Nowe narzędzia w

Nowe narzędzia w

diagnostyce

diagnostyce

laboratoryjnej

laboratoryjnej

Jerzy Naskalski

Jerzy Naskalski

Zakład Diagnostyki Collegium Medicym UJ

Zakład Diagnostyki Collegium Medicym UJ

Diagnostyka to pojęcie wywodzące

Diagnostyka to pojęcie wywodzące

się od greckiego słowa „

się od greckiego słowa „

gnosis

gnosis

”

”

czyli wiedza

czyli wiedza

Diagnoza oznacza

Diagnoza oznacza

pozyskiwanie wiedzy o

pozyskiwanie wiedzy o

chorym i jego

chorym i jego

dolegliwościach

dolegliwościach

Koncepcja narządowa:

Koncepcja narządowa:

„

„

Choroba jest to

Choroba jest to

strukturalnie zdefiniowane

strukturalnie zdefiniowane

uszkodzenie tkanek lub

uszkodzenie tkanek lub

narządów”

narządów”

Podstawy diagnostyki

Podstawy diagnostyki

narządowej

narządowej

Badania laboratoryjne jest łatwo dostępnym

Badania laboratoryjne jest łatwo dostępnym

źródłem informacji na temat procesów

źródłem informacji na temat procesów

zachodzących w komórkach różnych

zachodzących w komórkach różnych

narządów

narządów

Narządowe profile badań

Narządowe profile badań

laboratoryjnych oceniających

laboratoryjnych oceniających

aktywności enzymów, obecność

aktywności enzymów, obecność

białek i tworzenie produktów

białek i tworzenie produktów

mogą być podstawą diagnozy

mogą być podstawą diagnozy

Koncepcja pośredniej biopsji

Koncepcja pośredniej biopsji

biochemicznej

biochemicznej

(Carmen, Wróblewski, Ledue

(Carmen, Wróblewski, Ledue

1959)

1959)

Każde uszkodzenie narządu

Każde uszkodzenie narządu

manifestuje się poprzez

manifestuje się poprzez

charakterystyczny obraz zmiany

charakterystyczny obraz zmiany

składników płynów ustrojowych

składników płynów ustrojowych

i/lub wydzielin, do których

i/lub wydzielin, do których

przedostają się produkty

przedostają się produkty

uszkodzenia komórek

uszkodzenia komórek

Markery uszkodzeń

Markery uszkodzeń

narządowych

narządowych



Uszkodzenie narządu zwykle prowadzi

Uszkodzenie narządu zwykle prowadzi

do wydzielenia do płynów

do wydzielenia do płynów

śródtkankowych i do krwi substancji

śródtkankowych i do krwi substancji

normalnie we krwi nieobecnych

normalnie we krwi nieobecnych



Jeżeli uszkodzenie narządu upośledza

Jeżeli uszkodzenie narządu upośledza

jego funkcję, następuje zaburzenie

jego funkcję, następuje zaburzenie

fragmentu homeostazy

fragmentu homeostazy

biochemicznej, kontrolowanej przez

biochemicznej, kontrolowanej przez

narząd

narząd

Założenia koncepcji

Założenia koncepcji

diagnostyki opartej o

diagnostyki opartej o

oznaczanie markerów

oznaczanie markerów

procesów chorobowych (1)

procesów chorobowych (1)

Każdy narząd wytwarza

Każdy narząd wytwarza

charakterystyczny dla

charakterystyczny dla

siebie profil białek

siebie profil białek

(markerów),

(markerów),

których ilość i

których ilość i

własności zależą od stanu

własności zależą od stanu

funkcjonalnego narządu

funkcjonalnego narządu

Założenia koncepcji

Założenia koncepcji

diagnostyki opartej o

diagnostyki opartej o

oznaczanie markerów

oznaczanie markerów

procesów chorobowych

procesów chorobowych

Stwierdzenie obecności

Stwierdzenie obecności

markera może być

markera może być

podstawą diagnozy

podstawą diagnozy

Wykrywanie zmiany krytycznej

Wykrywanie zmiany krytycznej

markera (glikemii) przy

markera (glikemii) przy

monitorowaniu wrównania

monitorowaniu wrównania

cukrzycy

cukrzycy

Stare metody

Stare metody

poszukiwania markerów

poszukiwania markerów

narządowych

narządowych



Enzymy pochodzenia narządowego

Enzymy pochodzenia narządowego

(np.. wątrobowe , sercowe,

(np.. wątrobowe , sercowe,

trzustkowe, kostne)

trzustkowe, kostne)



Zmiany białkowe obserwowane we

Zmiany białkowe obserwowane we

krwi i innych płynach (elektroforeza

krwi i innych płynach (elektroforeza

na żelach, immunoelektroforeza)

na żelach, immunoelektroforeza)



Zmiany własności biologicznych krwi

Zmiany własności biologicznych krwi

(lub płynów) np.. Szybkość opadania

(lub płynów) np.. Szybkość opadania

krwinek, aglutynacja, hemoliza)

krwinek, aglutynacja, hemoliza)

Schemat wykrywania

Schemat wykrywania

niewydolnośći skurczowej serca

niewydolnośći skurczowej serca

oparty o badanie białkowego

oparty o badanie białkowego

markera:

markera:

BNP

BNP



Peptyd

Peptyd

natriuret

natriuret

y

y

c

c

zny typu

zny typu

A

A

(

(

A

A

NP)

NP)

w stężeniu > 7

w stężeniu > 7

μ

μ

g/L

g/L

umożliwia

umożliwia

wykrycie

wykrycie

dysfun

dysfun

k

k

c

c

ji skurczowej

ji skurczowej

le

le

wego

wego

przedsionka serca

przedsionka serca



Obecność peptydu

Obecność peptydu

natriuret

natriuret

y

y

c

c

znego

znego

typu

typu

B

B

(

(

B

B

NP)

NP)

wskazuje na skutki

wskazuje na skutki

dysfun

dysfun

k

k

c

c

ji skurczowej

ji skurczowej

le

le

wego

wego

przedsionka i lewej komory serca, w

przedsionka i lewej komory serca, w

postaci przebudowy (remodelingu)

postaci przebudowy (remodelingu)

struktury mięśnia

struktury mięśnia



Smith et al. BMJ 2000; 320: 906

Smith et al. BMJ 2000; 320: 906

.

.

Schemat wykrywania raka

Schemat wykrywania raka

stercza

stercza

oparty o badanie

oparty o badanie

markerów białkowych

markerów białkowych

PSA i

PSA i

fPSA

fPSA

Nowe metody

Nowe metody

poszukiwania markerów

poszukiwania markerów

narządowych

narządowych



Badanie obecności nowych białek

Badanie obecności nowych białek

narządowych metodami ultraczułej

narządowych metodami ultraczułej

detekcji

detekcji



Badanie zmian strukturalnych białek

Badanie zmian strukturalnych białek

pochodzenia narządowego, również

pochodzenia narządowego, również

fragmentów nie-peptydowych)

fragmentów nie-peptydowych)



Ocena własności biologicznych

Ocena własności biologicznych

zidentyfikowanych białek (czynniki

zidentyfikowanych białek (czynniki

wzrostu, inhibitory, nekrohormony,

wzrostu, inhibitory, nekrohormony,

cytokiny)

cytokiny)

Elektroforeza

Elektroforeza

kapilarna

kapilarna



Metoda ta łączy cechy elektroforezy

Metoda ta łączy cechy elektroforezy

wolnej i elektroforezy przebiegającej na

wolnej i elektroforezy przebiegającej na

polarnym podłożu. Za pomocą

polarnym podłożu. Za pomocą

elektroforezy kapilarnej można rozdzielać i

elektroforezy kapilarnej można rozdzielać i

ilościowo oznaczać zarówno niewielkie

ilościowo oznaczać zarówno niewielkie

peptydy jak również wiele białek o dużych

peptydy jak również wiele białek o dużych

masach cząsteczkowych. Metoda łączy w

masach cząsteczkowych. Metoda łączy w

sobie dwa dotychczas rozdzielne etapy

sobie dwa dotychczas rozdzielne etapy

badania: badanie jakościowe zmian składu

badania: badanie jakościowe zmian składu

białkowego i ocenę ilościową

białkowego i ocenę ilościową

poszczególnych białek w tej samej próbce.

poszczególnych białek w tej samej próbce.

Elektroforeza

Elektroforeza

kapilarna (Zasada

kapilarna (Zasada

metody )

metody )



Rozdział białek w roztworze buforowym odbywa się

Rozdział białek w roztworze buforowym odbywa się

w cienkich i długich (około 300 mm) kapilarach

w cienkich i długich (około 300 mm) kapilarach

kwarcowych. Proces wędrowania białek w polu

kwarcowych. Proces wędrowania białek w polu

elektrycznym modyfikowany jest poprzez ruch

elektrycznym modyfikowany jest poprzez ruch

elektroosmotyczny fazy płynnej i oddziaływanie

elektroosmotyczny fazy płynnej i oddziaływanie

ujemnie naładowanych kwarcowych ścian kapilary.

ujemnie naładowanych kwarcowych ścian kapilary.



Substancje rozpuszczone przemieszczają się

Substancje rozpuszczone przemieszczają się

stosownie do ich ładunku oraz kształtu cząsteczki i

stosownie do ich ładunku oraz kształtu cząsteczki i

stopnia hydrofobowości od „początku do końca”

stopnia hydrofobowości od „początku do końca”

kapilary, gdzie jest źródło światła UV i detektor

kapilary, gdzie jest źródło światła UV i detektor

wykrywający obecność poszczególnych białek w

wykrywający obecność poszczególnych białek w

buforze wypływającym z kapilary.

buforze wypływającym z kapilary.

Porównanie rozdział białek moczu

Porównanie rozdział białek moczu

patologicznego za pomocą

patologicznego za pomocą

elektroforezy na żelu agarozowym i

elektroforezy na żelu agarozowym i

elektroforezy kapilarnej (

elektroforezy kapilarnej (

białkomocz

białkomocz

selektywny

selektywny

)

)

Porównanie rozdział białek moczu

Porównanie rozdział białek moczu

patologicznego za pomocą

patologicznego za pomocą

elektroforezy na żelu agarozowym i

elektroforezy na żelu agarozowym i

elektroforezy kapilarnej (

elektroforezy kapilarnej (

białkomocz

białkomocz

nie

nie

selektywny

selektywny

)

)

Porównanie oceny stężenia białek

Porównanie oceny stężenia białek

surowicy za pomocą rozdziału

surowicy za pomocą rozdziału

metodą elektroforezy kapilarnej i

metodą elektroforezy kapilarnej i

metodami tradycyjnymi

metodami tradycyjnymi

Pojęcie proteomu w

Pojęcie proteomu w

biologii i medycynie

biologii i medycynie

(2)

(2)



Białka związane z danym narządem lub

Białka związane z danym narządem lub

tkanką nazywamy proteomem.

tkanką nazywamy proteomem.



Termin „proteom” przyjęty jako

Termin „proteom” przyjęty jako

„białkowy odpowiednik genomu” (

„białkowy odpowiednik genomu” (

ang:

ang:

protein complement of the genome

protein complement of the genome

),

),

obecnie określa wszystkie białka danej

obecnie określa wszystkie białka danej

tkanki, komórek, organelli komórkowych

tkanki, komórek, organelli komórkowych

lub płynów pozakomórkowych (a w tym

lub płynów pozakomórkowych (a w tym

osocza, płynu śródtkanowego i moczu)

osocza, płynu śródtkanowego i moczu)

Schemat nowego podejścia do

Schemat nowego podejścia do

poszukiwania markerów

poszukiwania markerów

choroby

choroby

Uwarunkownie genetyczne

Uwarunkownie genetyczne

Odziaływania zewnętrzne

Odziaływania zewnętrzne

Zmiany struktury białek

Zmiany struktury białek

Uszkodzenie narządu

Uszkodzenie narządu

Etapy występowania

Etapy występowania

poszczególnych rodzajów

poszczególnych rodzajów

markerów

markerów

Genomika (

Genomika (

mutacje

mutacje

)

)

Odziaływania zewnętrzne

Odziaływania zewnętrzne

(

(

aktywacja genów tworzenie mRNA

aktywacja genów tworzenie mRNA

)

)

Proteomika

Proteomika

(

(

synteza zmodyfikowanych białek

synteza zmodyfikowanych białek

)

)

Metabolomika

Metabolomika

(

(

tworzenie charaterystycznych produktów

tworzenie charaterystycznych produktów

)

)

Pojęcie proteomu w

Pojęcie proteomu w

biologii i medycynie

biologii i medycynie



Organizm ludzki zawiera ok.. 40 tys.

Organizm ludzki zawiera ok.. 40 tys.

Genów natomiast wytwarza ok. 400 tys -

Genów natomiast wytwarza ok. 400 tys -

500 tysięcy odmiennych strukturalnie

500 tysięcy odmiennych strukturalnie

białek.

białek.



Zatem, znajomość ekspresji genów nie

Zatem, znajomość ekspresji genów nie

dostarcza wystarczających informacji o

dostarcza wystarczających informacji o

stanie komórek i tkanek, i dla pełnego

stanie komórek i tkanek, i dla pełnego

zrozumienia procesów fizjologicznych i

zrozumienia procesów fizjologicznych i

patologicznych związanych ze strukturą i

patologicznych związanych ze strukturą i

funkcją białek.

funkcją białek.

Zasady funkcjonowania

Zasady funkcjonowania

proteomiki

proteomiki



Powstawanie funkcjonalnych białek w

Powstawanie funkcjonalnych białek w

organizmie, poza samą syntezą łańcuchów

organizmie, poza samą syntezą łańcuchów

polipeptydowych obejmuje inne jeszcze

polipeptydowych obejmuje inne jeszcze

procesy, takie jak

procesy, takie jak

łączenie łańcuchów

łączenie łańcuchów

polipeptydowych

polipeptydowych

, ich

, ich

modyfikację

modyfikację

chemiczne

chemiczne

polegające na przyłączaniu

polegające na przyłączaniu

reszt

reszt

polisacharydowych

polisacharydowych

,

,

siarczanowych

siarczanowych

,

,

izoprenylowych i innych.

izoprenylowych i innych.



Procesy te mogą ulegać nasileniu,

Procesy te mogą ulegać nasileniu,

hamowaniu lub dewiacji w przebiegu

hamowaniu lub dewiacji w przebiegu

choroby

choroby

Zasady funkcjonowania

Zasady funkcjonowania

proteomiki

proteomiki



Proteomika zajmuje się

Proteomika zajmuje się

wykrywaniem form białek

wykrywaniem form białek

charakterystycznych dla różnych

charakterystycznych dla różnych

stanów funkcjonalnych komórek

stanów funkcjonalnych komórek



Wymaga to poszukiwania i

Wymaga to poszukiwania i

badania specyficznych produktów

badania specyficznych produktów

komórkowych wśród bardzo dużej

komórkowych wśród bardzo dużej

ilości innych (matrycowych) białek

ilości innych (matrycowych) białek

Metody analityczne w

Metody analityczne w

proteomice

proteomice



Elektroforeza dwuwymiarowa na żelu

Elektroforeza dwuwymiarowa na żelu

poliakrylamidowym (2D PAGE)

poliakrylamidowym (2D PAGE)



Spektrometria masowa z jonizacją (ESI)

Spektrometria masowa z jonizacją (ESI)



Spektrometria masowa z

Spektrometria masowa z

jonizacja/desorpcją laserową

jonizacja/desorpcją laserową

wspomaganą matrycą (MALDI)

wspomaganą matrycą (MALDI)



Spektrometria masowa z wspomaganą

Spektrometria masowa z wspomaganą

powierzchniową jonizacją laserem (SELDI)

powierzchniową jonizacją laserem (SELDI)

Scrining proteomiczny

Scrining proteomiczny



Posługujące się metodami o

Posługujące się metodami o

wysokiej rodzielczości

wysokiej rodzielczości

analizujemy równocześnie

analizujemy równocześnie

ilościowo i jakościowo wszystkie

ilościowo i jakościowo wszystkie

białka uwidocznione na rozdziale

białka uwidocznione na rozdziale

Bioinformatyka

Bioinformatyka

Jest osobną dziedziną nauki, która zajmuje się

Jest osobną dziedziną nauki, która zajmuje się

zarządzaniem ogromną ilością danych

zarządzaniem ogromną ilością danych

uzyskiwanych metodami proteomiki.

uzyskiwanych metodami proteomiki.

Archiwizacja - tworzenie baz danych

Archiwizacja - tworzenie baz danych



Analiza danych. sekwencji aminokwasowych

Analiza danych. sekwencji aminokwasowych

przetłumaczonych” z kwasów nukleinowych

przetłumaczonych” z kwasów nukleinowych

lub otrzymanych doświadczalnie

lub otrzymanych doświadczalnie



Zarządzanie dostępem przez Internet do

Zarządzanie dostępem przez Internet do

bezpłatnych i komercyjnych archiwów

bezpłatnych i komercyjnych archiwów

informacji o budowie i strukturach pierwszo,

informacji o budowie i strukturach pierwszo,

drugo i trzecio-rzędowych białek i o ich

drugo i trzecio-rzędowych białek i o ich

funkcji i interakcjach z innymi związkami w

funkcji i interakcjach z innymi związkami w

komórce

komórce

Bazy sekwencji

Bazy sekwencji

peptydowych/białkowy

peptydowych/białkowy

ch

ch

Swiss-Prot:

Swiss-Prot:

www.expasy.org/sprot

www.expasy.org/sprot

TrEMBL: www.ebi.ac.uk/trembl

TrEMBL: www.ebi.ac.uk/trembl

UniProt:

UniProt:

www.uniprot.org

www.uniprot.org

RefSeq

RefSeq

:

:

www.ncbi.nih.gov

www.ncbi.nih.gov

IPI: www.ebi.ac.uk/IPI

IPI: www.ebi.ac.uk/IPI

Bazy struktur i funkcji białek

Bazy struktur i funkcji białek

(Protein Data Bank)

(Protein Data Bank)

www.rcsb.org/pdb

www.rcsb.org/pdb

InterPro

InterPro

www.ebi.ac.uk/interpro

www.ebi.ac.uk/interpro

Porównywanie sekwencji peptydów /

Porównywanie sekwencji peptydów /

białkek

białkek

(algorythm BLAST)

(algorythm BLAST)

www.ncbi.nih.gov/blast

www.ncbi.nih.gov/blast

;www.ebi.ac.uk/blast

;www.ebi.ac.uk/blast



Koniec

Koniec