Ćwiczenie XII

Ćwiczenie 1.
Temat: Otrzymywanie kwasów nukleinowych
Wykonanie:
Do probówki wirowej na 10 ml pobrać 3 ml soku z kapusty , dodać 3 ml 90% fenolu, zatkać szczelnie probówkę korkiem i wytrząsać przez 10 minut. Powstałą zawiesinę odwirować przy 4 tys obrotach/ min. W ciągu 15 minut. Po odwirowaniu zebrać ostrożnie górną fazę wodną przy pomocy pipety do innej wirówki na 10 ml. Dolną fazę enolową wylać wprost do odpływu zlewu i umyć ostrożnie. Do probówki wirowej z zebraną fazą wodną dodać 5 ml 96% etanolu, dokładnie wymieszać i odstawić na 20 min. Po tym czasie zaweisinę odwirować przez 15 minut. Supernatant zlać zaś osadu używać do dalszych ćwiczeń, jako preparat RNA.


Ćwiczenie 2.
Temat: Hydroliza kwasów nukleinowych.
Wykonanie:

Osad RNA rozpuścić w 2 ml 0,1 M roztworu NaOH, przenosząc go ilościowo do kalibrowanej probówki. Zatknąć probówkę korkiem i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po ochłodzeniu roztwór uzupełnić 0,01 M roztworem HCl do 20 ml. Dokładnie wymieszać.
Wynik:
Uzyskany produkt jest zobojętnionym hydrolizatem RNA z domieszka DNA.

Ćwiczenie 3.
Temat: Oznaczanie kolorymetryczne RNA
Wykonanie:
Sporządzić odczynnik orcynolowy. Do 2 probówke pobrać po 2 ml hydrolizatu RNA otrzymanego w ćwiczeniu 2, dodać po 1 ml wody destylowanej i po 3ml odczynnika orcynolowego. Równolegle wykonać próbę odczynnikową ( 3ml H20 + 3 ml odczynnika orcynolowego). Zawartość wszystkich probówek wymieszać po czym probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 20 minut. Po ostudzeniu odczytać absorbancję przy 660nm dla prób badanych wobec próby odczynnikowej.

Wyniki:

1. 0,481

2. 0,492
Wniosek:

Wartość absorbancji wynosi około 0,487 nm.





Ćwiczenie 4.
Temat: Wykonanie krzywej kalibracyjnej dla RNA
a/ HYDROLIZA WZORCOWEGO RNA: 2ml wzorcowego roztworu RNA w NaOH( 1,0mg/ml), podać hydrolizie przez ogrzewanie we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Hydrolizat przenieść ilościowo do kalibrowanej probówki i uzupełnić 0,1 M roztworem HCl do 20 ml. W Tak otrzymanym hydrolizacie stężenie wynosi 100µg/ml.

b/ KRZYWA KALIBRACYJNA: Z hydrolizatu wzorcowego RNA w NaOH i 0,01 M HCl sporządzić po 2 ml roztworu o następujących stężeniach: 0µm/ml; 20 µm/ml; 40 µm/ml; 60 µm/ml; 80 µm/ml; 100 µm/ml.
Przeprowadzić reakcję barwną z odczynnikiem orcynolowym z ćwiczenia 3. Na podstawie zmierzonych absorbancji przy 660 nm dla badanych prób wykreślić krzywą kalibracyjną.

Na podstawie krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie RNA w badanym preparacie.

Wniosek:

Stężenie RNA w badanym preparacie wynosi 112 μg/ml.

Ćwiczenie 5.
Temat: Oznaczanie kolorymetryczne DNA
Wykonanie:
Przygotować 6 probówek z korkami. Do probówki 1 i 2 odmierzyć po 1 ml 0,01 M HCl (próby zerowe) a do probówek 3 i 4 dodać po 0,5 ml M HCl i po 0,5 ml wzorcowego roztworu DNA o stężeniu 200 µm/ml a do probówki 5 i 6 po 1 ml hydrolizatu otrzymanego w ćwiczeniu 2 . Do wszystkich probówek dodac po 2 ml odczynnika Dischego i wymieszać. Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut po czym ostudzić. Zmierzyć absorbancje dla prób wzorcowych i badanych wobec próby zerowej.
Wyniki:

Próby wzorcowe: 0,187; 0,201; średnia: 0,194

Próby badane: 0,420; 0,475; średnia: 0,448

Obliczenia:

0,194 → 200 μg/ml

0,448 → x

x = 461,86 μg/ml

Wniosek:

Stężenie DNA w badanej próbie wynosi 461,86 μg/ml.

Na zaliczenie sprawozdania trzeba przeliczyć zawartość RNA i DNA w soku z kapusty i w świeżych liściach. Nie mam zielonego pojęcia jak to zrobić. :/