Diagnostyka laboratoryjna

kiły

Kiła (lues, syphilis)

– układowa

choroba zakaźna, wywołana przez

Treponema pallidum ssp. pallidum

przenoszona głównie drogą

płciową.

Cechuje się wieloletnim

przebiegiem,

okresami objawowymi i

bezobjawowymi. Dotyczy każdej

tkanki. Może przebiegać

w sposób utajony, ulegać

samowyleczeniu lub postępować,

wywołując ciężkie zmiany

narządowe.

Rodzina – Sprochetaceae

Rząd – Spirochetales

Rodzaj – Treponema Borrelia
Leptospira

Gatunek – T. pallidum

T. pallidum ssp. pallidum – kiła weneryczna

T. pallidum ssp. pertenue – malinica

(frambezja)

T. pallidum ssp. endemicum – kiła
endemiczna

T. carateum – pinta

T. paraluiscuniculi – krętkowica u królików

Treponema pallidum ssp.

pallidum - taksonomia

T. pallidum ssp. pallidum -

budowa



Gram (-) bakteria spiralnego kształtu,

–

długość 6-20

–

szerokość 0,10-0,18

–

6-14 regularnych skrętów o długości 1,1



Błona zewnętrzna (brak LPS)



Błona wewnętrzna (cytoplazmatyczna)



Cienka ściana komórkowa (peptydoglikan)



3 endoflagelle w przestrzeni

periplazmatycznej

Immunogeny:

1.Białka błony

zewnętrznej
– Tromp: 15,
17, 44,5 i 47
kD

2.Poplipeptyd

y
endoflagelli
(37 kD)

3.Fosfolipidy

błony
cytoplazma-
tycznej

pallidum spp. pallidum

1. cechy biologiczne



Ubogi metabolizm



Człowiek – jedyny gospodarz



Brak wzrostu na sztucznym podłożu



Duża wrażliwość na czynniki środowiska

zewnętrznego

2. czynniki warunkujące zjadliwość



Białka o funkcji poryn i adhezyn



Białka ~ bakteryjne hemolizyny



Ruch

–

Postępowy

–

Obrotowy wokół włąsnej osi

–

Zginania

Przebieg kiły

nieleczonej

Kiła nabyta
(lues

aquisita)

Kiła wrodzona
(lues congenita)

Wczesn
a

(lues
recens)

Późna

(lues
tarda)

2 lata

3
9

L I
L II

recens

recidivans

L latens

recens

L symptomatica

L latens

recens

tygodnie

L latens
tarda

L III

L latens
tarda (80%)

L III

5
lat

Diagnostyka laboratoryjna kiły

Metody bezpośrednie



CPW (DFM)



DFA-Tp



NAA



Barwienie

pozytywowe

i negatywowe



RIT

Metody pośrednie

wykrywanie

przeciwciała klasy

IgM i IgG przeciwko

T. pallidum

–

odczyny

serologiczne

(STS)

Diagnostyka bezpośrednia –

wykrywanie T. pallidum w

ciemnym polu widzenia (CPW)

ZASADA: przyżyciowe oglądanie

T. pallidum

(morfologia i ruch: postępowy, obrotowy, zginania)

ZALETY:



metoda z wyboru do identyfikacji drobnoustroju –

sączące zmiany L I, L II



prosta, szybka, tania



diagnostyka przed powstawaniem przeciwciał

WADY:



czułość 50% przy jednorazowym badaniu (ujemny

wynik nie wyklucza kiły)



nie nadaje się do diagnostyki zmian zlokalizowanych

w jamie ustnej i odbycie (obecność

T. denticola

innych krętków saprofitycznych)

ZASTOSOWANIE: diagnostyka L I i L II

Diagnostyka bezpośrednia –

wykrywanie T. pallidum

metodą immunofluorescencji

(DFA-Tp)

ZASADA: stosowanie przeciwciał

mono-/poliklonalnych do uwidocznienia

drobnoustroju

ZALETY:



wysoka czułość i swoistość (>CPW),



badanie wydzieliny ze zmian lub

bioptatów tkankowych

WADY: wysoki koszt

ZASTOSOWANIE: diagnostyka kiły wczesnej

Diagnostyka bezpośrednia –

wykrywanie genomu T. pallidum

(NAA)

ZASADA: wykrycie DNA drobnoustroju metodami amplifikacji

kwasów nukleinowych (np. DNA-PCR, RT-PCR)

ZALETY: wykrycie DNA w różnym materiale biologicznym

(krew, płyn m-r, płyn owodniowy, narządy wewnętrzne,

węzły chłonne), bardzo wysoka czułość i swoistość

WADY:



koszt



trudność w rozróżnieniu genomu krętka żywego

(eliminowany w ciągu 120 dni) i martwego (30 dni)

ZASTOSOWANIE:



diagnostyka kiły wczesnej



kiła układu nerwowego



kiła u zakażonych HIV

Wykrywanie T. pallidum w

tkankach

barwienie srebrem

Diagnostyka bezpośrednia – test

zakaźności dla królika

ZASADA: wstrzykiwanie materiału pobranego od

pacjenta do jąder królika



orchitis luetica recens

(po 7-10 dniach)

ZALETY: czułość 100% przy wstrzyknięciu >23 krętków

(min. 2) – ‘gold standard’

WADY:



koszt



trudny technicznie

ZASTOSOWANIE (?):



kiła wczesna surowiczoujemna



kiła układu nerwowego (płyn m-r)



inne postacie kiły u chorych zakażonych HIV

Badania zalecane do pewnej

diagnozy kiły wczesnej

IUSTI/WHO (2001)

CDC (2002)



CPW (DFM)



DFA-Tp



PCR



CPW (DFM)



DFA-Tp

Historia rozwoju badań

serologicznych w kile

Epoka

Wassermanna

– 1905 – wykrycie Treponema pallidum (Schaudinn, Hoffmann)
– 1906 – zastosowanie reakcji wiązania dopełniacza (Wassermann,

Neisser, Bruck)

40s – 60s

– 1941 – zastosowanie Ag kardiolopinowego (Pangborn)
– 1946 – zastosowanie reakcji kłaczkowania – VDRL (Harris, Rosenberg,

Riedel)

– 1949 – test immobilizacji T. pallidum – TPI (Nelson, Mayer)
– 1957 – zastosowanie immunofluorescencji pośredniej - fluorescent

treponemal antibody test – FTA (Deacon)

– 1965 – zastosowanie biernej hemaglutynacji - T. pallidum

haemagglutination assay – TPHA (Rathlev)

70s - 80s

– 1975 – zastosowanie odczynu immunoenzymatycznego - treponemal

Ag based enzyme immunoassay – EIA (Stevens)

– 1985 – zastosowanie immunoblotingu (Hensel)

90s

- 1998 – zsekwencjonowanie pełnego genomu T. pallidum

(Fraser, Norris, Weinstock et al.)

Cechy idealnego testu

serologicznego do diagnostyki kiły

•

Wysoka czułość i swoistość

•

Powtarzalność

•

Przydatność do monitorowania leczenia

•

Jednoznaczny wynik po wyleczeniu

•

Umożliwienie wykrywania przeciwciał IgM

•

Możliwość automatyzacji

•

Prostota wykonania

•

Szybkość

•

Niski koszt

Van der Sluis JJ, 1992

Obecnie stosowane testy

serologiczne do diagnostyki kiły

Niekrętkowe

(nieswoiste)

‘reaginowe’,

klasyczne

Krętkowe

(swoiste)



makroskopowe

(RPR, TRUST, RST)

•

mikroskopowe

(VDRL, USR)



FTA-ABS

•

(TPI)

•

TPHA, MHA-TP, TPPA

•

EIA

•

Immunoblot

Wykrywające IgM Abs

•

IgM-FTA-ABS, 19S-IgM-FTA-ABS

•

(IgM-SPHA)

•

IgM-EIA

•

IgM-immunoblot

Przeciwciała w zakażeniu T.

pallidum

3 6

tygodnie

lata

4
7

L I

L II

L III

że

Ab przeciwkrętkowe IgG

Ab anty-

kardiolipinowe (IgM i

IgG)

Ab przeciwkrętkowe IgM

Odczyny klasyczne (niekrętkowe)

(1)

ZASADA: reakcja skłaczkowania w wyniku reakcji

Ag-Ab

ANTYGEN: kardiolipina+cholesterol+lecytyna

PRZECIWCIAŁA: IgM i IgG skierowane przeciwko

Lipidowemu Ag krętka

2. Lipidom błon komórkowych (mitochondrialnych)

gospodarza uwalnianych podczas destrukcji tkanek (AutoAb)

ZASTOSOWANIE:



testy skryningowe do diagnostyki kiły nabytej



monitorowanie leczenia (ilościowe)



diagnostyka kiły układu nerwowego i kiły wrodzonej

(jakościowe i ilościowe)

Odczyny klasyczne (2) -

modyfikacje



Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)



Unheated Serum Reagin test (USR)



Rapid Plasma Reagin (card) test (RPR)



Reagin Screen Test (RST)



Toluidin Red Unheated Serum Tests (TRUST)



VDRL-EIA



Syntetyczny Ag VDRL

Odczyny klasyczne (3)



Czułość: 80 % (74-87) L I, 100% L II,

80% (71-100) L lat. recens, 71% (37-94) L

tarda



Swoistość: 98%

ZALETY:



Łatwe



Niedrogie



Odczynniki i metody są wystandaryzowane



Miano koreluje z aktywnością choroby

WADY:



niska czułość w kile późnej oraz kile układu

nerwowego



wyniki F(+) i F (-)

Fałszywe wyniki odczynów

klasycznych (niekrętkowych)

Dodatnie

Ujemne



reakcje

biologicznie
mylne (BFP)



niektóre osoby



błędy

techniczne (T)



reakcja prozonalna:

hamowanie
kłaczkowania
spowodowane
wysyceniem miejsc
antygenowych przez
nadmiar Ab (1-2%
pacjentów z L II) –
uniknięcie –
rozieńczenie
surowicy

Odczyny biologicznie mylne

(BFP)

Ostre (



miesięcy)



Infekcje



HIV



Odczyny

poszczepienne



Ciąża

Przewlekłe (>6

miesięcy)



Choroby

autoimmunologiczne (SLE,

zespół antyfosfolipidowy,

rzs, CTD)



Wiek>70 lat



Choroby nowotworowe



Trąd



Marskość wątroby

PRZYCZYNA: sytuacje, w których z różnych
przyczyn uwalniany jest mitochondrialny Ag
lipidowy

Odczyny krętkowe (1)

Fluorescent treponemal antibody

absorbtion (FTA-Abs) test

ZASADA: uwidacznianie Ab p/krętkowych po ich

związaniu z Ag i znakowaną fluoresceiną

surowicą antyglobulinową

ANTYGEN: liofilizowana zawiesina

T. pallidum

(szczep Nicholsa); do preabsorbcji: ultrasonat

T. phagedenis

(szczep Reitera)

PRZECIWCIAŁA: IgG, IgM, IgA p/białkom krętka

ZASTOSOWANIE: test potwierdzający w kile –

najwcześniejszy okres kiły

Odczyny krętkowe (2)

Treponema pallidum

haemaglutination assay (TPHA)

ZASADA: hemaglutynacja krwinek barana

opłaszczonych Ag po związaniu z Ab

p/krętkowymi obecnymi w surowicy chorego

ANTYGEN: ultrasonat

T. pallidum

(szep

Nicholsa)

PRZECIWCIAŁA: IgG i IgM

ZASTOSOWANIE: test skryningowy

i potwierdzenia w kile

Odczyny krętkowe (3)

Enzyme immunoassay for T. pallidum (EIA)

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

ZASADA: reakcja barwna pomiędzy znakowaną

enzymem surowicą antyglobulinową związaną

z Ab (lub Ag) a substratem, mierzona

spektrofluorometrycznie

ANTYGEN: ekstrakt lub ultrasonat T. pallidum

(Nichols), rekombinowane Ag (37 kD, 42 kD),

syntetyczne

PRZECIWCIAŁA: IgG, IgM

ZASTOSOWANIE:



test skryningowy



potwierdzenia w kile



monitorowanie

leczenia (TmpA)

Odczyny krętkowe (4)

Immunoblot dla T. pallidum

ZASADA: wykrycie swoistych przeciwciał

przeciwko Ag białkowym

T. pallidum

rozłożonym na pasku nitrocelulozowym

ANTYGEN: 15.5, 17, 44,5 47 kD

PRZECIWCIAŁA: IgG, IgM

ZASTOSOWANIE: test potwierdzenia w kile

Odczyny krętkowe (5)

Test unieruchamiania krętków –

TPI (Nelsona-Mayera)

ZASADA: unieruchamianie (immobilizacja)

żywych, patogennych krętków w obecności

czynnego dopełniacza; wynik - %

unieruchomionych krętków:

81-100% - dodatni,

51-80% - sł. dodatni,

21-50% wątpliwy,



20 – ujemny

ANTYGEN: żywe

T. pallidum

(szczep Nicholsa)

PRZECIWCIAŁA: immobilizyny IgG

Testy wykrywające przeciwciała

IgM

• IgM –FTA-ABS (konjugat anty-IgM),

19S – IgM-FTA-ABS (tylko IgM z surowicy)

• IgM solid phase haemadsorption assay

(SPHA), TP-IgM-HA

• IgM-capturing ELISA
• IgM- immunoblot dla T. pallidum

ZASTOSOWANIE:

•

diagnostyka najwcześniejszego okresu kiły

• ocena aktywności choroby

• diagnostyka kiły wrodzonej

• diagnostyka kiły układu nerwowego

Porównanie odczynów

serologicznych stosowanych w

kile

VDRL

TPI

FTA-

ABS

TPHA

EIA

Czułość (%)

71-100

58-100

99-100

89-100

98-

100

99-100

Swoistość (%)

98.0

99.0

99.5

99.6

99.9

Monitorowanie

leczenia

Ujemny wynik po

leczeniu

+/-

+/-

Wykrywanie IgM

Możliwość

automatyzacji

-/+

Prostota wykonania

Szybkość

wykonania

+/-

Niski koszt

-/+

+/-

+/-

+/-

Fałszywe wyniki odczynów

krętkowych

Dodatnie

– Ciąża
– Infekcja HIV
– Choroby

autoimmunologicz

– Krętkowice

• Krętkowice

endemiczne

• B. burgdorferi

Ujemne

– Infekcja HIV

Konsekwecje niedoskonałości

testów serologicznych

•

Wyniki fałszywie ujemne i fałszywie

dodatnie

•

Dwustopniowa diagnostyka

•

Trudna interpretacja:

•

Infekcja aktywna/infekcja przebyta

•

Infekcja trwająca długo/krótko

•

Brak definitywnego testu

świadczącego o wyleczeniu

•

Opóźniona ocena wyników leczenia

Diagnostyka serologiczna kiły

(IUSTI/WHO, 2001)

TEST PRZESIEWOWY: TPHA/MHA-TP/TPPA (i

VDRL/RPR)

LUB

krętkowy IgG-EIA

Podejrzenie L I : FTA-ABS LUB krętkowy IgM-EIA

(+)

TEST WERYFIKACYJNY: FTA-ABS

LUB

Treponemal EIA-IgG

LUB

IgG-immunoblot dla T. pallidum

jeśli podejrzewany F(+)

TPHA/FTA-ABS

Goh, van Voorst Vader

Goh, van Voorst Vader, 2001

Ocena aktywności choroby i efektów leczenia: ilościowy

VDRL/RPR

Serologiczna diagnostyka kiły

(CDC, 2002)

VDRL/RPR

Jeden z testów krętkowych (np. FTA-ABS, TP-PA)

Ocena aktywności choroby i efektów leczenia: ilościowy

VDRL/RPR

Zachowanie się odczynów

serologicznych w kile nieleczonej

3 6

tygodnie

lata

4
7

L I

L II

L III

że

testy krętkowe-IgG

VDRL/RPR

testy krętkowe-IgM

Zachowanie się odczynów

serologicznych w kile leczonej

3 6

tygodnie

lata

4 7

L I

L II

L III

że

Testy krętkowe IgG

VDRL/RPR

Testy krętkowe IgM

leczenie

Przyczyny

surowiczooporności

i nawrotu serologicznego



Surowiczooporność – trwałe utrzymywanie się (+)

odczynu VDRL po leczeniu

–

Przetrwanie krętków, które utraciły zjadliwość

–

W kile wczesnej – reinfekcja, kiła układu nerwowego

–

W kile późnej - ew. badania wielospecjalistyczne, badanie

płynu m-r



Nawrót serologiczny – powtórne wystąpienie (+)

odczynów serologicznych, które uległy negatywizacji

lub wyraźny wzrost ich miana, jeśli uległo obniżeniu

pod wpływem leczenia

–

W kile wczesnej – reinfekcja

–

W kile późnej – rozwój zmian narządowych lub ew. reinfekcja

–

Niepowodzenie lecznicze

Zachowanie się testów

serologicznych w niepowodzeniu

leczniczym i reinfekcji

3 6

tygodnie

lata

4 7

L I

L II

L III

że

VDRL

Testy krętkowe IgM

leczenie

niepowodzenie lecznicze

reinfekcja

Interpretacja odczynów

serologicznych

VDRL/RP

Testy

krętkowe

Okres kiły

Konieczno

ść

leczenia

IgM

IgG

BFP, fałszywie (+) VDRL

Okres inkubacji lub kiła

wykluczona

+/-

- lub -/+

-/+

L I

Dowolny okres kiły

nieleczonej lub leczonej

niedawno, reinfekcja,

niepowodzenie

lecznicze

+/-

Kiła poźna

+/-

Kiła leczona

Testy serologiczne nowej generacji

Enzyme linked immunospot assay (ELISPOT) -

wykrywający komórki produkujące swoiste
przeciwciałe anty-T. pallidum (Antibody
secreting cells - ASC) (Tabidze et al. 1999)

–>3 ASCs swoiste dla Tpp17 /10

PBMC

–Zalety ASCs:

• Turnover ASCs szybszy niż IgM

• Nie przechodzą przez łożysko

• Niewykrywalne 8-16 dni po skutecznym leczeniu

–zastosowanie

• Diagnostyka L I, L II (czułość ~ RPR)

• Szybka ocena skuteczności leczenia

• Diagnostyka kiły wrodzonej

Line immunoassay

(INNOLIA SYPHILIS

KIT)

(Ebel et al. 2000,

Hagedorn et al. 2002)

ZASADA: wykrycie przeciwciał przeciwko
Ag T. pallidum rekombinowanym (TpN47,
TpN17, TpN15) i syntetycznemu
peptydowi (TmpA)

ZALETY:

•

czułość i swoistość 99,6%,

•

łatwe wykonanie i odczyt

ZASTOSOWANIE: test potwierdzenia w
kile

(-)
(+)

Przeciwciała w kile wrodzonej

poród

3 6 9 12
miesiące

Matczyne przeciwciała
swoiste IgG

Matczyne przeciwciała
antykardiolipinowe

Przeciwciała IgG
dziecka

Przeciwciała IgM
dziecka

Kiła wrodzona – kryteria

rozpozanania pewnego

IUSTI/WHO, 2001

CDC, 2002

Wykrycie

drobnoustroju (w

łożysku, zmianach

skórnych/śluzówkowyc

h, materiale

autopsyjnym)

•

Zmiany kliniczne typowe dla

kiły wrodzonej

•

miano odczynów

klasycznych u dziecka co

najmniej 4x wyższe niż u

matki

lub

•

Wykrycie drobnoustroju

(w łożysku, zmianach

skórnych/śluzówkowych,

materiale autopsyjnym) –

DFA, DFM

Document Outline

Slide 1
Slide 2
Slide 3
Slide 4
Slide 5
Slide 6
Slide 7
Slide 8
Slide 9
Slide 10
Slide 11
Slide 12
Slide 13
Slide 14
Slide 15
Slide 16
Slide 17
Slide 18
Slide 19
Slide 20
Slide 21
Slide 22
Slide 23
Slide 24
Slide 25
Slide 26
Slide 27
Slide 28
Slide 29
Slide 30
Slide 31
Slide 32
Slide 33
Slide 34
Slide 35
Slide 36
Slide 37
Slide 38
Slide 39
Slide 40
Slide 41
Slide 42
Slide 43
Slide 44
Slide 45
Slide 46
Slide 47

diagnostyka laboratoryjna kiły

Document Outline