METODY MOLEKULARNE I

Katarzyna Stasik

gr. 47

Materiał biologiczny

• Pełna krew obwodowa
• Komórki nabłonka
• Hodowla fibroblastów
• Komórki płynu owodniowego (AFC)
• Komórki kosmówki (CVS)
• Cebulki włosów
• Plamy krwi, nasienia, fragmenty tkanek pobrane metodą biopsji

cienkoigłowej, szpik kostny

Pobieranie materiału genetycznego

Badanie diagnostyczne

1 ml krwi obwodowej pobranej na EDTA, heparynę
10 mg tkanki- bezpośrednia izolacja DNA
10 ml płynu owodniowego hodowla komórek w naczyniach hodowlanych
Włosy, wymazy z jamy ustnej

Do badania PCR:

50 ul krwi

10 ul nasienia
Materiały archiwalne

Przechowywanie próbek

• +4 C (do 48 godzin)
• Materiał zamrożony w -20, -80 lub -195
• Materiał utrwalony w alkoholu
• Materiał umieszczony w buforze do lizy (Tris HCl, SDS, EDTA, ph 8,0)

Materiał suchy (plamy)
• W kopertach w temp pokojowej w suchym miejscu

Badanie prenatalne

Inwazyjne:

• Biopsja kosmówki
• Amniopunkcja
• Kordocenteza
• Fetoskopia

Nieinwazyjne:

• USG + doppler
• Badania przesiewowe oparte na oznaczaniu specyficznych substancji pochodzenia płodowego

obecnych w surowicy krwi matki.

• Badanie komórek i DNA pochodzenia płodowego obecnych w krążeniu matczynym.

Techniki pobierania materiału do badań
prenatalnych – Biopsja kosmówki

Techniki pobierania materiału do badań
prenatalnych- Amniopunkcja

Techniki pobierania materiału do badań
prenatalnych- Kordocenteza i Fetoskopia

Izolacja DNA

• Liza komórki
• Denaturacja i hydroliza białek
• Usunięcie białek
• Zagęszczenie DNA

Odbiałczenie preparatu

• Z zastosowaniem fenolu i chloroformu (najwyższa czystość)
• Wysolenie białek z lizatów komórek
• Po związaniu DNA z nośnikiem, odmyciu zanieczyszczeń i uwolnieniu

DNA. (kolumny chromatograficzne z filtrami jonowymiennymi lub
krzemionkowymi

Izolacja RNA

Metody izolacji w zależności od typu RNA, można przeprowadzić
• Izolację specyficznego RNA w wyniku frakcjonowania całkowitego RNA

komóki

• Bezpośrednią izolację specyficznego RNA ograniczoną do komórek

syntetyzujących określony RNA w większej ilości

• Izolację poli(A) RNA
• Izolację RNA z polirybosomów
• Izolację całkowitego RNA komórki, a następnie uzyskanie określonego RNA w

postaci cDNA w procesie odwrotnej transkrypcji

Zasady izolacji RNA

• Stosowanie silnych związków degradujących białka (chlorowodorek

guanidyny, izotiocyjanian guanidyny) do inaktywacji Rnaz

• Usunięcie RNAz ze sprzętu- DEPC (dietylopirowęglan)
• Usunięcie DNA podczas izolacji RNA (ekstrakcja fenolem o niskim pH;

trawienie Dnazą) można wytrącić RNA w chlorku litu lub wirowanie w
dwustopniowym gradiencie tiocyjanianu guanidyny i chlorku cezu

• Izolacja mRNA z zastosowaniem poliT przyłączonymi do stałego podłoża np. w

kolumnach chromatograficznych lub na kuleczkach magnetycznych
(niezwiązane RNA odmywane, pozostałe poddawane elucji)

Ocena jakościowa i ilościowa wyizolowanych
kwasów nukleinowych

Jakość kwasów nukleinowych ocenia się:
• W elektroforezie analitycznej w żelu
• Metodą spektrofotometryczną pomiarów absorbancji
• Metodą mikromacierzy w połączeniu z elektroforezą mikrokapilarną

Elektroforeza na żelu

• W celu sprawdzenia zarówno jakości, jak i ilości preparatu DNA należy

przygotować 0,8% żel agarozowy, zawierający 0,5 μ/ml bromku etydyny
w buforze 1 x TBE (tj. 10 x TBE: 0,89 M Tris, 0,89 M kwas borowy, 0,02 M
EDTA, pH=8.0), następnie nakłada się 0,5; 1,0; oraz 5,0 μg preparatu o znanym
stężeniu, oraz preparaty do oszacowania (w buforze obciążającym).

• Następnie po przeprowadzonej elektroforezie, ilość i jakość preparatów

ocenia się na transiluminatorze, który emituje światło o długości 312 nm.

• Jeżeli w porównaniu do markera, wielość wyizolowanego DNA migruje

w postaci wartego prążka o wielkości ponad 50 kpz, bez widocznych smug,
o oznacza to, że wyizolowane DNA jest wysokocząsteczkowe

Ocena spektrofotometryczna

• Preparaty do pomiaru absorbancji muszą być wcześniej

rozcieńczone (najczęściej 100 x H2O lub buforem TE). Oznaczenie
wykonuje się za pomocą pomiary fluorescencji
(spektrofotometrem). Po kalibracji spektrofotometru odczytuje
się punktowo wartość absorpcji przy 260, 280 i 320 nm, bądź też
można wykonać widmo pomiarów w zakresie od 200 do 350
nm.

Metoda mikromacierzy

• Podstawą działania mikromacierzy jest, tak jak w tradycyjnej hybrydyzacji

Southerna, komplementarność kwasów nukleinowych. Mikromacierz zawiera
sekwencje komplementarne do badanych sekwencji.

• Próbkę kwasu nukleinowego wyznakowuje się (jednym lub dwoma

znacznikami fluorescencyjnymi) i hybrydyzuje z mikromacierzą.

• Cząsteczki wyznakowanego kwasu nukleinowego wiążą się do

komplementarnych sekwencji.

• Obraz odczytuje się ilościowo (za pomocą lasera lub mikroskopu).

Intensywność sygnału dla poszczególnych sond mikromacierzy jest
proporcjonalna do ilości kwasu nukleinowego o danej sekwencji w próbce.

Metoda mikromacierzy

PCR

• Reakcja łańcuchowa polimeryzacji

opracowana została w latach 80-tych przez

Kary'ego Mullisa (Nagroda Nobla (1993 r.)).

• Reakcja ta umożliwia powielanie wybranych

fragmentów DNA za pomocą procesu

enzymatycznego.

• Konieczna jest znajomość sekwencji DNA na

obu końcach regionu, który ma być

skopiowany.

• Namnożony fragment DNA jest

wykorzystywany do analizy lub manipulacji

genetycznych

Skład mieszaniny reakcyjnej PCR

1)matrycowy DNA
2)primery
3)Trifosforany deoksynukleozydów (dNTP) substraty dla polimerazy DNA
4) polimeraza DNA (termostabilna)
5)bufor
6)jony Mg2+ wiązane przez startery, matrycę polimerazę i dNTP
7)Substancje stabilizujące polimerazę

Etapy reakcji PCR

1) Denaturacja- temp 95 C rozplecenie dwuniciowej helisy DNA
2) Hybrydyzacja odcinków starterowych z sekwencjami DNA otaczający
gen namnażany (annealing) 45-60C
3) Wydłużanie (elongacja) synteza DNA przez polimerazę DNA
dobudowującą kolejne nukleotydy do starterów 72 C

RT-PCR

PCR, w którym pierwszy etap jest przeprowadzony przez odwrotną

transkryptazę, a jako matryca służy cząsteczka mRNA.

Podstawowe cechy i zalety Reverse Transcriptase PCR:
• umożliwia utworzenie cDNA na matrycy RNA
• cDNA jest znacznie stabilniejszy niż RNA
• cDNA może być amplifikowany za pomocą PCR

Skład mieszaniny reakcyjnej RT-PCR

1) RNA(wysokiej jakości i wolny od zanieczyszczeń)
2) primery (startery)
3) dNTPs
4) bufor
5) odwrotna transkryptaza
6) polimeraza Taq

• RT-PCR może być użyty do analizy ilościowej (quantitive) lub pół-

ilościowej(semi-quantitative). Analiza pół-ilościowa pozwala nam
określić, czy jeden transkrypt ulegał większej ekspresji niż inny
natomiast ilościowa pozwala nam określić całkowitą ilość danego
transkryptu w badanym materiale.

• Metoda pół-ilościowa może być używana do określenia obecności lub

nieobecności danego transkryptu, określenia jego ilości, klonowania,
tworzenia bibliotek cDNA, konstrukcji sond.

Real Time-PCR

• PCR w czasie rzeczywistym ilościowy pomiar kopii genu, określenie

poziomu ekspresji RNA w tkankach

• Umożliwia monitorowanie zmian stężenia produktu PCR przez pomiar

fluorescencji dzięki stosowaniu barwników sond fluorescencyjnych

• Termocykler + fluorymetr

Termocykler do Real Time PCR

PCR multipleks

• Amplifikacja wielu matryc podczas jednej reakcji PCR (wykorzystanie

różnych zestawów primerów (zwiększa ryzyko błędów, krzyżowa
hybrydyzacja)

• Primery powinny mieć podobną kinetykę reakcji, powinny być

specyficzne

• Amplikony powinny różnić się między sobą długością. rozdział na

pojedynczym żelu elektroforetycznym. Wahania te nie mogą być jednak
zbyt duże, gdyż może to uniemożliwić ich

Zastosowanie Multipleks PCR

•

wykrywanie delecji i innych zmian w sekwencji docelowej

•

Polymorphic Repetitive DNA (polimorficzne powtarzalne sekwencje DNA) - Multipleks PCR to

idealna technika do profilowania DNA, czyli identyfikacji poszczególnych osobników. Krótkie tandemowe
powtórzenia (STR ang. Short Tandem Repeats) lub inaczej sekwencje mikrosatelitarne bardzo dobrze nadają
się do techniki multipleks, ze względu na swoje liczne występowanie oraz wysoki polimorfizm. Stosuje się je
m.in. przy wykrywaniu chorób, mapowaniu genów oraz w analizach kryminalistycznych.
•

wykrywanie i charakteryzacja mikroorganizmów grzybów, bakterii , wirusów oraz pasożytów.

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ

