HPLC
Cechy:
-wysoka sprawność
-dobra rozdzielczość
-szybkość
-zastosowanie wysokich ciśnień
Zasada HPLC- wysoka sprawność, dobra
rozdzielczość, krótki czas analitu, stosowanie
wysokich ciśnień
HPLC podstawa- oddziaływanie między
próbką, fazą stac i ruchomą, że próbka jest
ciekła
Optymalizacja metod HPLC- uszeregować
elucja gradientowa, zmiana kolumny,elucja
izokratyczna, zmiana rozpuszczalnika
Warunek HPLC- lotny rozpuszczalnik, który
rozpuści próbkę
Analiza jakościowa w HPLC polega na-
porównaniu czasu retencji piku subst z tr piku
wzorca
Elucja izokratyczna- skład eluentu jest
jednakowy przez cały czas analizy próbki
Elucja gradientowa- sklad eluentu zmienia
się podczas analizy próbki
Eluent- faza ruchoma która wprowadza się do
kolumny
Spektrofluorymetria
Przed oznaczeniem spektrofluometrycznym:
dobrać optymalną dł. Fali promieniowania
wzbudzającego i emitowanego, ustalić
dozwolony zakres stężenia badanej subst
Światło w spektrofluorymetrii emituje-
substancje
Spektrofotometria nie oznaczamy- struktury
związku
Oznaczamy: zw fizjol czynne, Wit. B1, B2,
hormony (Adr), aminokwasy (trypt, tyro),
alkaloidy (chinina), sub farmaceutyczne
(barbiturany, antybiotyki) spozywanie cukrów,
węglowodanów, tłuszczów
Spektrofluorymetria zasada/ zależy od-
adsorpcja i potem emisja
Spektrofluorymetria detektor można użyć
do oznaczania polifenoli w herbacie
Spektrofluorymetria- kuwety kwarcowe
Spektrofluorymetria zasada- analiza
fluorescencji próbki wywołanym światłem UV
lub rentgenowskim
Detektor fluorescencji- najbardziej
selektywny, specyficzny, czuły z detektorów
HPLC
ASA
Przewodność elektrolitu zależy od- liczby
jonów, ładunku, ruchliwości/ prędkości w
polu elektr
Zasada ASA- absorpcja promieniowania
elektromagnetycznego przez wolne atomy w st
podstawowym
ASA oznaczamy- pierwiastki, metale,
metaloidy w śladowych ilościach
ASA źródło promieniowania- lampa z katodą
wnękową HCl i z wyładowaniem
bezelektronowym EDL
Przesunięcie batochromowe- przesunięcie
pasma w kierunku mniejszych częstości
(dłuższych fal) wywołane oddziaływaniem
podstawnika lub rozpuszczalnika
Przesunięcie hipsochromowe- przesunięcie
pasma w kierunku większych częstotliwości-
krótszych fal
Efekt hiperchromowy- zwiększenie
intensywności pasma
Efekt hipochromowy- zmniejszenie
intensywności pasma
Konduktometria- metoda analityczna, bada
przewodnictwo elektryczne r-ru elektr,
znajdujących się między dwoma elektrodami

Konduktometria bezpośrednia- pomiar
przewodności właściwej elektrolitów-
wyznaczanie stężenia r-rów na podstawie
badania przewodnictwa- stosuje się
detektorach konduktometrycznych
stosowanych LC- procesach technolog,
oczyszczanie wody, oznaczanie tlenu w
wodzie
Konduktometria zastosowanie:
miareczkowanie konduktometryczne,
oznaczanie czystosci wody za pomoca
przewodności wlasciwej, pomiar stalej
dysocjacji slabego kwasu, pomiar
przewodnictwa sluzy do oznaczania struktury
r-rów elektrolitów
Walidacja- proces pozwalający zdefiniowań
daną metodykę analityczną
Liniowość- możliwośc uzyskania wyników,
które są proporcjonalne do stężenia
Dokładność- stopień zgodności między
wynikiem pojedynczego pomiaru a wartością
oczekiwaną/odniesienia
Powtarzalność- precyzja w warunkach
powtarzalności, niezależne wyniki badania
takich samych przedmiotów otrzymuje się tą
samą metodą, w tym samy laboratorium, ten
sam analityk i to samo wyposażenie, w
krótkich odstępach czasu
Odtwarzalność- precyzja w warunkach
odtwarzalności, wyniki badania takich samych
przedmiotów otrzymuje się tą samą metodą, w
różnych laboratoriach,, przez różnych
operatorów, różne wyposażenie, w długich
odstępach czasu
Precyzja- zbieżność wyników uzyskanych
wielokrotnego pomiaru tej samej próby
wykonanych wg określonej procedury
Identycznośc potwierdzamy- selektywność i
specyficzność
Jon fragmentacyjny- utworzony wskutek
utraty jednego lub kilku fragmentów z jonu
macierzystego
Derywatyzacja- przeprowadzanie trudno
lotnych związków w ich trwałe i lotne
pochodne; podstawienie wodorów polarnych
grupach np. OH, COOH, NH2 rodnikami
organicznymi np. SiCH3
Nebulizacja- przeprowadzenie próbki w
aerozol
Obszar daktyloskopowy- 1300- 700cm do -
1; specyficzny dla danej cząsteczki, pasma
powstałe w wyniku oddziaływania
wzajemnego drgań
Czas retencji- czas potrzebny do przejścia
subst przez kolumnę
Czas martwy- czas w którym wymywane są
związki nie zatrzymywane na kolumnie
Metoda dodatku wzorca- dodanie do próbki
znanych ilości sub oznaczanych, zwykle 5-
150% oczekiwanej zawartości oznaczanej
subst
Widmo- wykres zależności stężenia absorpcji
od dł fali lub częstotliwości
Źródło promieniowania UV- VIS- lampy
neutronowe, wolframowe, halogenowe,
wysokociśnieniowe ksenonowe
Masa izotopowa- masa zsumowanych
najpopularniejszych izotopów związków
(masa najpopularniejszego w przyrodzie
izotopu)
Masa molowa- masa wszystkich izotopów

Rozkład izotopowy- MS ma taką
rozdzielczość, że widać poszczególne izotopy
Promieniowanie elektromagnetyczne-
wzbudzenie elektronów zmiany energii
oscylacyjnej, rotacyjnej cząsteczki

Oscylacja- ruch periodyczny, atomy na
przemian oddalają/ przybliżają się do sub?
Odchylenia od prawa Lamberta- Beera nie
spowoduje: dysocjacja wielu związków
barwnych w r-rach, w których zastosowanie
jonu jest inne niż zabarwienie cząsteczek
niezdysocjowanych- rozpuszczalnik- zmiana
zabarwienia ….. z upływem czasu- temp.-
obeznośC obcych elektrolitów reagujących z
odczynnikiem- ilość dodawanego odczynnika,
jego natężenie, sposób i kolejność dodawania
odczynników, czystość rozpuszczalników-
niemonochromatyczność promieniowania
Charakterystyka jonizacji EI- jonizacja
strumieniem elektronów, twarda metoda
jonizacji, odbywa się w próżni i powoduje
fragmentację badanych czastek, najbardziej
popularna metoda w chromatografii gazowej
Rodzaje drgań:
1.rozciagajace/ walencyjne- symetryczne i
antysymetryczne
2.deformacyjne- nożycowe i kołyszące w
paszczyźnie, wahadłowe i skręcające poza
płaszczyzną
3.szkieletowe
Analizator KWADRUPOLOWY
-najbardziej popularny, tani
-ograniczona rozdzielczość
-przeciwległe pręty są parami polaryzowane w
fazie
-potencjał prądu stałego DC przyłożony do
prętów i modulowany częstością RF
-tylko jony o specyficznej wartości m/z
przechodzą przez detektor
-w trakcie skanowanie widma
-zmienia się DC i RT

ETAPY ANALIZY MS
1. generowanie cząsteczek w fazie gazowej
próbki (ciecz, roztwór, ciało stałe itd.)
2. jonizacja tych cząsteczek
3. rozdzielenie na podstawie ich masy
4. detekcja strumienia jonów
Gaszenie stężeniowe – w roztworach
rozcieńczonych intensywność fluorescencji
jest liniową funkcją stężenia luminoforu. Gdy
stężenie substancji oznaczanej osiągnie pewną
granicę to intensywność promieniowania
fluorescencji zaczyna maleć.

Najczęściej stosowana technika jonizacji
LC-MS- ESI
Najczęściej stosowany detektor w GC- FID
płomieniowo - jonizacyjny
Roznąca siła elucji rozpuszczalników RP-
woda, metanol, acetony, heksan
Siła elucji w ukl faz normalnym: n pentan< n
heksan< cykloheksan< tetra chlorek wegla<
toluen< benzen< eter di etylowy< chloroform<
dichlorometan< dichloroetan< aceton< octan
etylu< acetonitryl< pirydynol< etanol<
metanol< woda< kw octowy
Który z gazów nośnikowych jest stosowany
w GC- H2, N2, Ar, He
Molowy współczynnik absorpcji nie zależy
od: stężenie, grubość warstwy, natężenie,
promieniowanie padające; jest wielkością stałą
zależy od: długość fali padającego światła,
rodzaju sub absorbującej, temp.
Wraz z rozcieńczeniem przewodnośc
molowa rośnie, właściwa- maleje
LC-MS- pomiar m/2
DSC oznaczamy- czystość , polimorfizm,
interakcje (lek- sub pomocnicza)
Temp. Topnienia, krystalizacji, parowania,
sublimacji, temp. Przemian szklistych, ciepła
właściwego, kinetyki, denaturacji

ATR- IR- całkowite wewnętrzne odbicie
Zakres właściwy IR- podczerwień - 780nm-
1mm; brak możliwości separacji mieszanin
składników
Splitis GC- dozownik umożliwia spadek
ładunku
Split/splitles- dozownik z dzieleniem/ bez
strumienia gazu
Przesuniecie pasma obsorbcji zależy-
auksochromy i pH?
Ekstrakcja do fazy stałej SPE- wstępne
oczyszczanie i zatężenia zw. Chem?
Detektor elektrochemiczny- faza ciekła
przewodzi prąd i sub mogą ulegać reakcji ox-
red
Przepływ w kolumnie powoduje- pompy
tłokowe i strzykawka
Stałe postacie leków- przyczyny błedów-
barwniki
Płynne- barwniki, konserwanty,
antyoksydanty
W odwróconym ukł faz największą siłe
elucujną ma- acetonitryl
Nieprawidłowy tok postępowania- używanie
zlewki jako naczynia miarowego
ETAAS wynik w postaci- piku
Molowy współczynnik absorpcji
-jest wielkością stałą, nie zależy od stężenia,
grubości warstwy absorbującej i natężenia
promieniowania padającego.
Zależy od długości fali światła padającego i
rodzaju substancji absorbującej światło,
w mniejszym stopniu od temperatury.
Czas martwy t

M

(czas retencji substancji

niezatrzymywanej) –
czas liczony od momentu wprowadzenia do
kolumny (od początku analizy) substancji
niezatrzymywanej przez fazę stacjonarną do
momentu pojawienia się na chromatogramie
maksimum piku
Czas retencji t

R

(całkowity czas retencji) -

czas liczony od momentu wprowadzenia
badanej substancji do kolumny (od początku
analizy) do momentu pojawienia się na
chromatogramie maksimum piku
Czas retencji zredukowany t'

R

- różnica

pomiędzy całkowitym czasem retencji badanej
substancji i czasem retencji substancji
niezatrzymywanej: t'

R

= t

R

- t

M

Współczynnik retencji k - miara czasu, w
jakim substancja
przebywa w fazie stacjonarnej, w stosunku do
czasu, w którym przebywa ona w fazie
ruchomej; określa, ile razy dłużej substancja
jest zatrzymywana przez fazę stacjonarną niż
potrzebowałaby na przejście przez kolumnę z
szybkością fazy ruchowej: k = t'

R

/t

M

Przewodnośc elektrolitu zależy od:
-liczby jonów, ładunku, ruchliwości w polu
elektrycznym
Odchylenia od prawa Lamberta-beera:
-dysocjacja wielu zw barwnych
-temp
-pH
-rozpuszczalnik
-zmiana zabarwienia z uplywem czasu
-niemonochromat prom
-ilosc, czyst, kolejnosc dod ropuszczal
-obecnosc obcych elektr

G:det uni masowyMSDkatarometr ciep-przew

odnosTCDchrom-syg/t k=s/r integra MSstruktorg

UV/VIS czast wid polo i natęż abso-pochlan

opt-mono Prób:spec sel Beer czysty ilościowe

identy,czyst,strukt czast, Sel-inne zakloc spec-tylko

to co zamierz czu;przyr nat sy/przy stęż sub.

HPLC- w. spr,d. rozdzi.krótki t analitu, wys. Ciś.

analMAS;zakr,rozdz-mozli rozroz na wid.
Pików o zbli mas. Przep,czul Typy:sel magnet,
2xognisko,cykloforn jon DSc emisja lub pochl
DMA pom cech lepko K rozn-m cieplo probki
Flux bezwl ciepl,dlugi pomiar,mierzy T a nie sił.
sr dokład Spektrofluorym k kwar
D. flure naj sel spec, czuły z d HPLC
Prec- zbież wyn. uzyskanych wielokroć.
pomiaru tej samej p. wykon.wg określ proc
Wid- Cm absorpcji/dł f. lub częst.1.rozciagajace/
walencyjne- symetryczne i antysymetryczne2.
deformacyjne- nożycowe i kołyszące w paszczyźnie,
wahadłowe i skręcające poza płaszczyzną3.szkieletowe
IR transmi i reflek

n pentan< n heksan< cykloheksan< tetra chlorek wegla<
toluen< benzen< eter dietylowy< chloroform<
dichlorometan< dichloroetan< aceton< octan etylu<
acetonitryl< pirydynol< etanol< metanol< woda< kw
octowy Raman nieorg jakość zrod,prob,mono,det wzm rej
komp kwarc
ozn. WODY:

konduktometria,IR, NMR
,analiza termiczna
OZN. Składników mineralnych

UV-VIS, AAS, AES,potencjometria
OZN. BIAŁKA, AMINOKWASÓW

UV-VIS,turbidymetria, IR, NMR
Chromatografia(jonowymienna
,powinowactwa,żelowa)
Elektroforeza, dializa
OZN. TŁUSZCZY
IR, NMR, UV, VIS
GC,chr. Cienkowarstwowa,HPLC
Ozn. WĘGLOWODANÓW:

TLC, GC, HPLC,
MS, NMR, IR
Polarymetria, refraktometria
Przewodnosc molowa nie maleje ze spadkiem stezenia
a przewodnosc wlasciwa maleje ( wraz z rozcienczeniem)