Oznaczanie białek metodą biuretową. Dializa, punkt radioelektryczny i wysalanie białek.

6.2 6.4 6.7a 12.24

Amfoteryczność białek:

Aminokwasy, z których złożone są białka mają charakter amfoteryczny – mogą mieć charakter
kwasowy jak i zasadowy w zależności od pH roztworu. Za te właściwości odpowiadają ugrupowania
COO

-

- COOH i NH

3

+

- NH

2

, które mogą przyjmować i oddawać protony. W środowisku wodnym

aminokwasy występują w postaci zjonizowanej.

Istnieje pH w którym ilość ładunków + równa jest ilości ładunków -. Takie pH nazywa się pI –
punktem izoelektrycznym. Aminokwas zachowuje się w tym punkcie jakby nie miał ładunku,
jednakże występuje on w postaci jonu obojniaczego (ładunek sumaryczny = 0)

+

H

3

N-CHR-COOH

→

←

+

H

3

N-CHR-COO

-

→

←

H

2

N-CHR-COO

-

kation H

+

+ jon obojnaczy + OH- anion

kwas zasada

środowisko kwasowe pI środowisko zasadowe

pH <<<7 pH>>>>7

Białka składają się z aminokwasów i podobnie jak aminokwasy mają charakter amfoteryczny.
Białka złożone są z łańcuchów polipeptydowych, w których aa połączone są wiązaniem peptydowym
pomiędzy grupami –NH

2

i –COOH. Grupy te są zablokowane i nie zdolne do jonizacji. Niektóre

aminokwasy posiadają zdolne do jonizacji grupy w łańcuchu bocznym:
-NH

2

, -COOH, -OH, -SH, grupa imidazolowa histydyny, guanidynowa argininy, grupy fosforowe

fosfoprotein. Poprzez obecność tych grup białko staje się wielowartościowym jonem.

W przypadku białek także istnieje pojęcie punktu izoelektrycznego Wypadkowy ładunek całego
białka jest wtedy równy 0, a białko staje się dipolem o bardzo złożonym momencie dipolowym. Dla
pH mniejszych od pI cząsteczka białka staje się coraz silniej zjonizowanym kwasem
wielokationowym. Dla pH większego od pI cząsteczka oddaje H

+

i staje się coraz silniej dysocjowaną

zasadą wieloanionową.

W punkcie izoelektrycznym białka wykazują najmniejszą rozpuszczalność, a niektóre nawet
wypadają z roztworu. Poza tym białka nie przemieszcza się w pI w polu elektrycznym (ładunek
całkowity 0)

Cwiczenie 6.2 (s 239). Oznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny.

Przygotowuje się szereg probówek z różnymi objętościami kwasu octowego i roztwór kazeiny w
octanie sodu (NaOH przereaguje z kwasem octowym)

W ten sposób po wprowadzeniu 1 ml Kazeiny do szeregu stężeń kwasu octowego uzyska się szereg
roztworów buforowych o różnych pH – od 3,5 do 5,9

Wzór na pH roztworu buforowego : pH=pK + log Cs/Ck lub pH= pK - log Ck/Cs

Jeżeli objętość stała można zamiast stężeń podstawić liczbę moli w roztworze

1

Przykład dla probówki 5

mamy 0,1 ml 1 M (1 mmol/1ml) CH3COOH w 10 ml - roztworu (5+5)
nk = 0,1 mmol

kazeina w 1 ml 0,1 M CH3COONa czyli inaczej 0,1 mmol/ml w 10 ml 0.01 mmol/ml
nz= 0,1 mmol

1M = 1 mol/l = 1 mmol/ml

pK dla kwasu octowego 4,7

pH = 4,7 + log 0.01/0.01 = 4,7 + 0 = 4,7

Przykład dla probówki 4

nk=0,2

nz=0.1

pH= 4,7 + log 0,1/0,2 = 4,7 – log 0,2/0,1 = 4,7 - 0,3 = 4.4

Ćwiczenie 6.4 Dializa

Dyfuzja przez błony półprzepuszczalne - błona przepuszczalna dla wody i jonów, nie przepuszczalna
dla białek. Jony i woda dyfundują zgodnie z gradientem stężeń.

Ćwiczenie 6.7a. Oddzielanie albumin od globulin.

Wysalanie białek –

Rozpuszczalność białek w wodzie zależy od ich zdolności do hydratacji (czyli wiąznia cząsteczek
wody), budowy chemicznej, obecności soli w środowisku i od pH.

Hydratacja – wiązanie się dipoli wody z grupami polarnymi łańcuchów bocznych oraz atomami N i O
wiązania peptydowego - cząsteczka otacza się płaszczem wodnym.

Niewielkie stężenia soli wpływają dodatnio na rozpuszczalność.

Co się dzieje przy wzroście stężenia soli?

Wysalanie – pod wpływem dużych stężeń soli rozpuszczalność białek maleje. Sole wiążą wodę
i pozbawiają cząsteczki białka płaszcza wodnego – wytrącenie z roztworu. Wysalanie jest odwracalne.
Najłatwiej wysolić w punkcie izoelektrycznym – brak ładunków sprzyja łączeniu cząsteczek
w większe agregaty, łatwo wypadające z roztworu. Do wysalania stosuje się zwykle siarczan amonu.

Ćwiczenie 12.24 (589 s.) oznaczanie zawartości białka metodą biuretową.

Białka surowicy – stężenie białka w surowicy ok. 7%

Albuminy – 69 kDa, rozpuszczalne w H

2

O, pI ok. 4,9 – wysalają się przy pełnym nasyceniu

siarczanem amonu 60%, w białkach surowicy stężenie 4.3%.

Globuliny – 100 kDa – mniejsze powinowactwo do wody.

Zasada metody – odczynnik biuretowy reaguje z wiązaniami peptydowymi dając barwny kompleks.

2