENCJONOWANIE

METODY PRZESIEWOWE

SEKWENCJONOWANIE

Technika

bezpośredniego

wykrywania małych mutacji:

- substytucji
- małych insercji
- małych delecji

SEKWENCJONOWANIE

Wykrywa blisko 100% mutacji w

obrębie analizowanego produktu

(występowanie zanieczyszczeń

może obniżyć

jakość tej

metody).

CHEMICZNA METODA

MAXAMA-GILBERTA

1.

W metodzie tej fragment DNA poddany

sekwencjonowaniu musi być znakowany na
jednym końcu, co zwykle uzyskuje się przez
przyłączenie:
- albo radioaktywnego fosforanu do końca
5’ lub 3’
cząsteczki
- albo radioaktywnego nukleotydu do końca
3’

2.

Znakowany DNA poddaje się reakcjom

zrywania w miejscach występowania
określonych zasad

3.

Uzyskane fragmenty rozdziela się na żelu

metodą eletroforezy

METODA SANGERA

W metodzie tej stosuje się cztery specyficzne
dideoksynukleotydy

(ddNTP)

do zatrzymania

enzymatycznej

syntezy

kopii

matrycy.

Starter sekwencyjny przyłącza się do
jednoniciowej matrycy i polimeraza DNA
wykorzystując

dNTP

wydłuża

starter.Uzyskane produkty reakcji PCR
rozdziela się elektroforetycznie na żelu
poliakrylamidowym

ANALOG 2’,3’ - ddNTP

P P

P

OCH

2

H

O

ZASADA

H

H

H

AUTOMATYCZNE

SEKWENCJONOWANIE

Znaczny postęp w technologii
sekwencjonowania osiągnięto
poprzez wprowadzenie
automatycznych aparatów do
sekwencjonowania, których
funkcjonowanie oparte jest na
fluorescencji wzbudzonej laserem.
Każdy z dNTP (ACTG) jest
wyznakowany innym fluorochromem

G.K.

Rys.1a Zasada SSCP

----

A

----A

A

----AA

T

----AAT

G

----AATG

C

----AATGC

G

----AATGCG

C

----AATGCGCT

A

----AATGCGC

T

----AATGCGCTA

T

----AATGCGCTAT

G

----AATGCGCTATG

T

----AATGCGCTATGT

T

----AATGCGCTATGTT

C

----AATGCGCTATGTTC

T

----AATGCGCTATGTTCT

A

----AATGCGCTATGTTCTA

T

----TTACGCGATACAAGATAA--------

matryca

produkty

----AATGCGCTATGTTCTAT

T

-

+

Idea sekwencjonowania

Porównanie sekwencji badanej -fragmentu
eksonu 18 hMLH1 do sekwencji z bazy danych

-”U07343 Gene Bank”

sekwencja badana

zgodność sekwencji

sekwencja wzorcową

chromatogram

sekwencji badanej

z mutacją

obraz żelu

odpowiadający

sekwencji

z mutacjà

Obraz żelu sekwencyjnego odpowiadający
wykrytej zmianie w obrębie eksonu 18 genu
MLH1

ETAPY

SEKWENCJONOWANIA

PCR preparatywny -

namnożenie wybranego

fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych
starterów

Oczyszczenie

PCR

preparatywnego

na

selektywnych filtrach

PCR asymetryczny -

z jednym ze starterów z

zastosowaniem dideoksynykleotydów

Elektroforeza

na denaturującym żelu

poliakrylamidowym z równoczesną detekcją
i rejestracją przepływających produktów

Analiza

wyników przy użyciu pakietu programów

komputerowych

ETAPY

SEKWENCJONOWANIA

PCR preparatywny -

namnożenie wybranego

fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych
starterów

PCR

(POLYMERASE CHAIN

REACTION)

SKŁAD MIESZANINY REAKCYJNEJ:

- matryca DNA
- polimeraza termostabilna
- para specyficznych starterów
(primers)
- trójfosforany deoksyrybonukleotydów
(dNTP)
- bufor (zawierający Mg

2+

)

- H

2

O

ETAPY CYKLU PCR

1. DENATURACJA

podwójnej nici DNA - 92-94

o

C

2. PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW

~ 60

o

C

3. ELONGACJA

- 72

o

C

ILOŚĆ KOPII DNA = 2

n

n - ilość cykli

G.K.

Prnciple of a Polymerase Chain Reaction (PCR )

5’

3’

separation of strands

and primer attachment

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

primer elongation

separation of strands

and primer attachment

(1. cycle)

(2.

cycle etc.)

Primer 1

Primer 2

complementary to primer 2

complementary to primer 1

amplification of target sequence

ETAPY

SEKWENCJONOWANIA

PCR preparatywny -

namnożenie wybranego

fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych
starterów

Oczyszczenie

PCR

preparatywnego

na

selektywnych filtrach

PCR asymetryczny/sekwencyjny -

z jednym ze

starterów z zastosowaniem dideoksynykleotydów

SKŁAD MIESZANINY

REAKCYJNEJ

PCR SEKWENCYJNEGO

- oczyszczona matryca w postaci PCR preparatywnego
- jeden starter
- Mieszanina deoksyrybonukleotydów (dNTP) i
fluorescencyjnych dideoksyrybonukleotydów (ddNTP)
- polimeraza
- bufor
- woda

MUTACJA

-

zmiana

sekwencji

DNA

powodująca uszkodzenie
struktury i funkcji białka

POLIMORFIZM

- zmiana

sekwencji

DNA

nie

powodująca uszkodzenia
struktury i funkcji białka

BADANA SEKWENCJA

DNA

• 5’ACTGCCGTACGACATGCATGCATGA3’

TACGTACT

• ACTGCCGTA
• 3’TGACGGCATGCTGTACGTACGTACT5’