WYKŁAD IX

WYKŁAD IX

•

Regulacja ekspresji genów

Regulacja ekspresji genów

u Eukariota

u Eukariota

Poziomy regulacji ekspresji genów

Poziomy regulacji ekspresji genów

•

Od genu do białka

Od genu do białka

•

Każdy z procesów może być regulowany

Każdy z procesów może być regulowany

•

Najważniejsze w regulacji genów to:

Najważniejsze w regulacji genów to:

•

dostępność DNA

dostępność DNA

•

transkrypcja,

transkrypcja,

•

stabilność RNA,

stabilność RNA,

•

translacja

translacja

•

stabilność białka

stabilność białka

Dostępność DNA

Dostępność DNA

•

ogranicza struktura nukleosomowa

ogranicza struktura nukleosomowa

chromatyny

chromatyny

•

-euchromatyna i heterochromatyna –

-euchromatyna i heterochromatyna –

obszary o rozluźnionej lub

obszary o rozluźnionej lub

skondensowanej strukturze

skondensowanej strukturze

metylacja DNA

metylacja DNA

•

bardzo istotne zjawisko kontrolujące

bardzo istotne zjawisko kontrolujące

dostępność do DNA

dostępność do DNA

•

Polega na przyłączenia grup metylowych

Polega na przyłączenia grup metylowych

(CH3) do niektórych nukleotydów

(CH3) do niektórych nukleotydów

(głównie nukleotydów cytozynowych).

(głównie nukleotydów cytozynowych).

•

Przyłączenie grupy metylowej do

Przyłączenie grupy metylowej do

cytozyny

cytozyny

-nie zmienia właściwości fizycznych DNA

-nie zmienia właściwości fizycznych DNA

metylacja DNA

metylacja DNA

•

-zmienia wzór grup chemicznych w

-zmienia wzór grup chemicznych w

dużej bruździe – niektóre czynniki

dużej bruździe – niektóre czynniki

transkrypcyjne nie mogą się wiązać

transkrypcyjne nie mogą się wiązać

do swojej sekwencji w DNA

do swojej sekwencji w DNA

•

-białka rozpoznające metylowany DNA

-białka rozpoznające metylowany DNA

wiążą się i aktywują inne białka, które

wiążą się i aktywują inne białka, które

zamykają chromatynę w danym

zamykają chromatynę w danym

obszarze - wyłączenie ekspresji

obszarze - wyłączenie ekspresji

genów

genów

Metylacja DNA

Metylacja DNA

•

Zwiększenie stopnia metylacji części

Zwiększenie stopnia metylacji części

regulatorowej genu może prowadzić

regulatorowej genu może prowadzić

do wyłączenia ekspresji tego genu.

do wyłączenia ekspresji tego genu.

•

Zaburzenia metylacji DNA mogą

Zaburzenia metylacji DNA mogą

prowadzić do transformacji

prowadzić do transformacji

nowotworowej komórki, (np. w wyniku

nowotworowej komórki, (np. w wyniku

wyłączenia ekspresji niektórych

wyłączenia ekspresji niektórych

genów supresorowych nowotworów).

genów supresorowych nowotworów).

Prowadzone w ciągu ostatnich lata

Prowadzone w ciągu ostatnich lata

badania wykazały, że zachodzący w

badania wykazały, że zachodzący w

komórce proces ekspresji genów

komórce proces ekspresji genów

regulowany jest w inny sposób, niż to

regulowany jest w inny sposób, niż to

się wcześniej wydawało.

się wcześniej wydawało.

•

Dotychczas panował pogląd, że o wszystkich

Dotychczas panował pogląd, że o wszystkich

procesach zachodzących w komórce decydują

procesach zachodzących w komórce decydują

białka, powstające w oparciu o informację

białka, powstające w oparciu o informację

zakodowaną w DNA.

zakodowaną w DNA.

•

Okazało się, że niezwykle istotną rolę w

Okazało się, że niezwykle istotną rolę w

regulacji ekspresji genów odgrywa również RNA.

regulacji ekspresji genów odgrywa również RNA.

- Mechanizm regulacji genów –

- Mechanizm regulacji genów –

p

p

otranskrypcyjne wyciszanie

otranskrypcyjne wyciszanie

genu

genu

•

Decydującą rolę w tym procesie odgrywają

Decydującą rolę w tym procesie odgrywają

cząsteczki

cząsteczki

dwuniciowego RNA

dwuniciowego RNA

(dsRNA -

(dsRNA -

double-stranded

double-stranded

RNA) cięte na małe

RNA) cięte na małe

odcinki (siRNA-

odcinki (siRNA-

s

s

mall

mall

i

i

nterfering

nterfering

RNA)

RNA)

przez enzymy zwane "tasakami„ (dicer).

przez enzymy zwane "tasakami„ (dicer).

•

Cząsteczki siRNA są komplementarne do

Cząsteczki siRNA są komplementarne do

pewnych odcinków komórkowego DNA.

pewnych odcinków komórkowego DNA.

•

siRNA wycisza gen przyłączając się do

siRNA wycisza gen przyłączając się do

mRNA, który ulega degradacji.

mRNA, który ulega degradacji.

Dwuniciowe siRNA mają strukturę "spinki do

Dwuniciowe siRNA mają strukturę "spinki do

włosów" - dwie komplementarne (sensowna i

włosów" - dwie komplementarne (sensowna i

antysensowna) sekwencje połączone są pętlą.

antysensowna) sekwencje połączone są pętlą.

•

Następnie siRNA zbierają się w kompleksy z

Następnie siRNA zbierają się w kompleksy z

komponentami białkowymi tworząc

komponentami białkowymi tworząc

indukowany przez RNA kompleks wyciszający

indukowany przez RNA kompleks wyciszający

- RISC (RNA

- RISC (RNA

-induced silencing complex

-induced silencing complex

).

).

•

Jedno z białek tego kompleksu

Jedno z białek tego kompleksu

kieruje siRNA do docelowego mRNA,

kieruje siRNA do docelowego mRNA,

•

gdzie aktywne RISC wiążą się do

gdzie aktywne RISC wiążą się do

komplementarnego transkryptu dzięki

komplementarnego transkryptu dzięki

interakcjom między nukleotydami siRNA a

interakcjom między nukleotydami siRNA a

mRNA.

mRNA.

RNA kompleks wyciszający - RISC

RNA kompleks wyciszający - RISC

(RNA

(RNA

-induced silencing complex

-induced silencing complex

)

)

•

Następnie dochodzi do degradacji mRNA

Następnie dochodzi do degradacji mRNA

w regionie komplementarnym do nici

w regionie komplementarnym do nici

siRNA;

siRNA;

•

Następuje rozpad mRNA, a tym samym

Następuje rozpad mRNA, a tym samym

wyciszenie genu.

wyciszenie genu.

•

Ten mechanizm wyciszania genów

Ten mechanizm wyciszania genów

nazywa się

nazywa się

interferencją zależną od

interferencją zależną od

RNA - RNAi (ang.

RNA - RNAi (ang.

RNA interference

RNA interference

).

).

Mechanizm RNAi

Mechanizm RNAi

Opisany mechanizm występuje

Opisany mechanizm występuje

powszechnie w naturze - jest używany

powszechnie w naturze - jest używany

do kontrolowania produkcji białek przez

do kontrolowania produkcji białek przez

wszystkie organizmy żywe.

wszystkie organizmy żywe.

•

Proces ten jest odwracalny i w razie

Proces ten jest odwracalny i w razie

potrzeby dany gen może zostać

potrzeby dany gen może zostać

odblokowany.

odblokowany.

•

Mniej złożone organizmy używają go

Mniej złożone organizmy używają go

do obrony przed infekcjami

do obrony przed infekcjami

wirusowymi

wirusowymi

•

i tak zwanymi skaczącymi genami,

i tak zwanymi skaczącymi genami,

czyli fragmentami DNA, które mogą

czyli fragmentami DNA, które mogą

przemieszczać się z miejsca na

przemieszczać się z miejsca na

miejsce i jeżeli znajdą się w

miejsce i jeżeli znajdą się w

nieodpowiednim punkcie –

nieodpowiednim punkcie –

upośledzają metabolizm.

upośledzają metabolizm.

Nobel za wyłączanie

Nobel za wyłączanie

pojedynczych genów

pojedynczych genów

•

Genetycy Andrew Fire i Craig Mello

Genetycy Andrew Fire i Craig Mello

zostali laureatami (2006) Nagrody Nobla

zostali laureatami (2006) Nagrody Nobla

w dziedzinie medycyny za odkrycie

w dziedzinie medycyny za odkrycie

"fundamentalnego mechanizmu

"fundamentalnego mechanizmu

kontrolowania przepływu informacji

kontrolowania przepływu informacji

genetycznej„.

genetycznej„.

•

Naukowcy ci po raz pierwszy na świecie

Naukowcy ci po raz pierwszy na świecie

opisali metodę wyciszania ekspresji genu.

opisali metodę wyciszania ekspresji genu.

Autorzy udowodnili, że do wyciszenia genu

Autorzy udowodnili, że do wyciszenia genu

należy użyć dwuniciowego RNA, a nie

należy użyć dwuniciowego RNA, a nie

pojedynczej nici.

pojedynczej nici.

•

Ich praca będzie miała

Ich praca będzie miała

zastosowanie w walce z

zastosowanie w walce z

nowotworami, infekcjami

nowotworami, infekcjami

wirusowymi, chorobami serca.

wirusowymi, chorobami serca.

Pomoże też dokładnie zbadać

Pomoże też dokładnie zbadać

funkcję każdego genu.

funkcję każdego genu.

•

„

„

Geny w DNA kodują białka, dzięki

Geny w DNA kodują białka, dzięki

którym funkcjonuje żywy organizm.

którym funkcjonuje żywy organizm.

Zanim jednak powstanie białko,

Zanim jednak powstanie białko,

informacja zostaje przepisana z DNA na

informacja zostaje przepisana z DNA na

RNA. Wędruje on do miejsca w komórce,

RNA. Wędruje on do miejsca w komórce,

w którym produkuje się białko - czyli do

w którym produkuje się białko - czyli do

rybosomów. Fire i Mello wymyślili, jak tej

rybosomów. Fire i Mello wymyślili, jak tej

wędrówce RNA przeszkodzić i w ten

wędrówce RNA przeszkodzić i w ten

sposób nie dopuścić do wytworzenia

sposób nie dopuścić do wytworzenia

białka zapisanego w genie”.

białka zapisanego w genie”.

Eksperymentalne

Eksperymentalne

potranskrypcyjne wyciszanie

potranskrypcyjne wyciszanie

genu

genu

•

Do wyciszenia ekspresji danego genu

Do wyciszenia ekspresji danego genu

używany jest dwuniciowy fragment RNA

używany jest dwuniciowy fragment RNA

(dłuższy niż 200 nukleotydów).

(dłuższy niż 200 nukleotydów).

•

Taki fragment RNA wprowadzany jest do

Taki fragment RNA wprowadzany jest do

komórki, gdzie cięty jest przez enzym Dicer

komórki, gdzie cięty jest przez enzym Dicer

(tasak), na fragmenty o długości 21-23

(tasak), na fragmenty o długości 21-23

nukleotydów – siRNA.

nukleotydów – siRNA.

•

Cząsteczki te mają właściwości

Cząsteczki te mają właściwości

specyficznego naprowadzania białek w

specyficznego naprowadzania białek w

kierunku degradacji mRNA.

kierunku degradacji mRNA.

•

Prace tegorocznych noblistów bardzo szybko doczekały

Prace tegorocznych noblistów bardzo szybko doczekały

się międzynarodowego uznania. Prestiżowy tygodnik

się międzynarodowego uznania. Prestiżowy tygodnik

"Science" w 2002 r. uznał interferencję RNA za

"Science" w 2002 r. uznał interferencję RNA za

technologię roku. Kilka miesięcy później "Fortune"

technologię roku. Kilka miesięcy później "Fortune"

pisał, że wyciszanie genów to odkrycie warte miliardy

pisał, że wyciszanie genów to odkrycie warte miliardy

dolarów.

dolarów.

•

Nagrodzeni naukowcy dowiedli, że

Nagrodzeni naukowcy dowiedli, że

ten naturalny proces można wywołać

ten naturalny proces można wywołać

w sposób sztuczny i uzbroić lekarzy i

w sposób sztuczny i uzbroić lekarzy i

genetyków w kolejne potężne

genetyków w kolejne potężne

narzędzie.

narzędzie.

Wyciszanie genów od dawna stosowane jest

Wyciszanie genów od dawna stosowane jest

w laboratoriach zajmujących się badaniem

w laboratoriach zajmujących się badaniem

funkcji poszczególnych genów.

funkcji poszczególnych genów.

•

Dopiero niedawno zaczęto wykorzystywać

Dopiero niedawno zaczęto wykorzystywać

siRNA w leczeniu licznych chorób mających

siRNA w leczeniu licznych chorób mających

podłoże genetyczne.

podłoże genetyczne.

•

Wyniki pierwszych badań przeprowadzonych

Wyniki pierwszych badań przeprowadzonych

na myszach są bardzo obiecujące.

na myszach są bardzo obiecujące.

•

Udało się, przy pomocy odpowiednio

Udało się, przy pomocy odpowiednio

przygotowanego siRNA, wyciszyć gen kodujący

przygotowanego siRNA, wyciszyć gen kodujący

apolipoproteinę B (jej nadmiar przyczynia się

apolipoproteinę B (jej nadmiar przyczynia się

do powstania zbyt dużej ilości cholesterolu).

do powstania zbyt dużej ilości cholesterolu).

•

Odkrywając interferencję RNA u roślin i

Odkrywając interferencję RNA u roślin i

zwierząt, w tym również człowieka, dotarto

zwierząt, w tym również człowieka, dotarto

do uniwersalnego systemu komórkowych

do uniwersalnego systemu komórkowych

zabezpieczeń przed wirusami czy obcym

zabezpieczeń przed wirusami czy obcym

DNA.

DNA.

•

Dzięki temu i coraz większej biegłości w

Dzięki temu i coraz większej biegłości w

inżynierii genetycznej będzie można w

inżynierii genetycznej będzie można w

ciągu kilku godzin zablokować dowolny

ciągu kilku godzin zablokować dowolny

gen.

gen.

•

Być może w końcu uda się trafić na ten

Być może w końcu uda się trafić na ten

krytyczny dla wzrostu komórek rakowych,

krytyczny dla wzrostu komórek rakowych,

nieistotny jednocześnie dla rozwoju

nieistotny jednocześnie dla rozwoju

komórek zdrowych.

komórek zdrowych.

Regulacja funkcji genów na

Regulacja funkcji genów na

poziomie transkrypcji poprzez geny

poziomie transkrypcji poprzez geny

homeotyczne

homeotyczne

:

:

•

GENY HOMEOTYCZNE – zawierają

GENY HOMEOTYCZNE – zawierają

homeobox (homeoblok), czyli sekwencję

homeobox (homeoblok), czyli sekwencję

180pz kodującą białko składające się z 60

180pz kodującą białko składające się z 60

aminokwasów i stanowi ono domenę

aminokwasów i stanowi ono domenę

wiążącą się z DNA

wiążącą się z DNA

•

Białka te mogą wiązać konkretne geny i w

Białka te mogą wiązać konkretne geny i w

ten sposób regulują ich aktywność

ten sposób regulują ich aktywność

transkrypcyjną,

transkrypcyjną,

•

białka homeodomenowe mogą również

białka homeodomenowe mogą również

regulować translację poprzez wiązanie się

regulować translację poprzez wiązanie się

z mRNA

z mRNA

Geny homeotyczne

Geny homeotyczne

są to geny mające związek z rozwojem

są to geny mające związek z rozwojem

zarodkowym,

zarodkowym,

•

prawdopodobnie one nadają

prawdopodobnie one nadają

strukturę przestrzenną różnym

strukturę przestrzenną różnym

tkankom w poszczególnych częściach

tkankom w poszczególnych częściach

rozwijającego się organizmu.

rozwijającego się organizmu.

•

Geny te wykryto po raz pierwszy u

Geny te wykryto po raz pierwszy u

Drosophila

Drosophila

•

Geny zawierające homeoboxy

Geny zawierające homeoboxy

występują także u kręgowców;

występują także u kręgowców;

•

U ludzi i u myszy są cztery

U ludzi i u myszy są cztery

zgrupowania takich genów.

zgrupowania takich genów.

•

Kolejność ułożenia tych genów na

Kolejność ułożenia tych genów na

chromosomie odpowiada

chromosomie odpowiada

kolejności regionów zarodka i

kolejności regionów zarodka i

kolejności w której te geny ulegają

kolejności w której te geny ulegają

ekspresji.

ekspresji.

Regulacja ekspresji genów

Regulacja ekspresji genów

•

Poprzez sekwencje wzmacniające

Poprzez sekwencje wzmacniające

i wyciszające transkrypcję

i wyciszające transkrypcję

,

,

•

enhacery

enhacery

•

i silencery,

i silencery,

•

które znajdują się w dużej odległości

które znajdują się w dużej odległości

od promotora- do kilku tys pz

od promotora- do kilku tys pz

Jest też możliwa ingerencja na

Jest też możliwa ingerencja na

późniejszym etapie

późniejszym etapie

Regulacja ekspresji genów na

Regulacja ekspresji genów na

poziomie translacji

poziomie translacji

•

- represja translacji przez kompleks

- represja translacji przez kompleks

zwany miRNP (micro RNA-

zwany miRNP (micro RNA-

NucleoProtein).

NucleoProtein).

•

-

-

produkty translacji działają na

produkty translacji działają na

zasadzie sprzężenia zwrotnego

zasadzie sprzężenia zwrotnego

A więc regulacja translacji może

A więc regulacja translacji może

odbywać się przez same jej

odbywać się przez same jej

produkty,

produkty,

•

najczęściej wysokie ich stężenie

najczęściej wysokie ich stężenie

działa hamująco,

działa hamująco,

•

np. synteza hemoglobiny, tzn.

np. synteza hemoglobiny, tzn.

cząstek globin zalezy od stężenia

cząstek globin zalezy od stężenia

hemu.

hemu.

•

Synteza globiny jest ograniczona syntezą

Synteza globiny jest ograniczona syntezą

hemu,

hemu,

•

a synteza hemu obecnością jego

a synteza hemu obecnością jego

składowych,

składowych,

•

np. brak Fe hamuje syntezę hemu a niskie

np. brak Fe hamuje syntezę hemu a niskie

jego stężenie hamuje syntezę globin.

jego stężenie hamuje syntezę globin.

•

Przy nedoborze hemu pojawia się białkowy

Przy nedoborze hemu pojawia się białkowy

inhibitor blokujący etap inicjacji translacji

inhibitor blokujący etap inicjacji translacji

globiny (inhibitorem jest kinaza białkowa).

globiny (inhibitorem jest kinaza białkowa).