UNIWERSYTET PRZYRODNICZY

Wydział Medycyny Weterynaryjnej

KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT

Zakład Biochemii

20-033 Lublin, ul. Akademicka 12

tel. [phone]

09-02-18 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.18.02.18

- 1 z 3 -

Wła

ś

ciwo

ś

ci fizykochemiczne białek

Zadanie 1. Oznaczanie punktu izoelektrycznego białka

Celem zadania jest oznaczenie punktu izoelektrycznego kazeiny na

podstawie jej zachowania w roztworach o ró

ż

nym pH.

Wykonanie. Do 6 probówek odmierzy

ć

podane w tabeli obj

ę

to

ś

ci

mianowanych roztworów CH

3

COOH i wody destylowanej, tworz

ą

c tym samym

ró

ż

ne

ś

rodowiska reakcji. Nast

ę

pnie do ka

ż

dej probówki dodawa

ć

kroplami

po 1 cm

3

0,5% roztwór kazeiny w 0,1 mol/dm

3

CH

3

COONa. Po dodaniu ka

ż

dej

kropli wstrz

ą

sn

ąć

probówk

ą

. Odstawi

ć

zawarto

ść

probówek na 30 min i po

tym czasie zaobserwowa

ć

zmiany zm

ę

tnienia roztworów. Wyniki zanotowa

ć

w

tabeli: brak zm

ę

tnienia (-) lub ró

ż

ne stopnie zm

ę

tnienia (+,++,+++).

Obliczy

ć

pH w ka

ż

dej probówce, posługuj

ą

c si

ę

równaniem Hendersona –

Hasselbalcha.

W jakim pH zm

ę

tnienie jest najwi

ę

ksze? Ile wynosi warto

ść

punktu

izoelektrycznego dla kazeiny?

Nr probówki

Składnik, cm

3

1

2

3

4

5

6

0,01 mol/dm

3

CH

3

COOH

0,6

1,3

-

-

-

-

0,1 mol/dm

3

CH

3

COOH

-

-

0,3

1

8

-

1 mol/dm

3

CH

3

COOH

-

-

-

-

-

1,6

H

2

O

8,4

7,7

8,7

8

1

7,4

0,5% kazeina

1

1

1

1

1

1

Zm

ę

tnienie

pH

Zadanie 2. Wysalanie albumin i globulin

Celem zadania jest rozdzielenie mieszaniny białek surowicy poprzez

proces

wysalania,

który

wykorzystuje

wła

ś

ciwo

ś

ci

chemiczne

poszczególnych białek.

Wykonanie. Do 5 cm

3

surowicy doda

ć

równ

ą

obj

ę

to

ść

nasyconego

roztworu (NH

4

)

2

SO

4

. Po wytr

ą

ceniu kłaczkowatego osadu globulin roztwór

przes

ą

czy

ć

. Do supernatantu dodawa

ć

(NH

4

)

2

SO

4

in substantia porcjami i

miesza

ć

a

ż

do momentu, w którym na dnie probówki pozostan

ą

kryształki

nierozpuszczonego (NH

4

)

2

SO

4.

Wytr

ą

ca si

ę

wówczas osad albumin. Po

ods

ą

czeniu zbada

ć

rozpuszczalno

ść

osadu w H

2

O. Przes

ą

cz skontrolowa

ć

na

UNIWERSYTET PRZYRODNICZY

Wydział Medycyny Weterynaryjnej

KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT

Zakład Biochemii

20-033 Lublin, ul. Akademicka 12

tel. [phone]

09-02-18 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.18.02.18

- 2 z 3 -

obecno

ść

białka prób

ą

str

ą

ceniow

ą

z kwasem trichlorooctowym (TCA) lub

sulfosalicylowym.

Zadanie 3. Str

ą

canie białek kwasami nieorganicznymi i organicznymi

Celem

zadania

jest

obserwacja

działania

st

ęż

onych

kwasów

nieorganicznych oraz niektórych organicznych na białko. W reakcjach
tych mo

ż

e dochodzi

ć

do denaturacji białka.

Wykonanie. Do 3 probówek odmierzy

ć

po 1 cm

3

1% roztworu białka

jaja. Nast

ę

pnie do 1, 2 i 3 probówki wprowadzi

ć

odpowiednio po 0,5 cm

3

st

ęż

onego HCl, HNO

3

, i H

2

SO

4

. Zawarto

ść

ka

ż

dej probówki wstrz

ą

sn

ąć

. W

probówce z HCl i H

2

SO

4

osad zdenaturowanego białka rozpuszcza si

ę

(sole

białek z tymi kwasami silnie dysocjuj

ą

). Natomiast w probówce z HNO

3

osad nie znika po wstrz

ąś

ni

ę

ciu.

Do 2 innych probówek odmierzy

ć

po 2 cm

3

1% roztworu białka jaja.

Nast

ę

pnie do 1 probówki wprowadzi

ć

kroplami 5% roztwór kwasu TCA, a do

2 probówki – 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego. Wytr

ą

ca si

ę

biały

osad.

Kwas

sulfosalicylowy

i

TCA

tworz

ą

z

białkami

sole

nierozpuszczalne

i

dlatego

s

ą

stosowane

do

odbiałczania

płynów

biologicznych. Zwi

ą

zki te w wi

ę

kszych st

ęż

eniach wywołuj

ą

denaturacj

ę

białka.

Zadanie 4. Str

ą

canie białek kationami metali ci

ęż

kich

Celem zadania jest obserwacja działania soli metali ci

ęż

kich (Cu,

Hg, Pb) na białko w zale

ż

no

ś

ci od pH.

Do 3 probówek odmierzy

ć

po 2 cm

3

1% roztworu białka o pH = 3 i do

3 kolejnych tego samego białka o pH = 8. Nast

ę

pnie do ka

ż

dej z probówek

kolejno dodawa

ć

wymienione w tabeli odczynniki. Zanotowa

ć

powstanie (+)

lub

brak

(-)

osadu.

Wyja

ś

ni

ć

wyniki

reakcji

w

poszczególnych

probówkach, uwzgl

ę

dniaj

ą

c

ś

rodowisko oraz zjonizowanie odpowiednich

grup.

Białko jaja

Odczynnik

pH 3

pH 8

10% CuSO

4

5% HgCl

2

5%

(CH

3

COO)

2

Pb

UNIWERSYTET PRZYRODNICZY

Wydział Medycyny Weterynaryjnej

KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT

Zakład Biochemii

20-033 Lublin, ul. Akademicka 12

tel. [phone]

09-02-18 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.18.02.18

- 3 z 3 -

Zadanie 5. Ilo

ś

ciowe oznaczenia białka w badanej próbie

Celem zadania jest ilo

ś

ciowe oznaczenia zawarto

ś

ci białka w

badanej próbie metod

ą

biuretow

ą

na podstawie przygotowanej wcze

ś

niej

krzywej kalibracyjnej.

Wykonanie. Odmierzy

ć

1 cm

3

otrzymanego roztworu białka, doda

ć

4 cm

3

odczynnika miedziowego. Po 20-25 min mierzy

ć

absorbancj

ę

przy długo

ś

ci

fali 545 nm.

Na podstawie krzywej kalibracyjnej wyznaczy

ć

st

ęż

enie procentowe

białka w otrzymanym roztworze.

Uwaga! Wykorzysta

ć

krzyw

ą

kalibracyjn

ą

przygotowan

ą

na poprzednich

ć

wiczeniach.

Próba

Absorbancja
przy 545 nm

St

ęż

enie białka

[%]

1

2

Ś

rednia

-