1

ZAKŁAD BIOCHEMII

ENZYMOLOGIA

Biochemia i Biotechnologia

UMCS

(KP/KR)

2012

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH – II

Ćwicz. 3

Wyznaczanie stałych kinetycznych (V

max

i K

M

)

Celem badań kinetyki reakcji enzymatycznych jest uzyskanie informacji o ich

przebiegu w czasie, a więc o szybkości zaniku substratów i powstawania produktów.
Wyznaczone stałe kinetyczne pozwalają na wnioskowanie o liczbie i kolejności przyłączania
cząsteczek substratu do enzymu i odłączania cząsteczek produktów z kompleksu aktywnego,
o liczbie kompleksów pośrednich i izomeryzujących form enzymu oraz o efektach działania
inhibitorów lub aktywatorów.

Badania te prowadzą do stworzenia modelu kinetycznego, będącego zbiorem

wyrażeń matematycznych pozwalających przewidywać efekt działania enzymu w obecności
określonego stężenia substratu, z jednoczesnym uwzględnieniem ilościowego udziału
wszystkich etapów reakcji enzymatycznej.

Najstarszy model kinetyczny dla ilościowego opisu nieodwracalnej reakcji

enzymatycznej z jednym substratem, przebiegającej według schematu:

2

1

k

1

E

S

ES

E

P












przedstawili Leonor Michaelis i Maud Menten (1913).

Podstawy teorii Michaelisa–Menten są następujące:

1. Główne założenie:

Istnieje szybko ustalający się stan równowagi reakcji:

1

1

E

S

(ES)






który nie jest zaburzony przez dużo powolniejszy rozpad kompleksu (ES) na enzym
i produkt:

P

E

(ES)

2

k











2

2. Maksymalna szybkość reakcji: V

max

= k

+2

[E]

0

3. Stała K:

1

1

-

S

k

k

K





K

S

jest stałą dysocjacji kompleksu przejściowego (tzw. stała substratowa)

-1

2

2

M

S

1

1

k

k

k

K

K

k

k

















K

M

jest stałą Michaelisa (wyprowadzoną przez Briggsa i Haldane’a), jej wartość liczbowa

odpowiada takiemu stężeniu substratu, przy którym początkowa szybkość reakcji równa jest
połowie szybkości maksymalnej.


4. Warunek równoważności K

M



K

S

Równoważność stałych K

M

i K

S

występuje bardzo często w reakcjach enzymatycznych,

ponieważ kompleks przejściowy tworzy się przy udziale słabych oddziaływań
drugorzędowych, natomiast rozpad kompleksu na produkty i enzym wymaga przegrupowań
atomowych i rozerwania lub syntezy wiązań kowalencyjnych.
Wtedy k

-1

> k

+2

5. Warunek nierównoważności K

M



K

S

Utworzenie kompleksu przejściowego wymaga utworzenia wiązań kowalencyjnych, wtedy
k

-1

≤ k

+2

Zależność początkowej szybkości reakcji enzymatycznej w stanie stacjonarnym

(warunek d[ES]/dt = 0) od początkowego stężenia substratu jest określona równaniem:

 

 

max

0

0

M

0

V

S

v

K

S





v

0

– początkowa szybkość reakcji

V

max

– maksymalna szybkość reakcji

[S]

0

– początkowe stężenie substratu

K

M

– stała Michaelisa

3

Występujące w podanym powyżej równaniu hiperbolicznej kinetyki stacjonarnej

stałe kinetyczne K

M

i V

max

można wyznaczyć przez graficzne dopasowanie hiperboli do

doświadczalnych wartości v

0

i [S]

0

, ale postępowanie takie obarczone jest dużym błędem.

Istnieje kilka przekształconych form równania Michaelisa-Menten dających prostoliniową
zależność obu zmiennych. Najczęściej stosowaną metodą linearyzaji krzywej hiperbolicznej
jest metoda Lineweavera-Burke’a, która określa zależność 1/v

0

od 1/[S]

0

zgodnie

z równaniem:

 

M

0

max

max

0

K

1

1

1

v

V

V

S







Wykonanie ćwiczenia

Przygotować probówki zawierające po 3 ml następujących roztworów sacharozy

w 0,1 M buforze octanowym o pH 4,7:

0,2 M;

0,1 M;

0,05 M;

0,025 M

Do każdej probówki dodać po 3 ml roztworu rozcieńczonego preparatu enzymatycznego,
zawierającego inwertazę (o optymalnym stężeniu, wyznaczonym na poprzednich ćwiczeniach
– ćwicz. 2).

Natychmiast po wymieszaniu (próby odczynnikowe), a następnie dokładnie po 5, 10,

15 i 30 min. pobierać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do odpowiednio oznakowanych
probówek zawierających po 4 ml 0,1 M buforu glicynowego o pH 10 (w celu zatrzymania
reakcji enzymatycznej).

Dalszy tok postępowania jest zgodny z procedurą podaną przy wyznaczaniu

optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (ćwicz. 2).

Z krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie (μg/ml) monosacharydów uwolnionych

podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy, a następnie obliczyć ilość powstałych
produktów uwzględniając rozcieńczenie mieszaniny inkubacyjnej (30



):

Ilość produktu (μg) = A

520

× f (

μg/ml) × 1 ml × 30

Dla każdego stężenia substratu sporządzić krzywą progresji - wykres zależności

ilości produktu (mg) od czasu reakcji (min.) i wyznaczyć szybkość początkową reakcji.

Szybkość początkowa reakcji v

0

to tg α, nachylenie stycznej do krzywej progresji

w punkcie odpowiadającym stężeniu produktu w czasie t = 0 min., przechodzącej zawsze
przez początek układu współrzędnych.

4

Stężenie początkowe
substratu [S]

0

Ilość produktu (mg)

w zależności od czasu

Szybkość początkowa

(mg/min)

v

0

= tg α

5 min

10 min

15 min

30 min

0,2 M

0,1 M

0,05 M

0,025 M

Na podstawie szybkości początkowych wyznaczonych dla każdego stężenia

substratu wykreślić zależność tych szybkości od stężenia początkowego substratu (krzywą
Michaelisa-Menten).

Sporządzić wykres dla równania Lineweavera-Burke’a, wyznaczyć stałą Michaelisa

(K

M

) i szybkość maksymalną reakcji (V

max

).

Odczynniki

1. 0,1 M bufor octanowy (octan sodu – kwas octowy) o pH 4,7
2. 0,2 M roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7
3. 0,1 M bufor glicynowy (glicyna – NaOH) o pH 10
4. Odczynnik Somogyi I

288 g Na

2

SO

4

(bezw.) rozpuścić w 1l H

2

O dest. Dodać 24 g soli Rochelle’a

(winian sodowo potasowy), 48 g Na

2

CO

3

, 32 g NaHCO

3

. Roztwór rozcieńczyć

do 1600 ml gotowaną H

2

O dest. i przechowywać w temp. 27

O

C.

5. Odczynnik Somogyi II

72 g Na

2

SO

4

(bezw.) rozpuścić w 300 ml wrzącej H

2

O dest. Dodać 8 g

CuSO

4

×H

2

O. Roztwór rozcieńczyć do 400 ml gotowaną H

2

O dest. i

przechowywać w temp. 27

O

C.

6. Mieszaninę odczynników Somogyi I i Somogyi II (stosunku 4:1) przygotowują

studenci bezpośrednio przed użyciem.

7. Odczynnik Nelsona

100 g molibdenianu amonu rozpuścić w 1,8 l H

2

O dest. Dodać 84 ml stęż.

H

2

SO

4

i roztwór arsenianu sodu (12 g Na

2

H-arsenian w 100 ml H

2

O).

Odczynnik przechowywać w ciemnej butelce szklanej przez 24-48 godz.
w temp. 37

O

C, potem w pokojowej.

Sprzęt

1. łaźnia wodna (100

o

C)

2. micro-shaker (wytrząsarka)
3. spektrofotometr
4. stoper
5. probówki ze szczelnymi korkami

6. probówki krótkie
7. pipety automatyczne
8. cylindry miarowe, zlewki, kolbki

(poj. 50, 100, 250 ml)