1

Ćwiczenie 2

Temat: Fizjologia bakterii

Demonstracja i omówienie:

1. Podłoża bakteriologiczne wykorzystywane w rutynowym badaniu mikrobiologicznym.

2. Posiew izolacyjny na podłoże stałe i posiew na podłoże płynne.

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Zadanie 1.

Wykonanie posiewu izolacyjnego bakterii na podłożu stałym

Cel: Zapoznanie się z technikami izolacji drobnoustrojów w laboratoriach mikrobiologicznych

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (dotyczy zadań 1A, 1B) i 6-osobowych (1C)

Posiew izolacyjny bakterii

1) Pobrać jałową ezą bakterie (1 oczko ezy)

2) Nanosić bakterie na podłoże według załączonego schematu

Uwaga! W sektorach B, C i D wykonywać posiewy wyłącznie jałową, ostudzoną ezą!

3) Po wykonaniu zadania opalić ezę nad płomieniem palnika i odłożyć do statywu

Schemat:

Obróć płytkę o 90°

Obróć płytkę o 90°

Obróć płytkę o 90°

Opal ezę

Opal
ezę

2

1A. Cel: Badanie wymagań odżywczych bakterii

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa wykonuje posiew izolacyjny 1 hodowli

bakteryjnej)

Materiał:

24-48 godz. hodowle drobnoustrojów na podłożu krwawym (Streptococcus sp.,

Neisseriae sp., Staphylococcus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Bacillus sp.)

płytki z podłożem wzbogaconym (agar krwawy)

płytki z podłożem zwykłym (agar mięsny)

cieplarka na temp. 37°C

Badanie wymagań odżywczych bakterii

1) Wykonać posiew izolacyjny bakterii na podłoże zwykłe i podłoże wzbogacone

2) Płytki inkubować w cieplarce w 37°C przez 24-48 godzin

ODCZYTANIE WYNIKÓW NA NASTĘPNYCH ĆWICZENIACH!

3) Po inkubacji odczytać wynik:

porównać intensywność wzrostu bakterii na badanych podłożach

określić, która grupa drobnoustrojów ma większe wymagania odżywcze

Wyniki:

Tabela 1A

Bakterie

Wzrost

(- , +, ++, +++)

Interpretacja wyników

(drobnoustrój

wymagający/niewymagający)

podłoże

zwykłe

podłoże

wzbogacone

Streptococcus sp.

Neisseriae sp.

Staphylococcus sp.

Corynebacterium sp.

Escherichia sp.

Bacillus sp.

3

1B. Cel: Badanie wymagań tlenowych bakterii

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa otrzymuje 1 drobnoustrój)

Materiał:

24-48 godz. hodowle drobnoustrojów na agarze mięsnym: Pseudomonas sp., Escherichia

sp., Micrococcus sp., Serratia sp., Klebsiella sp., Enterococcus sp.

2 płytki z podłożem zwykłym (agar mięsny)

cieplarka na temp. 37°C

Badanie wymagań tlenowych bakterii

1) Wykonać posiew izolacyjny bakterii na 2 podłoża

2) Jedną płytkę inkubować w warunkach beztlenowych (anaerostat), drugą płytkę

inkubować w warunkach tlenowych.

3) Inkubować podłoża w 37°C przez 24-48 godzin

ODCZYTANIE WYNIKÓW NA NASTĘPNYCH ĆWICZENIACH!

4) Odczytać wynik po inkubacji i zapisać w tabeli 1B.

Wyniki:

Tabela 1B

Bakterie

Wzrost

(- , +)

Określić grupę

drobnoustrojów*

warunki

tlenowe

warunki

beztlenowe

Pseudomonas sp.

Escherichia sp.

Micrococcus sp.

Serratia sp.

Klebsiella sp.

Enterococcus sp.

*

bezwzględne tlenowce, bezwzględne beztlenowce, względne beztlenowce

4

1C. Cel: Różnicowanie i wstępna identyfikacja bakterii za pomocą podłoży wybiórczo-

różnicujących

Wykonanie: w grupach 6-osobowych (grupa wykonuje posiew 1 mieszaniny na 3 podłożach)

Materiał:

Mieszanina 2 rodzajów bakterii w fizjologicznym roztworze soli

Płytki z podłożem wzbogaconym (agar krwawy)

Płytki z podłożem wybiórczo-różnicującym (Mac Conkey’a)

Płytki z podłożem wybiórczo-różnicującym (Chapmana)

cieplarka na temp. 37°C

Różnicowanie i wstępna identyfikacja bakterii za pomocą podłoży

wybiórczo-różnicujących

1) Wykonać posiew izolacyjny mieszaniny bakteryjnej na podłoże wzbogacone

i 2 podłoża wybiórczo-różnicujące

2) Inkubować podłoża w 37°C przez 24-48 godzin

ODCZYTANIE WYNIKÓW NA NASTĘPNYCH ĆWICZENIACH!

3) Po inkubacji odczytać wynik i zapisać w tabeli 1C:

ocenić intensywność wzrostu każdego rodzaju bakterii na podłożu wzbogaconym

wykonać preparaty barwione metodą Grama: z obydwu rodzajów kolonii wyrosłych

na podłożu krwawym i z kolonii wyrosłych na podłożach wybiórczo-różnicujących

Wyniki:

Tabela 1C

Mieszanina

Podłoża / (wzrost: -, +, ++, +++)

Preparat Grama

Bakteria

Agar

krwawy

Mac

Conke’y*

Chapman’a**

Barwa

Kształt

A

1

2

B

1

2

*

barwa kolonii różowa lub barwa kolonii bez zmian

** barwa kolonii i podłoża żółta, podłoże bez zmian, z koloniami barwy białej

5

Zadanie 2

. Wykonanie posiewu bakterii na podłoże płynne

Cel: Zapoznanie się z technikami hodowli drobnoustrojów w laboratoriach mikrobiologicznych

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa posiewa 1 drobnoustrój na podłoże

płynne)

Materiał:

24-48 godz. hodowle drobnoustrojów (z zadania 1B)

podłoże płynne (bulion z glukozą)

cieplarka na temp. 37°C

Wykonanie posiewu bakterii na podłoże płynne

1) Pobrać jałową ezą bakterie (1oczko ezy)

2) Trzymając ezę w jednej ręce, drugą pobrać ze statywu probówkę z podłożem płynnym

3) Piątym palcem ręki w której trzymamy ezę, wyjąć korek z probówki

4) Delikatnie opalić wlot probówki nad płomieniem palnika

5) Wprowadzić bakterie do probówki z podłożem, delikatnie rozcierając zawartość ezy na

ściankach wnętrza probówki, tuż nad powierzchnią podłoża

6) Wymieszać podłoże, delikatnie opalić wlot probówki i po jej zamknięciu odstawić do

statywu

7) Ezę wyżarzyć nad płomieniem palnika i włożyć do statywu

8) Inkubować podłoże w 37°C przez 24-48 godzin

ODCZYTANIE WYNIKÓW NA NASTĘPNYCH ĆWICZENIACH!

9) Odczytać wynik i zapisać w tabeli 2.

Wyniki:

Tabela 2

Hodowla

Wzrost (+, -)

A

B

C

D

E

F

6

Zadanie 3.

Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama z hodowli na

podłożu stałym i obserwacja morfologii komórek

Cel: wstępna identyfikacja drobnoustroju

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa wykonuje 1 preparat)

Materiał:

24-48 godz. hodowle drobnoustrojów na podłożu krwawym (a-f): ziarniaki Gram (+); ziarniaki

Gram (-); pałeczki; maczugowce; laseczki; drożdżaki

odtłuszczone szkiełka podstawowe

jałowy roztwór fizjologiczny soli (0, 85% NaCl)

dermatograf (ołówek świecowy lub pisak wodoodporny)

zestaw barwników do barwienia metodą Grama

olejek immersyjny

mikroskop optyczny

Drobnoustroje, z których wykonujemy preparat mikroskopowy, pobieramy jałową ezą (drucik

z oczkiem wykonanym z platyny lub ze stopu platyno podobnego).

Jałowienie ezy przez wyżarzanie (opalenie) odbywa się przez włożenie drucika ezy do

wnętrza płomienia palnika na kilka sekund w celu doprowadzenia go do czerwoności, a

następnie chłodzenie (15-20 sekund). Czynności te wykonuje się przed i po każdym użyciu

ezy.

Przeniesienie hodowli z podłoża płynnego na szkiełko podstawowe obejmuje następujące

czynności:

włączyć palnik

wyjałowić ezę przez wyżarzenie, a następnie schłodzić

w drugiej ręce trzymać probówkę z hodowlą (wcześniej należy ją wymieszać)

piątym palcem ręki,w której trzymamy ezę, odciągnąć korek probówki

Nie należy kłaść korka na stole, ze względu na możliwość rozjałowienia!

opalić wylot probówki nad płomieniem palnika przez kilka sekund

ostrożnie pobrać hodowlę bakteryjną (oczko ezy)

opalić wylot probówki nad płomieniem przez kilka sekund

włożyć korek do probówki z hodowlą

odstawić probówkę z hodowlą do statywu

nanieść ezą pobraną hodowlę na szkiełko podstawowe

7

Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama

z hodowli polega na: - przygotowaniu rozmazu; - zabarwieniu rozmazu

Przygotowanie rozmazu z hodowli stałej

1) Umieścić na szkiełku podstawowym małą kroplę fizjologicznego roztworu soli (szkiełko

powinno być odtłuszczone)

2) Pobrać kolonie bakterii z podłoża za pomocą jałowej ezy i wykonać kolistymi ruchami rozmaz o

ø 10-20 mm (przy zbyt dużej ilości pobranych drobnoustrojów rozmaz jest za gruby; przy ich

zbyt małej liczbie - rozmaz jest za cienki)

3) Wysuszyć rozmaz w temperaturze pokojowej

4) Utrwalić rozmaz przez 3-krotne, wolne, przeprowadzenie szkiełka nad płomieniem palnika

Bezwzględnie unikać nadmiernego ogrzewania szkiełka!

5) Na odwrotnej stronie szkiełka, za pomocą dermatografu, oznaczyć miejsce naniesienia

drobnoustrojów (umożliwia wygodne określenie miejsca rozmazu) i zabarwić rozmaz.

Barwienie rozmazu metodą Grama

1) Położyć szkiełko z rozmazem na statywie nad zlewem

2) Nanieść na rozmaz kilka kropli barwnika - roztwór fioletu krystalicznego – tak, aby

oznaczony markerem obszar został w całości pokryty

Nie zalewać barwnikiem całego szkiełka – zbędne zużycie roztworu barwiącego!

3) Pozostawić barwnik na rozmazie przez 3 minuty

4) Usunąć barwnik do zlewu przechylając szkiełko w pozycję pionową

5) Spłukać delikatnie rozmaz cienkim strumieniem wody (z pojemnika oznaczonego H

2

O),

przechylając szkiełko w pozycję pionową i kierując strumień wody tuż nad rozmazem

Unikać spłukiwania wodą bezpośrednio miejsca naniesienia rozmazu, gdyż grozi to

wypłukaniem naniesionych drobnoustrojów!

6) Nanieść na rozmaz kilka kropli odczynnika - płyn Lugola – tak, aby oznaczony markerem

obszar został w całości pokryty

7) Pozostawić odczynnik na rozmazie przez 1 minutę

8) Usunąć odczynnik do zlewu przechylając szkiełko w pozycję pionową

9) Spłukać delikatnie rozmaz cienkim strumieniem wody (pojemnik oznaczony H

2

O),

przechylając szkiełko w pozycję pionową i kierując strumień wody tuż nad rozmazem

Unikać spłukiwania wodą bezpośrednio miejsca naniesienia rozmazu, gdyż grozi to

wypłukaniem naniesionych drobnoustrojów!

8

10) Nanieść na rozmaz kilka kropli odczynnika – alkohol - tak, aby oznaczony markerem

obszar został w całości pokryty

11) Pozostawić odczynnik na 30 sekund

12) Usunąć odczynnik do zlewu przechylając szkiełko w pozycję pionową

13) Spłukać delikatnie rozmaz cienkim strumieniem wody, przechylając szkiełko w pozycję

pionową i kierując strumień wody tuż nad rozmazem

Unikać spłukiwania wodą bezpośrednio miejsca naniesienia rozmazu, gdyż grozi to

wypłukaniem naniesionych drobnoustrojów!

14) Nanieść na rozmaz kilka kropli barwnika - fuksyna – tak, aby oznaczony markerem

obszar został w całości pokryty

15) Pozostawić barwnik na rozmazie przez 30 sekund

16) Usunąć barwnik do zlewu przechylając szkiełko w pozycję pionową

17) Spłukać delikatnie rozmaz cienkim strumieniem wody, przechylając szkiełko w pozycję

pionową i kierując strumień wody tuż nad rozmazem

18) Suszyć preparat w temperaturze pokojowej umieszczając szkiełko na bibule i opierając o

statyw w pozycji pionowej

19) Oglądać preparat w mikroskopie optycznym (obiektyw 100x), z użyciem olejku

immersyjnego.

Wyniki: zapisać w tabeli 3.

Tabela 3

Hodowla

Kształt

komórki

Barwliwość

Układ

Drobnoustrój

(wstępna identyfikacja)

A

B

C

D

E

F

Kształt: kulisty, cylindryczny, spiralny

Barwliwość w metodzie Grama: fioletowe komórki – Gram (+); różowe komórki – Gram (-)

Układ: dwoinki, pakiety, paciorki, grona, układ pisma klinowego

Drobnoustrój: ziarniaki Gram (+); ziarniaki Gram (-); pałeczki, maczugowce, laseczki; drożdżaki

Opis preparatu

W preparacie z hodowli …………. wykryto …………………………………………………………….

9

Zadanie 4.

Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama z hodowli na podłożu

płynnym i obserwacja morfologii komórek

Cel: wstępna identyfikacja drobnoustroju

Wykonanie: w grupach 2-osobowych (każda grupa wykonuje 1 preparat)

Materiał:

24 godz. hodowle drobnoustrojów na podłożu płynnym: ziarniaki Gram (+);

ziarniaki Gram (-); pałeczki; maczugowce; laseczki; drożdżaki

odtłuszczone szkiełka podstawowe

dermatograf (ołówek świecowy lub pisak wodoodporny)

zestaw barwników do barwienia metodą Grama

olejek immersyjny

mikroskop optyczny

Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama polega na

przygotowaniu rozmazu oraz jego zabarwieniu

Przygotowanie rozmazu z hodowli płynnej

1) Wymieszać hodowlę płynną przez kilka sekund

2) Pobrać 1-2 oczka płynnej hodowli drobnoustroju za pomocą jałowej ezy i umieścić na

szkiełku podstawowym wykonując kolistymi ruchami rozmaz o ø 10-20 mm

3) Rozmaz wysuszyć w temperaturze pokojowej

4) Utrwalić rozmaz przez 3-krotne, wolne przeprowadzenie szkiełka nad płomieniem palnika

Bezwzględnie unikać nadmiernego ogrzewania szkiełka!

5) Na odwrotnej stronie szkiełka oznaczyć miejsce naniesienia drobnoustrojów za pomocą

dermatografu (umożliwia wygodne określenie miejsca rozmazu) i zabarwić rozmaz.

Barwienie rozmazu metodą Grama – patrz: Zadanie 3

10

Wyniki: zapisać w tabeli 3.

Tabela 4

Hodowla

Kształt

komórki

Barwliwość

Układ

Drobnoustrój

(wstępna identyfikacja)

a

b

c

d

e

f

Kształt - kulisty, cylindryczny, spiralny

Barwliwość w metodzie Grama - fioletowe komórki – Gram (+); różowe komórki – Gram (-)

Układ - dwoinki, pakiety, paciorki, grona, układ pisma chińskiego

Drobnoustrój - ziarniaki Gram (+); ziarniaki Gram (-); pałeczki, maczugowce, laseczki; drożdżaki

Opis preparatu

W preparacie z hodowli …. …………… wykryto ……………………………………………………..