Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu,

Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy

Wydział Lekarski

Katedra Biofizyki, Zakład Fizyki Medycznej

Karolina Jakołcewicz

Nr albumu: 217507

BADANIE WŁAŚCIWOŚCI ANTYOKSYDACYJNYCH WYBRANYCH FLAWONOIDÓW METODĄ SPEKTROSKOPII OPTYCZNEJ

PRACA MAGISTERSKA

NA KIERUNKU BIOTECHNOLOGIA

wykonana pod kierunkiem

dr hab. Stefana Kruszewskiego, prof. UMK

Katedra Biofizyki, Zakład Fizyki Medycznej

TORUŃ 2012

Pracę przyjmuję i akceptuję Potwierdzam złożenie pracy dyplomowej

............................................ .............................................................

data i podpis opiekuna pracy data i podpis pracownika dziekanatu

Panu mgr Tomaszowi Wybranowskiemu

składam serdeczne podziękowania

za pomoc przy opracowaniu wyników,

opiekę oraz poświęcony mi czas.

Gorące podziękowania pragnę przekazać

Profesorowi Stefanowi Kruszewskiemu

za wyrozumiałość oraz udzielenie

mi wielu życzliwych rad.

Wykaz skrótów

AAPH - 2,2'-diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorku

ATP - adenozynotrójfosforan

DMSO - dimetylosulfotlenek

FITC - izotiocyjanian fluoresceiny

HSA - albumina ludzka

LDL - lipoproteiny o małej gęstości

NOS - syntaza tlenku azotu

ORAC-FL - (ang. Oxygen Radical Absorbance Capacity) zdolność pochłaniania reaktywnych form tlenu przez przeciwutleniacze

OUN - ośrodkowy układ nerwowy

PBS - zbuforowany roztwór soli fizjologicznej

RFT - reaktywne formy tlenu

RNS - reaktywne formy azotu

rys. - rysunek

tab. - tabela

Spis treści

Wstęp …………………………………………………………………………...............………7

1. Wolne rodniki....................................................................................................................... 9

1. Powstawanie reaktywnych form tlenu.............................................................................9

2. Reaktywne formy tlenu w warunkach fizjologicznych.................................................10

3. Szkodliwy wpływ wolnych rodników...........................................................................12

2. Wpływ reaktywnych form tlenu na białka.......................................................................14

1. Utlenianie łańcucha polipeptydowego..........................................................................14

2. Utlenienie reszt aminokwasowych w białkach..............................................................16

3. Flawonoidy ………………………………….....………………......……..........................18

1. Budowa, klasyfikacja i nazewnictwo.......…..………..............…………………….......18

2. Aktywność biologiczna ...............................................................................................21

1. Działanie antyoksydacyjne.................................................................................21

2. Działanie prooksydacyjne...................................................................................23

3. Działanie przeciwzapalne i przeciwalergiczne...................................................24

4. Działanie estrogenne ..........................................................................................25

3. Flawonoidy w profilaktyce i terapii chorób...................................................................26

1. Aktywność przeciwnowotworowa......................................................................26

2. Flawonoidy w chorobach sercowo-naczyniowych.............................................28

3. Flawonoidy a cukrzyca.......................................................................................30

4. Flawonoidy w terapii AIDS................................................................................30

5. Wpływ na ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy...........................................31

4. Kwercetyna....................................................................................................................31

1. Budowa i właściwości.........................................................................................31

1. Właściwości antyoksydacyjne......................................................................32

2. Działanie przeciwnowotworowe..................................................................33

3. Działanie przeciwzapalne.............................................................................34

4. Albumina surowicy krwi....................................................................................................35

1. Struktura białka.............................................................................................................35

2. Synteza..........................................................................................................................36

3. Funkcje..........................................................................................................................36

4. Utlenianie albuminy......................................................................................................37

5. Metody fizyczne badania cząsteczek.................................................................................38

1. Absorpcja...................................................................................................................... 38

2. Fluorescencja.................................................................................................................39

3. Anizotropia....................................................................................................................42

6. Cel pracy..............................................................................................................................44

7. Aparatura pomiarowa i metody badawcze.......................................................................45

1. ORAC-FL......................................................................................................................45

2. Metoda pomiaru produktów utleniania białek (AOPP).................................................46

8. Wyniki i wnioski..................................................................................................................47

1. Przygotowanie roztworów podstawowych....................................................................47

2. Widma absorpcji kwercetyny w obecności rodników generowanych przez AAPH.....47

3. Widma emisji fluorescencji kwercetyny o różnych stężeniach.....................................49

4. Rejestracja widma fluorescencji kwercetyny i HSA metodą ORAC(FL) ....................51

5. Pomiar natężenia fluorescencji kwercetyny w różnych stężeniach HSA......................52

6. Rejestracja widma fluorescencji kwercetyny z HSA.....................................................55

7. Pomiar absorpcji utlenionego HSA...............................................................................56

9. Podsumowanie....................................................................................................................58

10. Streszczenie.........................................................................................................................60

11. Bibliografia.........................................................................................................................61

Wstęp

Wolne rodniki to niestabilne cząsteczki zawierające niesparowany elektron. Określenie „wolny” oznacza, że atom lub cząsteczka są zdolne do samodzielnego istnienia. Według współczesnego mianownictwa termin wolne rodniki, jest równoznaczny z określeniem reaktywne formy tlenu (RFT). W ilościach fizjologicznych, czyli w warunkach równowagi pomiędzy ich wytwarzaniem, a neutralizacją, pełnią one rolę mediatorów i regulatorów wielu procesów zachodzących wewnątrz komórki. W przypadku zaburzeń związanych ze zwiększeniem ilości ich wytwarzania dochodzi do tzw. stresu oksydacyjnego. Stres oksydacyjny następuje w momencie zaburzenia równowagi pomiędzy wytwarzaniem RFT, a zdolnością do ich neutralizacji. Ze stresem oksydacyjnym wiążą się takie choroby, jak: nowotwory, choroby sercowo-naczyniowe, cukrzyca i inne choroby cywilizacyjne [2]. Jedną z form obrony wolnych rodników jest nieenzymatyczna obrona związana z dostarczaniem organizmowi przeciwutleniaczy. Takimi przeciwutleniaczami są między innymi flawonoidy.

Flawonoidy, inaczej zwane związkami flawonowymi lub bioflawonoidami, to jeden z typów substancji fitochemicznych, które znajdują się w roślinach. Pełnią one rolę barwników, przeciwutleniaczy oraz naturalnych insektycydów i fungicydów (chronią przed atakami insektów i grzybów). Wszystkie flawonoidy są oparte na szkielecie
2-fenylochromanu. Większość typów flawonoidów (poza katechinami i antycyjanidynami) zawiera szkielet flawonu, z grupą ketonową w pozycji 4. Flawonoidy różnią się między sobą liczbą i rodzajem podstawników. Różnice między związkami w poszczególnych klasach wynikają zazwyczaj z odmiennej budowy tylko jednego skrajnego pierścienia[19]. Większość flawonoidów zawiera grupy hydroksylowe, z których jedna lub więcej jest zwykle połączona z cząsteczką cukru i tworzy glikozydy. Prawie wszystkie flawonoidy wykazują różnorodną aktywność biologiczną zarówno w organizmach roślinnych i w zwierzęcych. Stanowią one uniwersalne zmiatacze wolnych rodników dzięki właściwościom antyoksydacyjnym [20]. Dotychczasowe badania nad biologiczną aktywnością flawonoidów pokazały, że wzmagają one w sposób istotny odporność organizmu i łagodzą stany zapalne. Takie działanie tych związków może wynikać z właściwości antyoksydajnych, aktywności estrogennej oraz szerokiego działania przeciwzapalnego [19].

Jednym z przedstawicieli flawonoidów jest kwercetyna. Wywiera różnorodne pozytywne działanie na poziomie komórek i całego organizmu. Posiada właściwości regulujące niektóre mechanizmy prowadzące do powstania nowotworu, skutecznie hamuje kluczowe etapy w kaskadzie mechanizmów zapalnych. Jako przeciwutleniacz chroni komórki, błony komórkowe oraz DNA przed uszkodzeniami spowodowanymi przez wolne rodniki.

Rozwój analitycznych metod fizycznych opartych na spektroskopii optycznej umożliwił zastosowanie ich u wielu dziedzinach nauki, a w szczególności w biologii i w medycynie. Zastosowanie tych metod pozwala przewidzieć szereg biofizycznych właściwości związków, które mogą znaleźć zastosowanie terapeutyczne.

W pracy przeprowadzono badania nad właściwościami antyoksydacyjnymi flawonoidów. Badania zostały przeprowadzone na przykładzie kwercetyny, flawonoidu najbardziej rozpowszechnionego w przyrodzie. Jedną z zastosowanych metod badawczych była metoda ORAC-FL. Dzięki tej metodzie można było przedstawić jaką zdolność antyutleniającą posiada badany przeze mnie flawonoid. Poza wykazaniem działania antyoksydacyjnego kwercetyny, badane były również jej interakcje z białkiem surowicy krwi ludzkiej - albuminą. Albumina stanowi ponad połowę białek znajdujących się w surowicy i odpowiedzialna jest za transport leków, hormonów i kwasów tłuszczowych. Badania te były wykonane w związku z wysokim powinowactwem jakie wykazuje kwercetyna w stosunku do albuminy. Z racji tego, że jest to białko, które odpowiada między innymi za transport leków w naszym organizmie, ważnym było, aby wykazać jaki wpływ na siebie mają obie te cząsteczki. Badano właściwości antyoksydacyjne kwercetyny w stanie wolnym i związanej z albuminą. Zbadano także wpływ anionorodnika ponadtlenkowego na utlenianie albuminy, metodą opracowaną przez Witko-Sarsat i wsp. Dokładne zdefiniowanie interakcji, które mają miejsce pomiędzy kwercetyną i albuminą dałoby nadzieję na wykorzystanie flawonoidów jako środków terapeutycznych.

1. Wolne rodniki

Wolne rodniki, mogą być atomami, jonami lub cząsteczkami. Mają one niesparowany elektron, czyli charakteryzują się spinem elektronowym różnym od zera. Rodniki mają zazwyczaj charakter obojętny, ale mogą również przyjmować ładunek dodatni lub ujemny. Wówczas rodniki obdarowane ładunkiem nazywamy odpowiednio: aniorodnikami (ładunek ujemny) lub katiorodnikami (ładunek dodatni) [1].

In vivo rodniki powstają w wielu reakcjach i odgrywają ważną rolę zarówno w fizjologii jak i patofizjologii. W organizmach ssaków uwalniane są w łańcuchu oddechowym, podczas utleniania hemoglobiny oraz podczas wybuchów tlenowych komórek fagocytujących. U roślin mogą powstawać w procesie fotosyntezy. Rodniki mogą pełnić rolę przekaźników sygnału w komórkach, negatywną stroną ich działania jest udział w patogenezie i rozwoju ponad dwustu chorób. Wśród tych chorób znajdują się tzw. choroby cywilizacyjne takie jak cukrzyca, choroby układu krążenia i nowotwory [1,2].

1. Powstawanie reaktywnych form tlenu

Toksyczność tlenu związana jest z powstawaniem w komórkach i ich otoczeniu RFT. Pod kontrolą mechanizmów enzymatycznych przekształcane jest 98-99% tlenu. 1-2% zatrzymuje się na etapie produktów pośrednich, czyli tworzy reaktywne formy tlenu. Reaktywne formy tlenu mogą powstawać w organizmie na skutek działania zewnętrznych czynników fizycznych takich jak promieniowanie jonizujące, nadfioletowe oraz ultradźwięki. Wymienione powyżej czynniki fizyczne są źródłem RFT o niewielkim znaczeniu biologicznym. Bardziej istotne są wewnątrzkomórkowe źródła RFT, głównie jednoelektronowe utlenianie zredukowanych form wielu związków przez tlen cząsteczkowy oraz szereg reakcji enzymatycznych. Pierwotnie w większości istotnych biologicznie sytuacji tworzony jest anionorodnik ponadtlenkowy. W wyniku jego rozpadu, czy też niektórych jego reakcji może powstać nadtlenek wodoru. Obecność nadtlenku wodoru i anionorodnika ponadtlenkowego daje możliwość tworzenia rodnika hydroksylowego jak również innych wysoce reaktywnych form tlenu.

Związki określane jako fotosensybilizatory (światłouczulacze) po zaabsorbowaniu światła mogą przejść w stan wzbudzony (to znaczy ze stanu singletowego w trypletowy) i reagować z tlenem trypletowym. W reakcji tej powstaje anionorodnik ponadtlenkowy (np. fotoredukcja ryboflawiny).

Obecność zredukowanych form niskocząsteczkowych składników komórek (np. zredukowana ryboflawina, cukry redukujące, związki tiolowe) podobnie jak fotoredukcja może prowadzić do powstania anionorodnika ponadtlenkowego.

(1.7)

Substancje takie jak herbicydy, insektycydy, fungicydy ulegają w komórkach cyklicznej redukcji. Cykle te napędzone są poprzez metabolizm komórki, a nie światło. Mechanizm toksyczności tych związków polega właśnie na wytwarzaniu RFT.

W organizmach żywych utlenieniu ulegają również hemoglobina i mioglobina, czyli białka oddechowe. Obie jako grupę prostetyczną zawierają hem. W skład grupy hemowej wchodzą jony żelaza Fe²⁺, które pod wpływem tlenu łatwo mogą się utleniać do jonów żelaza

Fe³⁺. W przypadku obu tych białek jony Fe²⁺ są silnie związane z ich hemem, dlatego też są mniej podatne na utlenianie, nie mniej jednak procesowi temu mogą ulec.

(1.8)

90% tlenu w komórce zużywane jest w mitochondriach. W warunkach prawidłowych cząsteczka tlenu ulega w nich czteroelektronowej redukcji, a energia wytwarzana podczas tego procesu jest wykorzystana do syntezy ATP. Jednak część cząsteczek w procesie oddechowym ulega redukcji jednoelektrodowej, w wyniku czego powstaje anionorodnik ponadtlenkowy. Jest to proces, który stanowi najważniejsze źródło anionorodników ponadtlenkowych w większości komórek aerobowych [1,2].

2. Reaktywne formy tlenu w warunkach fizjologicznych

W warunkach homeostazy reaktywne rodniki tlenowe są uwalniane w ilości bezpiecznej dla komórki. Odgrywają rolę mediatorów i regulatorów wielu procesów komórkowych [3,5]. Reaktywne formy tlenu (RFT) wpływają na syntezę, uwalnianie oraz inaktywację tlenku azotu, indukują różnicowanie się komórek oraz ich apoptozę a także pobudzają transport glukozy do komórek. Warunkują prawidłowy przebieg reakcji zapalnej poprzez zwiększenie przepuszczalności ścian naczyń włosowatych. Jedną z najistotniejszych ról jaką odgrywają RFT jest regulacja procesów przekazywania sygnałów z komórki do komórki oraz w jej obrębie [3,4]. Idealnymi kandydatami na przekaźniki są jon ponadtlenkowy i nadtlenek wodoru ze względu na małą reaktywność, wybiórczość i stałą dostępność w komórce [3,4,5]. Wykazują podstawowe działanie w hamowaniu funkcji receptorów, głównie tych zawierających grupy -SH. Większość białek posiadających grupy tiolowe jest inaktywowana przez RFT, ale są też takie których aktywność wzrasta. Zaliczane są do nich m.in. cyklaza guanylanowa (enzym wytwarzający cGMP) oraz wybrane białka transportowe np. 5-lipooksygenaza, która jest źródłem wolnych rodników generowanych przez pobudzone limfocyty. Metabolity powstające w wyniku utleniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych utrzymują wewnątrz komórki równowagę oksydacyjną aktywując szlaki przekazywania sygnału i ekspresję genów [3,6,7]. Wolne rodniki tlenowe wykorzystane są przez komórki fagocytujące do eliminacji patogenów. Proces ten nazywany jest „wybuchem tlenowym” i wiąże się z kilkudziesięciokrotnym wzrostem zużycia tlenu. Nazwa wybuch tlenowy wiąże się z wykorzystaniem tlenu do wytworzenia i uwolnienia anionorodnika ponadlenkowego, który jest prekursorem jonu hydroksylowego. Dodatkowo RFT uczestniczą w eliminacji pasożytów oraz procesie eliminacji czynników potencjalnie chorobotwórczych znajdujących się w jamie ustnej, stwierdza się to przez wykazanie obecności peroksydazy i mieloperoksydazy w ślinie [3,8]. Jednym z najbardziej istotnych zadań wolnych rodników jest udział w procesie starzenia. RFT nie tylko wpływają na starzenie się, ale również decydują o śmierci lub przeżyciu komórki. Niskie stężenia RFT powodują aktywację czynników transkrypcyjnych przez co umożliwiają zróżnicowanie komórek i przystosowanie się do zmienionych warunków, natomiast wyższe stężenia wolnych rodników powodują kierowanie komórki na drogę apoptozy, dzięki czemu komórki, które uległy dużym uszkodzeniom i mogłyby stanowić zagrożenie dla organizmu ulegają eliminacji [3,5,10].

Reaktywne formy tlenu uczestniczą również w regulacji odporności. Wykazano, że nasilają aktywację limfocytów T i indukują adhezję komórek limfocytarnych do śródbłonka co umożliwia ich przenikanie z układu krwionośnego do miejsca reakcji zapalnej [3,4,5,9].

3. Szkodliwy wpływ wolnych rodników.

Wpływ wolnych rodników na komórkę zależy od czasu działania i ich stężenia. Niskie stężenie spełnia warunki fizjologiczne, natomiast wysokie prowadzi do toksycznego uszkadzania komórek i prowadzi do ich destrukcji [3,5].

Szkodliwe działanie wolnych rodników przejawia się między innymi w zdolności do utleniania białek [3,5]. Nadtlenki białek powstają w wyniku kontaktu białek z wolnymi rodnikami powstającymi w reakcjach z udziałem ksantyny i oksydazy ksantynowej, mitochondrialnego łańcucha oddechowego, czy też pobudzonych komórek fagocytujących. Nieodwracalnie zmienione białka są selektywnie usuwane przez proteazy, jednak w wyniku starzenia, gdy aktywność proteolityczna ulega obniżeniu, mogą być gromadzone w komórce [11,12,13]. Utlenianie białek może prowadzić do pojawienia się zmienionych reszt aminokwasowych, rozerwania łańcucha polipeptydowego czy też do tworzenia się dimerów lub agregatów białkowych. Zmiany te w konsekwencji prowadzą do utraty aktywności funkcjonalnej enzymów, białek regulatorowych czy transporterów błonowych [11,14,15]. Oddziaływanie RFT z białkami może powodować nie tylko ich utlenianie, ale również tworzenie się w białkach grup redukujących zdolnych m.in. do redukcji cytochromu c i jonów metali [5,16].

Kwasy nukleinowe wykazują większą stabilność niż białka czy lipidy. Reakcja rodnika hydroksylowego i tlenu singletowego z kwasami może prowadzić do uszkodzenia zasad purynowych i pirymidynowych reszt cukrowych lub do rozerwania wiązań fosfodiestowych łączących nukleotydy. Prowadzi to do pęknięć nici kwasów nukleinowych [3,17,18].

Kolejne niebezpieczeństwo ze strony wolnych rodników tlenowych wynika z procesu peroksydacji lipidów, czyli wolnorodnikowego utleniania lipidów [3]. W przebiegu procesu peroksydacji lipidów można wyróżnić trzy fazy inicjacji, propagacji i terminacji.

1. Inicjacja polega na oderwaniu cząsteczki wodoru od cząsteczki nienasyconego kwasu tłuszczowego wchodzącego w skład fosfolipidów - głównych składników budujących błonę komórkową. Inicjacja może być zapoczątkowana przez rodniki takie jak: hydroksylowy (OH`), nadtlenkowy (LOO`) i alkilowy (LO`) oraz tlenek i dwutlenek azotu.

2. W reakacji propagacji wolne rodniki alkilowe reagują z tlenem dając wolne rodniki nadtlenkowe, a w końcu nadtlenek kwasu tłuszczowego. Taki cykl reakcji może się powtarzać wielokrotnie, aż do terminacji i może doprowadzić do przekształcenia w nadtlenek nawet kilkuset cząsteczek kwasów tłuszczowych.

3. Reakcja terminacji może zachodzić między dwoma rodnikami alkilowymi, nadtlenkowymi lub dwoma różnymi rodnikami występującymi w układzie. Produktami tej reakcji są uszkodzone cząsteczki lipidów.

Dalsze przemiany prowadzą do rozpadu reszt wielonienasyceniowych kwasów tłuszczowych i powstania kilku lub kilkunastuwęglowych fragmentów takich jak dwualdehyd malonowy czy 4-hydroksynonenal [1]. Wiele białek wykazuje zdolność wiązania się z 4-hydroksynonenalem, które to wiązanie nie jest korzystne dla komórki z racji tego, że białka występujące w tym kompleksie zmieniają się konformacyjnie i funkcjonalnie. Produkty peroksydacji lipidów zmieniają właściwości błon komórkowych, może to prowadzić do zahamowania aktywności enzymów błonowych i białek transportujących, jak również indukować ekspresję cyklooksygenazy typu 2 (COX-2) w makrofagach i aktywować potencjał zapalny tych komórek [3].

2. Wpływ reaktywnych form tlenu na białka

Do utlenienia łańcucha polipeptydowego i reszt aminokwasowych w białkach dochodzi pod wpływem utleniaczy. Prowadzić to może do rozerwania łańcucha polipeptydowego, utworzenia wiązań krzyżowych w obrębie tego samego lub kilku łańcuchów polipeptydowych i spowodować pojawienie się zmienionych reszt aminokwasowych [59]. Białka w których doszło do takich zmian mogą utracić lub wykazywać zwiększoną aktywność biologiczną jak również mieć tendencję do tworzenia agregatów [60]. Agregaty powstałe w wyniku modyfikacji oksydacyjnych posiadają zdolność do hamowania systemów odpowiedzialnych za ich degradację, co sprzyja ich nagromadzeniu. Wykazano, że pod wpływem wolnych rodników dochodzi do utraty aktywności takich enzymów jak np. dehydrogenazy gliceroaldehydofosforanowej czy dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej [11].

Utlenianie łańcucha polipeptydowego

Rodnik hydroksylowy, który powstaje w reakcji Fentona, tj. reakcji nadtlenku wodoru np. z jonami Fe²⁺ lub w reakcji Habera-Weissa, czyli reakcji nadtlenku wodoru z anionorodnikiem ponadtlenkowym, daje początek utlenianiu łańcucha polipeptydowego poprzez oderwanie atomu wodoru przy węglu α aminokwasu. Powstały w tej reakcji rodnik alkilowy wchodzi gwałtownie w reakcję z tlenem tworząc poprzez rodnik alkilonadtlenkowy, alkilowodorondtlenek. Ten przekształca się w rodnik alkoksylowy, który następnie może przejść w hydroksylowaną przy węglu α resztę aminokwasową lub może doprowadzić do fragmentacji łańcucha polipeptydowego [62]. Rodniki alkilowy, alkilonadtlenkowy, alkoksylowy reagują z innymi resztami aminokwasowymi tego samego lub innego łańcucha polipeptydowego białka, umożliwiając tym samym powstawanie kolejnych rodników. Tworzenie rodników alkilonadtlenkowych przy niedoborze tlenu jest utrudnione, dlatego rodniki alkilowe w obrębie tego samego lub różnych białek, reagując ze sobą mogą prowadzić do powstania wiązań krzyżowych pomiędzy łańcuchami polipeptydowymi [11]. Reakcjom prowadzącym do rozerwania łańcucha polipeptydowego sprzyja obecność rodników alkoksylowych. Powstać mogą dwa typy produktów rozpadu i jest to zależne od miejsca pęknięcia (rys.1) [62].

Rys.1 Fragmentacja łańcucha polipeptydowego poprzez rodnik alkoksylowy [62].

Do przerwania łańcucha polipeptydowego doprowadzić również może atak reaktywnych form tlenu na reszty kwasu glutaminowego, kwasu asparaginowego i proliny. Atom wodoru oderwany od atomu węgla γ reszty kwasu glutaminowego lub kwasu asparaginowego przez rodnik hydroksylowy może doprowadzić do fragmentacji łańcucha (rys.2) [11].

Rys.2 Fragmentacja łańcucha polipeptydowego poprzez utlenianie reszty kwasu glutaminowego [11].

Utlenianie reszt proliny prowadzi do przerwania łańcucha polipeptydowego i równocześnie do powstania 2-pyrolidylonu (rys. 3) [11].

Rys.3 Utlenianie reszt proliny [11].

Utlenianie reszt aminokwasowych w białkach.

Wszystkie reszty aminokwasowe białek podatne są na utlenianie. Największą wrażliwość na działanie wolnych rodników wykazują: cysteina, metionina, tyrozyna i tryptofan. Jedyną modyfikacją w białkach in vivo, która może zostać naprawiona w obecności specyficznych reduktaz jest utlenienie metioniny i cysteiny. Reszty metioninowe utleniają się do sulfotlenku metioniny (rys. 4), a cysteinowe do reszt dwusiarczkowych. Jako jeden z mechanizmów zmiatania wolnych rodników może mieć znaczenie utlenianie i redukcja reszt metioniny [62].

Rys. 4 Utlenianie reszt metioniny [11].

Wzmożoną wrażliwość na atak wolnych rodników wykazują reszty aminokwasów aromatycznych. Utlenianie reszt tyrozynowych prowadzi do powstania 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA), która powstaje przez włączenie dodatkowej grupy hydroksylowej do pierścienia aromatycznego. Dojść może również do wytworzenia wiązań krzyżowych pomiędzy pierścieniami aromatycznymi dwóch cząsteczek tego samego aminokwasu dzięki powstaniu 2,5-dityrozyny (rys. 5) [11].

Rys. 5 Utlenianie reszt tyrozyny [11].

Utlenienie reszt tryptofanowych prowadzi do powstania formylokinureniny i kinureniny. Histydyna natomiast utlenia się do 2-oksohistydyny, asparaginy i kwasu asparaginowego. Powstawanie pochodnych karbonylowych jest wynikiem utleniania reszt aminokwasowych z wolną grupą aminową, amidową lub hydroksylową. Pochodne takie mogą reagować z innymi wolnymi grupami aminowymi reszt lizyny w tej samej lub innej cząsteczce białka, tworząc wiązania krzyżowe. Reakcja ta jest kolejnym mechanizmem, w którym tworzone są wiązania krzyżowe [11].

3. Flawonoidy

Badania nad flawonoidami roślinnymi zapoczątkował Albert Szent-Györgyi biochemik węgierski, laureat Nagrody Nobla w dziedzinie medycyny (1937). Dokonał on identyfikacji bioflawonoidów w owocach cytrusowych w latach 30. ubiegłego stulecia. Zaobserwował on także pozytywny wpływ tych związków na naczynia krwionośne człowieka, który polegał na zmniejszeniu ich przepuszczalności. Zidentyfikowane związki nazwał witaminą P, od angielskiego słowa permeability, oznaczającego przepuszczalność.

Związki flawonowe, nazywane również flawonoidami lub bioflawonoidami, należą do szerokiej klasy substancji fitochemicznych, czyli takich, których źródłem są rośliny. Flawonoidy to składniki wielu substancji pokarmowych niezbędnych w diecie człowieka. Znajdziemy je w owocach (w szczególności cytrusowych, a także jabłkach, jagodach, winogronach), warzywach (pomidory, brokuły, papryka, sałata, nasionach roślin strączkowych, młodym pieprzu) oraz w produktach o pochodzeniu roślinnym (herbata, czerwone wino czy kasza gryczana). Do tej pory zidentyfikowano ok. 7000 tych związków, z czego ok.800 zostało dokładnie opisanych. Istnienie tych związków w diecie, a zwłaszcza zachowanie właściwego poziomu ich spożycia ma istotne znaczenie w profilaktyce powstawania wielu chorób, między innymi miażdżycy. Dotychczasowe badania prowadzone na hodowlach komórkowych z wykorzystaniem flawonoidów dają nadzieję na wykorzystanie ich w profilaktyce i leczeniu nowotworów. Jako antyoksydanty mogą one wpływać w bardzo zróżnicowany sposób na przykład poprzez: bezpośrednia reakcję z wolnymi rodnikami, zmiatanie wolnych rodników, hamowanie lub wzmacnianie działania wielu enzymów [19,20,21,22,23,24].

1. Budowa, nazewnictwo i klasyfikacja

Flawonoidy są pochodną 2-fenylo-benzo-γ-pironu. Podstawową strukturę cząsteczki związków flawonowych stanowią dwa pierścienie benzenowe (A i B), pomiędzy którymi znajduje się heterocykliczny pierścień piranu lub piranu (C) [21].

Rys.6 Struktura 2-fenylo-benzo-γ-pironu [24].

Biosynteza pierścieni A i B zachodzi w dwóch szlakach. Pierścień A powstaje na drodze szlaku octanowego z 3 cząsteczek malonylo-CoA powstających z przemian glukozy. Pierścień B powstaje na drodze szlaku szikimowego z 4 kumaroilo-CoA, które powstają z fenyloalaniny w szlaku szikimowym. Kondensacja pierścieni A i B prowadzi do powstania chalkonu, który ulega cyklizacji z udziałem izomerazy w wyniku czego powstaje flawanon - wyjściowy związek do syntezy pozostałych grup flawonoidów [24]. W cząsteczkach większości naturalnych flawonoidów pierścień A zawiera dwie grupy hydroksylowe w pozycji 5 i 7, a pierścień B jedną w pozycji 3, która zwana jest grupą katecholową. W związku z tym flawonoidy należą do polifenoli. Flawonoidy mogą występować w dwóch postaciach izomerycznych - flawonoidowej i izoflawonoidowej [21].

Rys.7 Podstawowe struktury cząsteczek flawonoidów: a - postać flawonoidowa, b - postać izoflawonoidowa [21].

W cząsteczce flawonoidów przy atomie węgla w pozycji 2 pierścienia heterocyklicznego, znajduje się zwykle grupa hydroksylowa lub podstawnik fenylowy, w izoflawonoidach są one usytuowane przy atomie węgla w pozycji 3. W zależności od występowania lub braku grupy karbonylowej w pozycji 4 pierścienia C, występowania lub braku wiązania podwójnego pomiędzy atomami węgla w pozycji 2 i 3 pierścienia C oraz liczby grup hydroksylowych, wśród flawonoidów można wyróżnić:

• flawanony np. naryngenina, naryngina, hesperetyna, hesperydyna

• flawanole/ katechiny np. epikatechina, epigallokatechina, katechina

• flawony np. apigenina, diosmetyna, luteolina

• chalkony np. floretyna, aflorydzyna

• flawonole np. kwercetyna, kemferol, mirecytyna, fisteina, morina

• antocyjanidyny np. cyjanidyna, pelargonidyna, malwidin

• izoflawony np. daizeina, genisteina i glicyteina [19,21,24].

Rys.8 Struktura wybranych flawonoidów

W roślinach flawonoidy występują w dwóch formach: wolnej - aglikonów lub w postaci połączenia aglikonu z częścią cukrową β-glikozydów. Część cukrową stanowi zazwyczaj 1-5 cząsteczek cukrów prostych takich jak np. β-D-glukoza, β-L-ramnoza, β-D-galaktoza. Cukry przyłączane są zazwyczaj w pozycji C-3, rzadziej C-4', C-3', C-5 czy C-7. W formie glikozydów najczęściej występują flawonole oraz flawony i w takiej formie są spożywane przez człowieka. Pośród form glikozydowych wyróżnia się formy O-glikozydowe np. rutyna - 3-O-(6''-ramnozylo)-glukozyd kwercetyny oraz rzadziej występujące formy C-glikozydowe np. witeksyna - 8-C-glukozyd apigeniny. Spotykane są również glikozydoestry flawonoidowe, flawonolignany np. sylibina, prenyloflawonoidy, a także pochodne biflawonoidowe np. ginkgetyna. Przyłączenie do formy aglikonowej cukru zwiększa polarność związków flawonoidowych. Flawonoidy mogą również łączyć się między sobą, tworząc cząsteczki biflawonoidów, a także oligomery np. procyjanidyny, bądź duże, nieulegające hydrolizie polimeryczne cząsteczki, w których jednostką podstawową są flawanole połączone wiązaniami C-C np. taniny [19,21,24].

1. Aktywność biologiczna

Flawonoidy to interesująca grupa związków naturalnych, ze względu na szeroki zakres działania jaki posiadają. Obecność w ich strukturze chemicznej różnych grup i ugrupowań sprawia, że wykazują one szeroki zakres aktywności biologicznej. Dzięki takiej budowie mogą w różny sposób oddziaływać na metabolizm komórkowy. Głównym powodem dla którego stwierdzono pozytywny wpływ flawonoidów na organizm człowieka jest ich aktywność antyoksydacyjna, czyli zdolność do neutralizacji wolnych rodników [19,20,21,22,23,24].

1. Działanie antyoksydacyjne

Aktywność antyoksydacyjna flawonoidów wynika z ich budowy pierścieniowej oraz obecności w ich strukturze grup hydroksylowych, szczególnie w pozycji C-3, C-5, C-7, C-3', wiązania podwójnego w pozycji C-2 i C-3 oraz grupy karbonylowej w pozycji C-4. Aktywność antyoksydacyjna poszczególnych flawonoidów wynika z ilości oraz położenia grup hydroksylowych. Większa ilość grup hydroksylowych, to silniejsze działanie antyoksydacyjne, również położenie tych grup w pozycji orto i para wzmaga to działanie. Badania in vitro wykazały, że ze względu na zablokowanie przez resztę cukrową grup hydroksylowych, glikozydy wykazują słabsze właściwości antyoksydacyjne w porównaniu do odpowiednich im aglikonów. Ponadto różnice we właściwościach antyoksydacyjnych zależą również od rodzaju reszty sacharydowej obecnej w cząsteczce. Glikozydacja grupy hydroksylowej przy węglu w pozycji 3 cząsteczką monosacharydu nie obniża zdolności antyoksydacyjnych flawonoidów, podczas gdy aktywność antyoksydacyjna jest istotnie niższa w przypadku glikozydacji resztą disacharydową. Jednak badania przeprowadzone w warunkach in vivo nie potwierdzają zależności pomiędzy obecnością grupy metoksylowej lub reszty węglowodanowej w cząsteczkach flawonoidów, a ich działaniem antyoksydacyjnym w organizmie zwierząt. Może to być spowodowane tym, że w jelitach obecne są bakterie zawierające glikozydazy, enzymy katalizujące reakcje hydrolizy reszt cukrowych z glikozydów flawonoidów. Powstałe w wyniku działania glikozydaz aglikony ulegają następnie metabolizmowi w sposób właściwy dla flawonoidów [21,22,23,24].

Ugrupowanie aktywne	Działanie antyoksydacyjne
Grupa (o-dihydroksylowa) katecholowa w pierścieniu B	wykazuje dużą zdolność wychwytywania rodników tlenowych, jednak nie przyczynia się przez swe reakcje do ochrony przed peroksydacją lipidów w mitochondriach mózgu szczura
Ugrupowanie pirogalolowe (trihydroksylowe) w pierścieniu B	nadaje cząsteczce wyższą aktywność antyoksydacyjną. Podwójne wiązanie pomiędzy węglem C2 i C3 w pierścieniu C przyczynia się do wzrostu zdolności wychwytywania rodników, ponieważ po reakcji z rodnikiem powstaje stabilny rodnik fenoksylowy
Ugrupowanie 4-okso (grupa ketonowa, podwójne wiązanie pomiędzy węglem C4 pierścienia C i atomem tlenu)	szczególnie w obecności podwójnego wiązania pomiędzy C2 i C3, wzrasta zdolność wychwytywania rodników dzięki zdelokalizowanym elektronom pierścienia B
Grupa hydroksylowa przy węglu C3 pierścienia C	wykazuje szczególnie silne zdolności wychwytywania rodników spotęgowane obecnością podwójnego wiązania pomiędzy węglem C2 i C3 oraz grupowania 4-okso (jest to najbardziej korzystne połączenie dla nadania cząsteczce zdolności wychwytywania rodników)
Grupy hydroksylowe przy węglu C5 i C7	mogą także zwiększać zdolności do wychwytywania wolnych rodników w wielu reakcjach wolnorodnikowych.

Tabela.1 Ugrupowania obecne we flawonoidach, które nadają im największą aktywność antyoksydacyjną [21].

Flawonoidy mogą działać z wolnymi rodnikami poprzez reakcje bezpośrednie i pośrednie. Bezpośrednie działanie antyoksydacyjne flawonoidów polega na zmniejszeniu reaktywności tlenu do bardziej stabilnych, niereaktywnych form. Mechanizmy bezpośrednie polegają na:

• Wychwytywaniu/wymiataniu wolnych rodników i ich reaktywnych form (RFT)

• Ograniczeniu wytwarzania wolnych rodników poprzez hamowanie aktywności enzymów biorących udział w powstawaniu RFT (oksydazy ksantynowej, błonowej oksydazy NAD(P)H, mieloperoksydazy)

Działanie pośrednie prowadzi do zahamowania powstawania reaktywnych form tlenu, polega ono na:

• Chelatowaniu jonów metali przejściowych (miedzi i żelaza), co zapobiega

powstawaniu w komórkach reaktywnego rodnika hydroksylowego

• przerywaniu kaskady reakcji wolnorodnikowych w enzymatycznej i nieenzymatycznej peroksydacji lipidów;

• ochronie niskocząsteczkowych antyoksydantów (np. askorbinianu w cytosolu,
  α-tokoferolu w błonach biologicznych) przed utlenianiem

Zdolność do wychwytywania reaktywnych form tlenu i chelatowania jonów metali przejściowych może mieć istotne znacznie w stanach patologicznych takich jak miażdżyca, cukrzyca, choroby neurodegeneracyjne, nowotwory, którym towarzyszy stres oksydacyjny. Flawonoidy takie jak kwercetyna czy rutyna działają ochronnie na witaminę C i E. Chelatowanie jonów metali przejściowych powoduje hamowanie utleniania askorbinianu, stabilizuje jego cząsteczkę, a także zwiększa jego wchłanianie z przewodu pokarmowego. Lokalizacja związków flawonoidowych w pobliżu błon komórkowych powoduje zwiększenie ich stabilności poprzez zwiększenie ich odporności na czynniki utleniające. Flawonoidy przyczyniają się również do obniżenia aktywności enzymów takich jak fosfolipaza A2, cyklooksygenaza, lipooksygenaza, które biorą udział w enzymatycznej peroksydacji błonowych fosfolipidów [21,24].

1. Działanie prooksydacyjne

Niektóre związki flawonoidowe w zależności od warunków tlenowych panujących w komórce mogą wykazywać działanie prooksydacyjne. Dotyczy to flawonoidów, które mają ugrupowanie pirogalolowe - trzy grupy OH w pierścieniu B lub katecholowe - grupa OH w pozycji 3' w pierścieniu B, gdyż one w obecności tlenu i jonów miedzi Cu²⁺ ulegają autooksydacji. W wyniku tego powstaje utleniona forma flawonoidu w formie rodnika semichinonowego i jony miedzi Cu⁺. Przy udziale NADH rodnik semichinonowy jest redukowany co prowadzi do powstania cyklu reakcji redoks i generowania RFT. Rodniki semichinonowe powstające podczas utleniania flawonoidów pomimo, że charakteryzują się stabilnością, mogą wykazywać działanie cytotoksyczne. Jony miedzi (I), powstałe na skutek autooksydacji flawonoidów, reagują z tlenem wytwarzając rodnik ponadtlenkowy, z którego może powstać nadtlenek wodoru a dalej w reakcji Habera Weissa czy Fentona może powstawać reaktywny chemicznie rodnik hydroksylowy odpowiedzialny za oksydacyjne

modyfikacje DNA, białek czy lipidów[21,22,24, 25].

Reakcja Fentona

Reakcja Habera Weissa

[26]

Działanie przeciwzapalne i przeciwalergiczne

Mechanizm działania przeciwzapalnego związków flawonoidowych polega głównie na hamowaniu aktywności 5-lipooksygenazy i cyklooksygenazy. Zahamowanie tych enzymów prowadzi do inhibicji napływu leukcytów i wyrównania napięcia naczyń włosowatych i zmniejszenia odczynu zapalnego. Podczas reakcji zapalenej dochodzi do powstania wielu RFT, które uszkadzają ściany naczyń krwionośnych przez degradacje kolagenu, dlatego przeciwzapalne i antyoksydacyjne działanie flawonoidów poprawia stan naczyń krwionośnych [24].

Poza działaniem przeciwzapalnym niektóre flawonoidy wykazują działanie przeciwalergiczne. Ich przeciwalergiczne działanie polega na oddziaływaniu z komórkami układu odpornościowego. Polega ono na hamowaniu proliferacji limfocytów, zahamowaniu syntezy immunoglobulin klasy E, G, M, A oraz na uwalnianiu cytokin. Flawonoidy mogą również hamować aktywność enzymów lizosomalnych, biorących udział w procesach zapalnych i alergicznych. Przykładami związków flawonoidowych o właściwościach przeciwalergicznych są kwercetyna i luteolina, które oprócz obniżania syntezy mediatorów zapalnych, hamują również uwalnianie histaminy z mastocytów pobudzonych wcześniej immunoglobulin klasy E [23,24,27,28].

Działanie estrogenne

Flawonoidy należą do fitoestrogenów, czyli związków niesteroidowych pochodzenia roślinnego o budowie podobnej do naturalnych estrogenów. Najbardziej znane i poddawane różnego typu badaniom są flawonoidy grupy izoflawonów, np. genisteina czy daidzeina. Podobieństwo ich budowy do estrogenów sprawia, że wykazują powinowactwo do receptorów estrogenowch α (ER-α) oraz w dużo większym stopniu do receptorów β (ER-β). ER-α występują głównie w gruczole sutkowym, endometrium czy w zrębie jajników, natomiast ER-β w mózgu, naczyniach krwionośnych, nerkach, pęcherzu moczowym, płucach, kościach oraz w jelitach. Dzięki temu łagodzą objawy menopauzy. W badaniach epidemiologicznych wykazano, że uderzenia gorąca pojawiają się znacznie rzadziej w grupie kobiet spożywających znaczne ilości soi zawierającej fitoestrogeny. Doświadczenia laboratoryjne dowiodły, że podawanie zwierzętom jedynie izoflawonów pobudziło przerost macicy, co wskazało na ich działanie estrogenne. Natomiast podawanie ich łącznie z estrogenami wykazało działanie antyestrogenowe, np. poprzez hamowanie wychwytu estradiolu przez macicę. Przeprowadzone dotychczas badania w większości skupiają się na korzystnym działaniu izoflawonów w opóźnianiu menopauzy oraz łagodzeniu jej następstw, np. obniżaniu zachorowalności na osteoporozę kobiet w okresie postmenopauzalnym [20,24,28].

1. Flawonoidy w profilaktyce i terapii chorób

Fitozwiązki od bardzo dawna wykorzystywane są jako naturalne leki w terapii różnych schorzeń. W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie profilaktyką i leczeniem za ich pomocą. Szeroki zakres farmakologicznego działania flawonoidów powoduje, że podejmowane są również próby zastosowania tych związków jako terapii wspomagającej w wielu chorobach [22,24].

1. Aktywność przeciwnowotworowa

Badania prowadzone w latach 70. i 80. XX wieku dowiodły o aktywności przeciwnowotworowej flawonoidów. Wykazano, że niektóre z nich obniżały aktywność mutagenną wybranych promutagenów/prokancerogenów in vitro, a także zmniejszały częstość występowania nowotworów u zwierząt doświadczalnych [29]. Obserwacje epidemiologiczne wskazują na odwrotną korelacje pomiędzy spożyciem flawonoidów w diecie a ryzykiem powstawania niektórych typów nowotworów u ludzi. Zaobserwowano, że dieta bogata w izoflawony powoduje zmniejszenie ryzyka powstania u kobiet nowotworu piersi, a u mężczyzn nowotworu prostaty. Ostatnie badania wskazują na możliwość profilaktycznego działania izoflawonów w nowotworach tarczycy, głowy i szyi. Natomiast ryzyko wystąpienia nowotworu płuc można zmniejszyć poprzez picie zielonej herbaty zawierającej katechiny [24].

Działanie przeciwnowotworowe flawonoidów jest możliwe dzięki ich właściwościom antyoksydacyjnym, a także dzięki: oddziaływaniu na aktywność enzymów I i II fazy biotransformacji endo- i egzogennych związków, blokowaniu replikacji DNA przez hamowanie aktywności enzymów biorących udział w tym procesie (np. polimerazy II DNA, topoizomerazy I i II). Kwercetyna i kempferol są inhibitorami polimerazy II DNA, luteolina topoizomerazy I, natomiast mirycetyna, kwercetyna czy baikalina topoizomerazy II [20,21,24].

Flawonoidy poprzez blokowanie cyklu komórkowego w fazie G1/S lub G2/M, mogą hamować proliferację oraz indukować apoptozę komórek nowotworowych. Jest to możliwe, gdyż związki te wykazują wpływ na aktywność:

1. białek odpowiedzialnych za regulację cyklu komórkowego (np. cykliny),

2. białek proapoptotycznych i antyapoptotycznych (np. p21, p53, Bcl-2),

3. enzymów odpowiedzialnych za biotransformację mutagenów i kancerogenów.

Flawonoidy wykazują zdolność do modulowania aktywności enzymów odpowiedzialnych za metabolizm ksenobiotyków, których to aktywność biologiczna zmienia się pod wpływem ich działania. Flawonoidy mogą zarówno aktywować, jak i hamować aktywność różnych izoform cytochromu P-450, czyli enzymów I fazy biotransformacji. Odpowiedzialne są także za pobudzenie aktywności enzymów II fazy. Zaobserwowano, że działanie niektórych flawonoidów, np. tangretyny czy chryzyny podwyższa aktywność transferazy glutationowej czy UDP-glukuronowej, czyli enzymów II fazy biotransformacji [24,30].

Poza bezpośrednim działaniem na enzymy biorące udział w nowotworzeniu, flawonoidy są zdolne do modyfikowanie metabolizmu komórkowego poprzez:

1. obniżenie aktywności czynników transkrypcyjnych AP-1 i NF-κB, które kontrolują wiele genów regulujących proliferację, apoptozę czy angiogenezę. Hamujące działanie flawonoidów na te czynniki wynika z ich właściwości przeciwutleniających, a także zdolności do:

1. hamowania aktywności kinaz, które aktywują czynnik NF-κB poprzez jego fosforylację i odłączenie od inhibitora (IκB)

2. hamowania aktywności MAP kinaz, które odpowiedzialne są za aktywację czynnika AP-1;

2. obniżenie aktywności kinazy C (PKC), która katalizuje fosforylację seryny, treoniny czy też kinaz tyrozynowych (PTK) uczestniczących w powstawaniu stanów zapalnych i zmian nowotworowych;

3. hamowanie glikoproteiny P, która w zdrowych komórkach usuwa szkodliwe substancje, natomiast podczas chemioterapii usuwa cytostatyki [29].

Zgromadzone dotychczas dane dotyczące przeciwnowotworowej aktywności flawonoidów nie są jednoznaczne. Mechanizm ich przeciwnowotworowego działania poznano przede wszystkim na układach doświadczalnych w warunkach in vitro i tylko dla kilku flawonoidów takich jak genisteina i daidzeina, w mniejszym stopniu dla kwercetyny, czy luteoliny. Doświadczenia pokazały, że genisteina i daidzeina dostarczone w diecie są zdolne do hamowania wzrostu i podziału komórek zależnego od receptorów EGF oraz do hamowania angiogenezy. Hamowanie kinaz tyrozynowych zaburza przekazywanie sygnału pomiędzy komórkami, co prowadzi do zaburzenia wzrostu i podziału komórek - jest to istotne w ograniczeniu namnażania komórek nowotworowych. Izoflawony mogą także hamować syntezę aromatazy i jednocześnie pobudzać syntezę globuliny wiążącej hormony płciowe (SHBG), co prowadzi do zahamowania wytwarzania endogennych estrogenów i androgenów, a tym samym do zahamowania wzrostu nowotworów hormonozależnych [21,24].

Ciekawych wyników dostarczyły badania dotyczące zastosowania flawonoidów w chemioterapii nowotworów. Stwierdzono, że w opornych na działanie chemioterapeutyków liniach komórkowych flawonoidy mogą zwiększać stężenie niektórych z zastosowanych cytostatyków [24].

1. Flawonoidy w chorobach sercowo-naczyniowych

W licznych badaniach epidemiologicznych wykazano odwrotny związek pomiędzy ilością spożywanych w diecie flawonoidów a zapadalności na choroby układu sercowo-naczyniowego. Fakt ten potwierdza zjawisko tzw. paradoksu francuskiego. Osoby mieszkające w rejonie Morza Śródziemnego pomimo diety bogatej w tłuszcze znacznie rzadziej zapadają na miażdżycę tylko dlatego, że równocześnie dostarczają wraz z warzywami i owocami związki polifenolowe, w tym flawonoidy, a także spożywają czerwone wino, które obfituje w rezweratrol i katechiny. Działalność antyoksydacyjna tych związków zapobiega peroksydacji lipidów błon komórkowych, ochrania lipoproteiny o małej gęstości (LDL) przed utlenianiem, a także prowadzi do zwiększenia stężenia korzystnego cholesterolu (HDL) [20,21,22,24].

Flawonoidy mają zdolność do uszczelniania naczyń krwionośnych. Wraz z witaminą C biorą udział w tworzeniu wiązań poprzecznych pomiędzy łańcuchami polipeptydowymi włókien kolagenu. W ten sposób uelastyczniają i wzmacniają m.in. naczynia krwionośne. Uszczelnianie naczyń wynika także ze zdolności do hamowania hialuronidazy (niszczy połączenia międzykomórkowe) i oksydazy lizosomowej (niszczy wiązania krzyżowe kolagenu). Hamowanie tych enzymów zmniejsza łamliwość i przepuszczalność naczyń krwionośnych. Dzięki ich uszczelnieniu LDL nie przechodzą do ścian tętnic i nie tworzy się blaszka miażdżycowa [20,23,24].

Niektóre z tych związków mają zdolność obniżania ciśnienia tętniczego krwi. Wynika to z hamowania aktywności fosfodiesterazy cAMP i cGMP oraz aktywności kinazy proteinowej (np. kwercetyna powoduje relaksacje mięśni gładkich i hamuje napływ jonów do wnętrza komórek, natomiast wewnątrz komórek zapobiega przenikaniu wapnia do retikulum sarkoplazmatycznego). Flawonoidy powstrzymują także procesy zapalne, a także proliferację miocytów w ścianach tętnic co jest uznawane za czynniki rozwoju miażdżycy [23,24].

Rutyna jak i inne flawonoidy wpływa dodatnio na pracę mięśnia sercowego - skurcze serca stają się wydatniejsze i zwiększa się pojemność minutowa. Flawonoidy dodatkowo działają korzystnie w przypadku zatrucia substancjami chemicznymi np. alkoholem metylowym czy też nadmiernym nagromadzeniem kwasu mlekowego [22,23].

Miażdżyca jest to choroba wieloczynnikowa o złożonej patogenezie. Jednym z czynników inicjującym powstawanie miażdżycy jest zaburzenie funkcji śródbłonka naczyń krwionośnych. Tlenek azotu jest jednym z głównych mediatorów tego procesu. W warunkach fizjologicznych, w naczyniach krwionośnych, ma on działanie antyoksydacyjne przeciwzapalne, a także działa rozkurczowo. W warunkach stresu oksydacyjnego, który towarzyszy stanom zapalnym, jest prekursorem silnych związków prooksydacyjnych. Flawonoidy mogą zmniejszać odczyn zapalny w procesach miażdżycowych poprzez wymiatanie reaktywnych form tlenu (RFT) i tlenku azotu (NO) wraz z jego pochodnymi, a także poprzez hamowanie napływu leukocytów do miejsca zapalenia, które wchodzą w skład blaszki miażdżycowej [24]. Rozwojowi miażdżycy sprzyja także występowanie we krwi dużych ilości utlenowanych lipoprotein o niskiej gęstości (LDL), które odkładają się w ścianach naczyń krwionośnych. Flawonoidy pełnią funkcję ochronną w stosunku do lipoprotein osocza krwi. Ich właściwości chelatujące zmniejszają występowanie RFT w osoczu co zapobiega utlenianiu frakcji LDL, a w konsekwencji zapobiega powstawaniu blaszek miażdżycowych. Mechanizmy przeciwmiażdżycowego działania flawonoidów polegają również na:

• hamowaniu reduktazy HMG-CoA (np. hesperytyna), co prowadzi do obniżenia poziomu cholesterolu we krwi;

• obniżeniu przez np. kwercetynę czy luteolinę zdolności monocytów do adhezji do nabłonka naczyń i przenikania przez ściany naczyń;

• hamowaniu przez np. kwercetynę i baikaleinę proliferacji mięśni gładkich naczyń;

• hamowaniu przez mirycetynę czy kwercetynę agregacji trombocytów [24,31,37].

Flawonoidy wykazują korzystny wpływ na czynność płytek krwi. Oddziaływują z integrynami płytek utrudniając tym samym ich zlepianie. Istnieją dane potwierdzające, że aktywność antyagregacyjna flawonoidów jest związana z metabolizmem NO. Stymulują one powstawanie NO w śródbłonku naczyniowym i równocześnie hamują syntezę 12-HETE (związek upośledzający czynność śródbłonka). Przyczyniają się przy tym do zahamowania syntezy tromboksanu A i aktywności fosfolipazy C. Działanie antyagregacyjne uzasadnia się również zdolnością flawonoidów (np. kwercetyny, rutyny, trokserutyny) do hamowania aktywności takich enzymów, jak fosfodiesteraza i cyklooksygenaza [24,32,37].

1. Flawonoidy w leczeniu cukrzycy

Cukrzyca jest chorobą, której powstawanie wiąże się z upośledzeniem produkcji i wydzielania insuliny lub niewrażliwością komórek docelowych na ten hormon, co prowadzi do zaburzenia poziomu glukozy we krwi. Badania doświadczalne wykazały, że niektóre flawonoidy wykazują właściwości przeciwcukrzycowe.

Badania przeprowadzone in vivo i in vitro wykazały, ze epikatechina może stymulować syntezę insuliny i podwyższać poziom cAMP w komórkach β trzustki, co zwiększa wydzielanie tego hormonu. Ponadto przekształcanie proinsuliny w insulinę jest intensywniejsze i poziom insuliny we krwi się zwiększa. Działanie hipoglikemiczne natomiast wykazuje 3-galusan epigalokatechiny, który hamuje syntezę glukozy w hepatocytach. Daidzeina, luteolina i 7-O-glukozyd luteoliny, hamują aktywność enzymów α-amylazy
i α-glukozydazy, a glikozydy kwercetyny osłabiają działanie transporterów glukozy, dzięki czemu mogą spowolnić wchłanianie glukozy w jelicie, co zapobiega to gwałtownemu zwiększeniu ilości glukozy we krwi po posiłku. Wykazano również, że flawonoidy (głównie kwercetyna) chronią cukrzyków przed pojawieniem się zaćmy. Główną przyczyną tego objawu jest odkładanie się w gałce ocznej sorbitolu, którego synteza jest katalizowana przez reduktazę aldozolową. Kwercetyna jest inhibitorem tego enzymu przez co może opóźniać utratę wzroku [24,33].

Flawonoidy w terapii AIDS

Flawonoidy wydają się być potencjalnym czynnikiem terapeutycznym w terapii chorych na AIDS. Wykorzystanie tych związków jest możliwe dzięki temu, że są one w stanie ograniczyć namnażanie wirusa, co jest najważniejszym czynnikiem w terapii tej choroby. Hamowanie proliferacji wirusa HIV jest możliwe dzięki takim właściwościom flawonoidów:

• (-)-epikatechina, baikalina, baikaleina, kwercetyna i mirycetyna mogą działać jak inhibitory odwrotnej transkryptazy - kluczowego enzymu koniecznego do rozwoju HIV;

• (-)-epikatechina, EGCG i baikalina mogą hamować wnikanie cząsteczki wirusa do wnętrza komórki poprzez zaburzenie interakcji białek otoczki wirusa z cząsteczkami powierzchniowymi atakowanych komórek;

• kwercetyna może hamować aktywność wirusowego białka Vpr, odpowiedzialnego za zwiększenie wydajności namnażania wirusa w komórkach gospodarza oraz takich enzymów, jak integrafy oraz proteinazy. [23,24]

1. Wpływ na ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy

Działanie związków fenolowych na ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy może wynikać z ich powinowactwa do receptorów benzodiazepinowych GABA i aktywowania tych receptorów.

Ostatnio prowadzone badania wskazują, że galusan epikatechiny w znacznym stopniu zmniejsza uszkodzenia OUN w przebiegu niedokrwienia dzięki właściwościom antyoksydacyjnym i przez modulowanie jednego z istotnych dla stanu zapalnego enzymów - syntetazy tlenku azotu (NOS) [23].

1. Kwercetyna

Kwercetyna jest flawonoidem szeroko rozpowszechnionym w przyrodzie. Nazwa pochodzi z łac. quercetum - las dębowy i po raz pierwszy została użyta w roku 1857 roku. Zaliczana jest do grupy flawonoli, najczęściej występuje w postaci glikozydu, a zwłaszcza rutozydu, jednakże często występuje również w postaci wolnej, czyli aglikonu. Kwercetyna w materiale roślinnym występuje w ponad 140 różnych strukturalnie pochodnych. Występuje między innymi w jabłkach, cebuli (zwłaszcza czerwonej), herbacie. Jest to naturalnie występujący inhibitor polarnego transportu auksyny. Jest ona również budulcem dla innych flawonoidów [34].

1. Budowa i właściwości

Kwercetyna, czyli 3,5,7,3´,4´-pentahydroksyflawon jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych związków flawonoidowych. Jej wzór strukturalny to C₁₅H₁₀O_7. Składa się z trzech pierścieni i pięciu grup hydroksylowych. Otrzymana z surowca roślinnego w postaci krystalicznej jest praktycznie nierozpuszczalna w wodzie, a ponadto ma dobrą wchłanialność z przewodu pokarmowego i posiada charakter lipofilny. Dobrze rozpuszcza się w DMSO, alkaliach i pirydynie, a jej stała dysocjacji dla grupy OH w pozycji C-3 wynosi 5, dla pozostałych grup OH przy pierścieniach A i B wynosi 10. Jak większość związków z tej grupy posiada ona właściwości antyoksydacyjne, zaliczana jest do grupy tzw. „wymiataczy wolnych rodników”, w związku z tym ma ona zastosowanie w spowalnianiu procesów starzenia jak i w samej geriatrii zwłaszcza z witaminą C. Stwierdzono, że poprzez hamowanie enzymu hialuronidazy zmniejsza ona przepuszczalność naczyń krwionośnych. Ponadto, dzięki łagodzeniu skutków napromieniowania, może mieć zastosowanie w łagodzeniu skutków ubocznych radioterapii nowotworów [35].

Rys.9 Struktura chemiczna kwercetyny.

1. Właściwości antyoksydacyjne

Kwercetyna jako przeciwutleniacz chroni komórki, błony komórkowe oraz DNA przed uszkodzeniami spowodowanymi przez wolne rodniki. Odgrywa to ważną rolę w profilaktyce wielu chorób, w tym raka. Przyczynia się również do spowalniania procesów starzenia się organizmu. Poprzez ochronę lipoprotein transportujących tłuszcze we krwi przyczynia się do hamowania rozwoju miażdżycy i choroby sercowo-naczyniowej. Chroni komórki oczu przed szkodliwym promieniowaniem UV i przed innymi czynnikami oksydacyjnymi.

Swoje właściwości antyoksydacyjne kwercetyna zawdzięcza dzięki obecności grup hydroksylowych w pierścieniu B. Wykazane zostały one dzięki badaniom porównawczym nad właściwościami antyoksydacyjnymi pochodnych C(3)-OH i C(4')-OH kwercetyny. W reakcji z DPPH kwercetyna jest donorem dwóch atomów wodoru i zostaje przekształcona w formę pośrednią reakcji, czyli chinon. Obecność grupy hydroksylowej przy węglu C-3 kwercetyny pozwala na jej regenerację poprzez reakcję z protonami zawartymi w roztworze. W przypadku pochodnych kwercetyny, glikozylacja węgla C(4')-OH zmniejsza jej zdolność do bycia donorem atomów wodoru, podczas gdy pochodne C(3)-OH wykazują obniżenie potencjału w porównaniu z jej formą aglikonu [38].

Rys.10 Zmiany oksydacyjne kwercetyny w reakcji z rodnikami DPPH [38].

Rys.11 Schemat blokowania rodników nadtlenowych przez kwercetynę [39].

Działanie przeciwnowotworowe

Kwercetyna posiada właściwości regulujące niektóre mechanizmy prowadzące do powstania nowotworu. Może ona miedzy innymi hamować niekontrolowane podziały komórkowe, obniżać ekspresje niektórych onkogenów, czy indukować procesy prowadzące do śmierci komórek nowotworowych [40].

W badaniach nad zastosowaniem flawonoidów w chemioterapii kwercetyna zwiększała in vitro w komórkach raka piersi stężenie doksorubicyny, a genisteina cisplatyny. Natomiast in vivo kwercetyna podwyższała przeciwnowotworowe działanie cisplatyny i busulfanu, ale nie wpływała na aktywność doksorubicyny i etopozydu [24].

Na podstawie dotychczasowych obserwacji in vitro i in vivo stwierdza się, że stężenie kwercetyny w przedziale 1-40 mM w komórkach sprzyja procesom antyoksydacyjnym. Natomiast gdy, jej stężenie przekracza 40 mM działanie zmienia się na prooksydacyjne. W zakresie niskich stężeń kwercetyna przeciwdziała oksydacyjnym uszkodzeniom materiału genetycznego, nie dopuszczając tym samym do zainicjowania procesu kancerogenezy, natomiast w dużych dawkach, stymulując procesy utleniania, prowadzi w komórkach nowotworowych do oksydacyjnych efektów cytotoksycznych prowadząc ostatecznie do ich unicestwienia na drodze apoptozy lub nekrozy. Dodatkowo, odkryto mechanizm pozwalający selektywnie niszczyć komórki nowotworowe, również za sprawą efektów prooksydacyjnych. W tym przypadku cząsteczka kwercetyny tworzy kompleks trójskładnikowy z DNA i jonem metalu, miedzią lub żelazem. Kompleks ten, za sprawą cyklu oksydacyjno-redukcyjnego metalu jest źródłem RFT, w tym rodnika hydroksylowego, co prowadzi ostatecznie do śmierci komórki nowotworowej [41,42].

Działanie przeciwzapalne

Kwercetyna skutecznie hamuje kluczowe etapy w kaskadzie mechanizmów zapalnych. Znacząco hamuje również aktywność enzymów i pośredników stanów zapalnych, przez co ma pozytywny wpływ na przebieg wszystkich procesów zapalnych. Inhibicja COX-2 przez kwercetynę, powoduje zmniejszenie syntezy między innymi prostaglandyny PGE₂ , leukotrienu B₄ i trombosanu A co prowadzi do zahamowania napływu leukcytów i wyrównania napięcia naczyń włosowatych i zmniejszenia odczynu zapalnego. Wraz z witaminą E uzupełniają się w modulowaniu procesów zapalnych np. przy artrozie, ponadto może ona blokować replikację wirusów w komórce [24].

• Albumina surowicy krwi

Albumina surowicy krwi ludzkiej (ang. human serum albumin, HSA) jest białkiem najobficiej występującym w układzie krążenia i odgrywa ważną rolę w transporcie kwasów tłuszczowych, metabolitów, i leków [44]. Jako białko transportowe odgrywa ważną rolę w wiązaniu wielu leków, co ma kluczowe znaczenie w rozprowadzaniu ich w organizmie [45]. Brak tego białka znaczenie utrudniłby walkę z chorobą, w związku z tym, że odpowiada ono za transport leków takich jak antybiotyki Albumina pozwala na związanie substancji leczniczych i rozprowadzenie ich po organizmie. Stanowi ona ok. 60% wszystkich białek zawartych w osoczu. Można ją również znaleźć w mleku i białku jaja kurzego. Charakteryzuje się okresem półtrwania ok. 20 dni i dobrą rozpuszczalnością w wodzie [44].

1. Struktura białka

Struktura albuminy jest bardzo prosta, ale reprezentuje model struktury czwartorzędowej. Nie posiada ona żadnych grup prostetycznych, glikanów, czy lipidów. Gen albuminy ludzkiej ma długość 16,961 nukleotydów od domniemanego miejsca czapeczki do miejsca przyłączenia ogona poli(A). Masa molowa białka wynosi 67000 Da i jest dosyć duża jak na fakt, że białko zbudowane jest z 585 aminokwasów [64].

Rys.12 To jest skrystalizowana wersja albuminy ludzkiej surowicy. Reprezentowane są łańcuchy A i B [Protein Data Bank].

Jak widać na powyższym rysunku albumina w około 67% składa się z α-helis. Struktura ta pozwala na wiązanie cząsteczek o dużej różnorodności. Albumina składa się z kilku głównie heliakalnych domen, które połączone są ze sobą siedemnastoma mostkami disiarczkowymi [64].

Synteza

U ludzi synteza albuminy ma miejsce w wątrobie w ilości 12g do 20g dziennie. Po zsyntetyzowaniu jest przenoszona do wnętrza naczyń jak i poza naczynia. W naczyniach, w osoczu znajduje się około 40% całkowitej ilości albuminy, podczas gdy w płynach tkankowych gdzie stężenie albuminy jest niższe, ale pojemność znacznie wyższa znajduje się jej 60%. W skórze i mięśniach zawiera się około 15% całkowitej albuminy. Nie jest ona gromadzona w wątrobie, lecz jest wydzielana do krążenia wrotnego tak długo jak długo jest syntetyzowana. HSA jest produkowana w wątrobie jako pre-proalbumina, czyli tetrameryczne białko zbudowane z czterech jednakowych łańcuchów. N-końcowy peptyd jest usunięty zanim powstające białko zostanie uwolnione z szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. Proalbumina w aparacie Golgiego przechodzi proces glikozylacji, w którym do cząsteczki białka dołączane są węglowodany. Ta modyfikacja prowadzi do powstania albuminy, która jest wydzielana do krwioobiegu [64].

Funkcje

Albumina jest białkiem najliczniej występującym w osoczu. Albuminy dzięki przewadze aminokwasów kwaśnych posiadają silny ładunek ujemny, co nie wykazuje żadnego związku z wiązaniem molekuł [65]. Jej giętka struktura pozwala substancjom na tworzenie z nią kompleksów. Cząsteczkami, które ulagają najmocniejszemu wiązaniu są hydrofobowe aniony organiczne jak i kwasy tłuszczowe. Kwasy tłuszczowe są kwasami karboksylowymi z długimi nierozgałęzionymi łańcuchami alifatycznymi [64]. Niezestryfikowane kwasy są transportowane przez HSA i dzięki temu łatwiej mogą zostać usunięte z komórek.

Nie tylko kwasy tłuszczowe są transportowane przez albuminę, ale również hormony tarczycy [44]. Większość hormonów tarczycy znajdujących się we krwi jest połączona z białkami, w tym z HSA. Hormony tarczycy występują prawie we wszystkich komórkach i są ważnym czynnikiem w rozwoju ciała ludzkiego. Powodują one wzrost wskaźnika podstawowej przemiany materii, syntezy białek, regulują wzrost i dojrzewanie kości. HSA transportuje również hormony rozpuszczalne w tłuszczach [64].

Pełnią one kluczową rolę w utrzymaniu ciśnienia onkotycznego niezbędnego do utrzymania prawidłowych proporcji miedzy ilością wody zawartą we krwi, a ilością wody w płynach tkankowych [64].

Albumina ludzkiej surowicy odgrywa kluczową rolę w transporcie leków i mocno wpływa na ich dystrybucje w osoczu. Łączenie leków z HSA było dokładnie badane przez 30 lat. Naukowcy ustalili, że w HSA istnieją dwa główne miejsca wiążące dla leków. Miejsce I Sudlow's i miejsce II [45]. Dystrybucja leków kontrolowana jest przez albuminę ze względu na to, że większość z nich ulega związaniu z jej domenami wiążącymi [44].

Utlenianie albuminy

Analiza składu aminokwasowego oksydacyjnie zmodyfikowanej albuminy (AOPP-HSA) wykazuje znaczące modyfikacje reszt tyrozyny i aminokwasów zasadowych (lizyna i arginina), tryptofanu i aminokwasów zawierających siarkę. Uważa się, że modyfikacje te są głównie odpowiedzialne za zmiany konformacyjne obserwowane w HSA (np. zmniejszenie liczby α-helis). AOPP-HSA najczęściej występuje w formie wielocząsteczkowych agregatów, które prawdopodobnie są wynikiem wiązań krzyżowych i/lub mostków disiarczkowych dityrozyny [66].

• Metody fizyczne badania cząsteczek

Spektroskopia optyczna jest sposobem badania właściwości fizycznych, opartym na pomiarze emisji światła przez badane cząsteczki, a także na pomiarze ich interakcji ze światłem. Przy użyciu tej techniki możemy mierzyć skład chemiczny, strukturę oraz zmiany zachodzące w badanych cząstkach. Spektroskopia opiera się na badaniu różnych właściwości światła. W różnych warunkach różne substancje wytwarzają, odbijają lub pochłaniają światło. Światło mierzone po odbiciu, przejściu lub emisji przez badany obiekt jest rejestrowane w postaci linii widmowych. Oprócz długości fali inne cechy światła, takie jak intensywność, mogą również dostarczyć użytecznych informacji.

Absorpcja

Absorpcją światła nazywamy zjawisko pochłaniania światła w ośrodku materialnym. Fizyczny mechanizm absorpcji zależy od rodzaju promieniowania oraz właściwości ośrodka. Absorpcja promieniowania zwiększa energię układu. W procesie absorpcji światło może być pochłaniane przez cząstkę tylko w porcjach zależnych od jej struktury energetycznej. Zjawisko to poprawnie opisane jest przez mechanikę kwantową [48]. Kwant energii fali przenoszony jest przez foton, który zderza się z np. elektronem, czy jądrem atomowym. Cząstka pochłania zawsze całą energię fotonu i tylko wtedy gdy, pozwalają na to jej dopuszczalne stany kwantowe.

W wyniku absorpcji światła przechodzącego przez substancje (np. gaz) z widma światła, które pada na daną substancję zostają usunięte pochłaniane częstotliwości. Na tej podstawie można stwierdzić przez jakie substancje przechodziło światło. Zjawisko to służy do badania składu chemicznego mieszanin związków chemicznych, gazów otaczających gwiazdy, obłoków gazowych we wszechświecie.

Wielkość absorpcji światła można obliczyć na podstawie prawa Lamberta-Beera, które brzmi: jeśli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to wiązka promieniowania monochromatycznego, po przejściu przez jednorodny roztwór substancji absorbującej o stężeniu c, ulega osłabieniu według równania:

w którym I₀ - oznacza natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek absorbujący, I - natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący, x - grubość warstwy absorbującej, α - współczynnik absorpcji, e - podstawę logarytmów naturalnych. Stosunek natężenia światła przechodzącego I do padającego I₀ nazywamy transmisją. Współczynnik transmitancji oznaczany jest literą T. Transmitancja może przyjmować wartości od 0 do 1 lub jeżeli wyrażamy ją w procentach od 0 do 100%. Wskazuje ona jaka część promieniowania została przepuszczona przez substancję [47,48,49].

Inną ważną wielkością jest absorbancja (A). Absorbancja jest miarą absorpcji promieniowania i wyraża się wzorem:

gdzie: I₀ - oznacza natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek absorbujący, I - natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący, T - współczynnik transmitancji.

Cząsteczki różnych związków wykazują odmienne rozkłady poziomów energetycznych, ich właściwości absorpcyjne różnią się między sobą, co daje duże możliwości identyfikacji tych cząsteczek, określania stanu elektronów [47].

1. Fluorescencja

Na całkowitą energię cząsteczki składają się:

1. Energia elektronowa, która związana jest z położeniem elektronów, rodzajem utworzonych wiązań i odległością pomiędzy jądrami atomów wchodzących w skład cząsteczki.

2. Energia oscylacyjna, która związana jest z ze zbliżaniem lub oddalaniem atomów budujących daną cząsteczkę.

3. Energia rotacyjna, która związana jest z ruchami obrotowymi jakie mogą wykonywać molekuły cieczy lub gazu.

Cząsteczka nie może wykonywać dowolnych ruchów oscylacyjnych i rotacyjnych. Ruchy te nie mogą również być wykonywane z dowolną częstością. Wszystkie te energie przyjmują określone wartości. Zatem cząsteczka może znajdować się jedynie na ściśle określonym, charakterystycznym dla niej poziomie energetycznym, a przejścia na wyższe lub niższe poziomy wiążą się odpowiednio z absorpcją i emisją kwantów energii [48].

Sposobem dezaktywacji wzbudzonych stanów elektronowych, gdy są one następstwem absorpcji światła, jest fotoluminescencja. W zależności od czasu pomiędzy pochłonięciem, a wyemitowaniem energii wyróżnia się fluorescencję i fosforescencję. Fluorescencja to emisja światła powstająca przy przejściach cząsteczek ze wzbudzonych stanów singletowych do stanu podstawowego. Gdy czas pomiędzy pochłonięciem energii, a jej emisją jest dłuższy mówimy wówczas o fosforescencji. Jest to zjawisko emisji światła zachodzące przy przejściu cząsteczki ze stanu trypletowego do stanu podstawowego. Ze zjawiskiem fosforescencji mamy do czynienia, gdy po relaksacji oscylacyjnej następuje przejście międzysystemowe ze wzbudzonego stanu singletowego do wzbudzonego stanu tripletowego T 1 (elektrony nie są sparowane, ich spiny zwrócone są w tym samym kierunku) i dopiero później do stanu podstawowego. Przejście promieniste między stanami T₁ i S₀ jako stanami o różnej multipletowości jest zabronione, więc cząsteczka przez długi czas przebywa w elektronowym stanie wzbudzonym, nim wreszcie, łamiąc multipletową regułę wyboru, wypromieniuje foton i wróci do podstawowego stanu elektronowego [47,48].

Światło fluorescencji jest zazwyczaj emitowane przez cząsteczki aromatyczne i heterocykliczne. Cząsteczka absorbuje promieniowanie wówczas, gdy występuje w niej element struktury zwany chromoforem. W elemencie tym możliwe są przejścia elektronowe typu:
,
,
. Są to przejscia pomiędzy orbitalami molekularnymi: π - wiążącym, π* - antywiążącym, n - niewiążącym. Chromoforem może w takim razie być związek, który posiada elektrony π i n [50].

Orbital molekularny, podobnie jak atomowy, może być obsadzony przez maksymalnie dwa elektrony walencyjne o antyrównoległych spinach. Orbital molekularny łączący dwa atomy jest wynikiem kombinacji dwóch orbitali atomowych. Absorpcja promieniowania powoduje przejście elektronu z wiążącego orbitalu molekularnego o niższej energii, na molekularny orbital antywiążący o wyższej energii. Orbital antywiążący oznacza się gwiazdką. Do najważniejszych chromoforów należą grupy: azowa, nitrowa, nitrozowa, karbonylowa, tiulowa, etylenowa, układ p-chinoidowy, układ benzenowy. Czynnikiem decydującym o wielkości absorpcji jest charakter grup chromoforowych jakie występują w cząsteczkach. Często wystarcza jeden silny chromofor, aby substancja wykazywała absorpcję. Większa liczba grup chromoforowych powoduje silniejszą absorpcję, a także przesunięcie maksimum absorpcji w kierunku fal dłuższych. Przesunięcie to nosi nazwę przesunięcia batochromowego i może być wywołane występowaniem kilku sprzężonych ze sobą wiązań podwójnych lub obecnością w cząsteczce grup auksochromowych takich jak -OH lub NH_2. Grupy te same w sobie nie wywołują barwy, ale dzięki przesunięciom batochromowym zwiększają intensywność absorpcji. Przesunięcie absorpcji w kierunku fal dłuższych rośnie w szeregu: -CH₃ < -OH < -O-CH₃ < -NH₂ < -NH-CH₃ < N(CH₃)₂ [50]

Właściwości fluorescencyjne związków organicznych zależą od ich struktury. Przykładowo, widma fluorescencji węglowodorów aromatycznych o pierścieniach skondensowanych liniowo (np. antracen) leżą w zakresie fal dłuższych niż widma fluorescencji węglowodorów o tej samej liczbie pierścieni skondensowanych kątowo (np. fenantren). Podstawienie cząsteczek związków aromatycznych fluorowcami obniża fluorescencje. Obniżenie fluorescencji przez podstawienie danym atomem fluorowca F, Cl, Br i I wzmacnia się w podanym porządku. Obecność grupy - NO₂ zwykle powoduje zanik fluorescencji, natomiast grupy -OH oraz -OR często wzmacniają fluorescencję cząsteczek aromatycznych, powodując jednocześnie przesuniecie długofalowe widm [63]. Do substancji fluoryzujących należy między innymi rodamina, eozyna, rywanol, chinina, fluoresceina [48].

Rys.13 Diagram Jabłońskiego [49].

Na powyższym rysunku przedstawiony jest diagram Jabłońskiego, który obrazuje drogi powrotu cząsteczki ze stanów wzbudzonych do stanu podstawowego. Schemat przedstawia kolejne poziomy energetyczne cząsteczki wieloatomowej. Poziomem podstawowym jest poziom S₀. Pozostałe rozmieszczone są według wzrastającej energii. Wzbudzone stany singletowe oznaczone są symbolami S₁, S₂, natomist tripletowe T₁, T₂. Każdy stan elektronowy zawiera poziomy oscylacyjne. Promieniste przejścia pomiędzy stanami elektronowymi na diagramie zaznaczono pionowymi liniami, aby podkreślić ich natychmiastowy charakter. Przejścia absorpcyjne trwają około 10^-15 s, jest to czas zbyt krótki, aby jądro zdążyło ulec znaczącemu przesunięciu.

Wydajność kwantowa fluorescencji jest ważnym pojęciem, które pozwala scharakteryzować daną substancję fluoryzującą. Definiuje się ją jako stosunek liczby kwantów promieniowania wyemitowanego do liczby kwantów zaabsorbowanych promieniowania wzbudzającego. Substancje charakteryzujące się wysoką wydajnością kwantową, bliską jedności, emitują światło o dużym natężeniu [49].

1. Anizotropia fluorescencji

W pomiarach anizotropii fluorescencji próbkę wzbudza się światłem ciągłym, spolaryzowanym. W izotropowym roztworze fluorofory są zorientowane przypadkowo. Wzbudzeniu z największym prawdopodobieństwem ulegają te cząsteczki fluoroforu, których dipol przejścia absorpcyjnego jest równoległy do wektora pola elektrycznego światła padającego na próbkę. Zjawisko to nosi nazwę fotoselekcji. Podstawą pomiaru anizotropii jest fakt, że wzbudzone cząsteczki emitują światło zdepolaryzowane. Intensywność światła emitowanego mierzy się przy dwóch ustawieniach polaryzatora obserwacyjnego: równolegle i prostopadle do wektora elektrycznego wzbudzenia.

Wie1kość mierzonej maksymalnej anizotropii fluorescencji w rzeczywistości uzyskiwana w pomiarach jest niższa od maksymalnej, ze wzg1ędu na częściową depolaryzację światła emitowanego. Główną tego przyczyną jest dyfuzja rotacyjna cząsteczki. Jeżeli pomiędzy absorpcją i emisją nie nastąpi rotacja cząsteczki, to I_|| > I_⊥, a anizotropia fluorescencji będzie miała wartość maksymalną jaką można uzyskać dla roztworu, równą 0,4. Ruchy rotacyjne występujące w czasie trwania stanu wzbudzonego zależą od 1epkości rozpuszczalnika oraz rozmiaru i kształtu rotujących cząsteczek. Im większa szybkość rotacji, tym wyższy stopień depolaryzacji i niższa, mierzona anizotropia [49].

Korelacyjny czas rotacji małych molekuł jest znacznie krótszy niż czas życia fluorescencji. Anizotropia fluorescencji ma wartość bliską 0. Z kolei anizotropia światła fluorescencji emitowanego przez duże, wolno obracające się cząsteczki (lub cząsteczki przywiązane do dużych układów - membran lub cząsteczek białek) zanika wolno, a anizotropia fluorescencji przyjmuje w takim wypadku wartość bliską 0,4 [48].

Obrót fluoryzujących molekuł w czasie życia stanu wzbudzonego prowadzi do dalszego zmniejszania się anizotropii zgodnie z zależnością

gdzie
oznacza korelacyjny czas rotacji, t czas. Krzywe zaników anizotropii dostarczają informacji o tempie rotacji fluoryzujących molekuł.

• Cel pracy

Celem pracy było:

1. wykazanie właściwości antyoksydacyjnych wybranego flawonoidu - kwercetyny

2. pokazanie interakcji pomiędzy kwercetyną a białkiem surowicy ludzkiej - albuminą

3. przebadanie wpływu anionorodnika ponadtlenkowego na utlenianie HSA

• Aparatura pomiarowa i metody badawcze

Widma emisji fluorescencji oraz anizotropię fluorescencji rejestrowano za pomocą spektrofluorymetru PTI (Photon Technology International Inc. - Birmingham USA). W celu zmierzenia anizotropii fluorescencji stosowano przystawkę do spektrofluorymetru PTI zawierającą polaryzator (umieszczony w kanale wzbudzenia) i analizator (umieszczony w kanale emisji). Widma absorpcji były rejestrowane za pomocą spektrofotometru UV-VIS JASCO V-550. Stała temperatura badanych roztworów równa 37ºC utrzymywana była za pomocą ultratermostatu TW2.03 (ELMI).

1. ORAC-FL

ORAC (ang. Oxygen Radical Absorbance Capacity), jest to zdolność pochłaniania reaktywnych form tlenu przez przeciwutleniacze. W metodzie ORAC-FL mierzona jest pojemność antyutleniająca. W roli sondy fluorescencyjnej wykorzystywana jest fluoresceina. Metoda pomiaru ORAC-FL jest oparta na technice zastosowanej po raz pierwszy przez Glazera [52]. Wykorzystuje się a niej reakcję utleniania cząsteczek substancji fluorescencyjnej po zmieszaniu jej ze związkiem dostarczającym wolnych rodników.

W metodzie mierzony jest zanik świecenia (fluorescencji) fluoresceiny w wyniku reakcji z rodnikami generowanymi przez azoinicjatora jakim jest AAPH (2,2'-azobis(2-amidino-propane) dihydrochloride). W obecności antyoksydantu fluoresceina jest chroniona przed rozpadem oksydacyjnym, w wyniku czego opóźniony zostaje zanik fluorescencji. Intensywność fluorescencji spada w miarę postępowania procesu utleniania. Zanik fluorescencji rejestrowany jest w postaci wykresów przedstawiających zależność intensywności fluorescencji od czasu. Pojemność antyoksydacyjna próbki obliczana jest przez odjęcie od pola pod wykresem widma fluorescencji próbki z antyoksydantem pola pod wykresem widma fluorescencji próbki bez antyoksydantu [52,53].

Fluoresceina jest organicznym związkiem chemicznym będącm barwnikiem o masie molowej 332,21 g/mol. W roztworach zasadowych wykazuje zielonożółtą fluorescencję. Posiada maksimum absorpcji dla 494 nm i maksimum emisji dla 521 nm.

FITC - izotiocyjanian fluoresceiny - pochodna fluoresceiny posiadająca aktywną grupę izotiocyjanową podstawioną w miejscu atomu wodoru w dolnym pierścieniu struktury. Modyfikacja ta przeprowadzona jest aby zwiększyć powinowactwo FITC do białek, poprzez zwiększenie specyficzności w kierunku amin pierwszorzędowych. Widma absorpcji i emisji wykazują maksimum odpowiednio 495 nm/521 nm. Tak samo jak fluoresceina wykazuje zielonożółta fluorescencję [54].

AAPH - 2,2'-diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorku - rozkład AAPH generuje azot molekularny i dwa rodniki węglowe, które mogą reagować z tlenem cząsteczkowym generując rodniki peroksylowe. Okres połowicznego rozpadu wynosi 175 godzin w temperaturze 37°C w neutralnym pH, masa molowa wynosi 271,19 g/mol [55].

Kwercetyna - organiczny wielopierścieniowy związek aromatyczny pochodzenia roślinnego o wzorze C₁₅H₁₀O₇ z grupy flawonoidów glikozydowych, będący pochodną flawonu. Stosowany w analizie chemicznej jako odczynnik. Żółte, bezwonne, igiełkowate kryształy o masie molowej 302,24 g/mol [34].

HSA (human serum albumin) - albumina ludzka; najobficiej występujące białko we krwi ludzkiej, produkowane przez wątrobę. Stanowi połowę białek krążących w osoczu krwi. Transportuje szereg ligandów takich jak hormony, kwasy tłuszczowe, miedź i hem. Organizm ludzki produkuje ok. 3 g na dobę. Masa molowa wynosi 66000 g/mol [56].

Metoda pomiaru produktów utleniania białek (AOPP)

Stężenie AOPP (advanced oxidation protein products) oznaczono metodą spektrofotometryczną. Pomiar oparty był na barwnej reakcji końcowych produktów oksydacji białek z jodkiem potasu w środowisku kwaśnym jakie tworzy kwas octowy - reakcja Witko-Sarsat.

. Wyniki i wnioski

Przygotowanie roztworów podstawowych

Kwercetyna i AAPH byłay zakupione w Sigma-Aldrich.

Próbka roztworu podstawowego kwercetyny o stężeniu 25mM została przygotowana przez rozpuszczenie proszku 99,8% w alkoholu etylowym. Dodatkowo każdorazowo przed dodaniem do próbki podlegającej badaniu, kwercetyna była 100-krotnie rozcieńczana w PBS o pH=7,4 w celu eliminacji obecności alkoholu z próbki. Stężenie roztworu podstawowego fluoresceiny wynosiło 5mM i zostało uzyskane przez rozpuszczenie proszku w wodzie destylowanej. Stężenie AAPH wynosiło 555mM i zostało uzyskane przez rozpuszczenie proszku w buforze PBS o pH 7,4. Stężenie roztworu podstawowego HSA wynosiło 100µM i zostało uzyskane przez rozpuszczenie proszku w wodzie destylowanej. W badaniach użyty został także 30% roztwór kwasu octowego oraz 1,16 M roztwór jodku potasu.

Widma absorpcji i fluorescencji były rejestrowane dla próbek znajdujących się w temperaturze 37^oC, w roztworze PBS o pH=7,4. Pomiary były wykonywane bezpośrednio po dodaniu odpowiednich objętości roztworów podstawowych do roztworu PBS. Po każdym dodaniu odpowiedniego roztworu podstawowego próbka była starannie mieszana za pomocą Vortex'u.

Widma absorpcji kwercetyny w obecności rodników generowanych przez APPH.

W badaniu widm fluorescencji wykorzystano próbki roztworów podstawowych kwercetyny i AAPH.

Do badania użyto 120µl roztworu podstawowego kwercetyny i 450µl roztworu podstawowego AAPH. Każda z nich była uzupełniana buforem PBS pH 7,4 do objętości 3ml.

Przed rozpoczęciem pomiarów spektrofotometr kalibrowano za pomocą rozpuszczalnika, którym był PBS.

Rys.14 Absorbancja kwercetyny w różnych przedziałach czasowych. Widma przedstawiają ewolucję czasową kwercetyny z formy nieutlenionej do formy utlenionej. Utlenianie kwercetyny było wywołane obecnością wolnych rodników generowanych przez AAPH. Pomiary były prowadzone dla roztworu kwercetyny o stężeniu 10µM w PBS o temperaturze 37^oC i pH=7,4.

Widma utleniania kwercetyny zostały przedstawione na rysunku 14. Rejestracja pojedynczego widma wykonywana była przez pierwsze 20 min co 5 min, a po upływie 20 min co 10 min. Zmiana odstępu czasu pomiędzy rejestracją widm, po upływie 20 minut od rozpoczęcia pomiaru, była wywołana spowolnieniem procesu utleniania kwercetyny. Na powyższym rysunku możemy zaobserwować wzrost natężenia pasma przy długości fali 327nm oraz spadek pików przy długości fal 268 nm i 376 nm. Pik przy długości fali 327 nm powstał w wyniku oddania przez kwercetynę dwóch atomów wodoru znajdujących się przy węglu C3 i C4 w pierścieniu B. Skutkiem tego po upływie 60 min nastąpiło całkowite utlenianie kwercetyny. Zatem możemy potwierdzić działanie przeciwutleniające związku.

     Rys.15 Schemat blokowania rodników nadtlenowych przez kwercetynę [39].

Rys.16 Zależność trzech pików absorbancji z rysunku 14 w funkcji czasu. Zmiana absorbancji kwercetyny w funkcji czasu spowodowana była dodaniem AAPH. Zaobserwować można wyraźny wzrost pasma przy długości fali 327 nm, który związany jest z utlenianiem kwercetyny.

Widma emisji fluorescencji fluoresceiny w obecności kwercetyny o różnych stężeniach

W badaniu widm fluorescencji wykorzystano próbki roztworów podstawowych kwercetyny, fluoresceiny i AAPH.

Próbki kwercetyny o stężeniach 3,75 µM; 6,25 µM; 8,75 µM; 9,375 µM były przygotowane przez dodanie odpowiednio 30 µl, 50 µl, 70 µl, 75 µl roztworu podstawowego kwercetyny, a także 450 µl roztworu podstawowego AAPH i 10 µl roztworu podstawowego fluoresceiny. Każda z nich była uzupełniana buforem PBS pH 7,4 do objętości 2 ml. Próbka stanowiąca krzywą wzorcową nie zawierała kwercetyny.

Rys.17 Natężenie fluorescencji fluoresceiny w funkcji czasu w obecności kwercetyny o różnych stężeniach. Krzywa wzorcowa (czerwona linia) nie zawierała kwercetyny. Zaobserwować można wydłużanie czasu fluorescencji fluoresceiny, który jest powiązany ze wzrostem stężenia kwercetyny. Pomiary były prowadzone w roztworze PBS o pH=7,4 i temperaturze 37^oC.

Doświadczenie miało na celu wykazanie właściwości antyoksydacyjnych kwercetyny, poprzez wykazanie jej ochronnego wpływu na fluoresceinę. Pomiary natężenie fluorescencji dla każdego stężenia kwercetyny były powtarzane co 5 minut. Kwercetyna miała spowodować wydłużenie czasu fluorescencji fluoresceiny, przez jej ochronę przed rodnikami generowanymi przez AAPH. Na rysunku 17 przedstawiono zależność szybkości spadku fluorescencji fluoresceiny w czasie od stężenia kwercetyny. Im większe stężenie kwercetyny tym wolniejszy spadek fluorescencji, co potwierdza właściwości antyoksydacyjne związku.

Rys. 18 Zależność wartości pola pod wykresem (∆P) od stężenia kwercetyny. ∆P otrzymano poprzez obliczenie różnicy miedzy polem pod krzywą z antyoksydantem, a polem pod krzywą wzorcową. Wartości pola były obliczone dla stężeń kwercetyny użytych w badaniu widm emisji fluoresceiny, które zostały przedstawione na rysunku 17.

∆P otrzymano poprzez obliczenie różnicy miedzy polem pod krzywą fluorescencji z antyoksydantem, a polem pod krzywą wzorcową. Obliczeń dokonano przy użyciu narzędzia Microsoft Excel.

Na rysunku 18 obserwujemy liniowy wzrost właściwości antyoksydacyjnych. Wzrost ten jest wprost proporcjonalny w stosunku do stężenia kwercetyny. Co oznacza, że dwukrotne zwiększenie stężenie kwercetyny zwiększa nam dwukrotnie właściwości antyoksydacyjne.

Pomiar natężenia fluoryzacji kwercetyny w różnych stężeniach HSA

W doświadczeniu użyto roztworów podstawowych HSA w ilościach odpowiednio 0 µl, 60 µl, 90 µl, 150 µl, 200 µl, 450 µl, 600 µl, 900 µl oraz roztworu podstawowego kwercetyny w ilości 120 µl.

Fluoryzacja kwercetyny jest zależna od tego czy jest ona związana czy też nie.

Rys. 19 Fragmenty widma zależności natężenia fluoryzacji kwercetyny od stężenia HSA. Widmo nie zawierające HSA (linia czerwona) wykazuje fluoryzację bliską zeru. Każde z kolejnych widm zawiera HSA. Wraz ze wzrostem stężenia albuminy możemy zaobserwować wzrost natężenia fluoryzacji kwercetyny. Pomiary były prowadzone dla roztworu kwercetyny o stężeniu 10µM w PBS o pH=7,4 i temperaturze 37 ^oC.

Fluoryzacja kwercetyny jest zależna od tego czy jest ona związana czy też nie. Jak widać na rysunku 19 wraz ze wzrostem stężenia HSA zauważalny jest wzrost natężenia fluoryzacji. Powodem tego wzrostu jest to, że w wyższym stężeniu HSA występuje więcej molekuł, które przyłączają kwercetynę i dlatego świecenie jest intensywniejsze. Przy stężeniu białka 30 µM nastąpiło całkowite wysycenie kwercetyny i zaobserwowano maksimum natężenia fluorescencji. Możemy też zauważyć przesuwanie się widma z długości fali 535 nm do długości 520 nm.

2. Rejestracja widma fluoryzacji kwercetyny i HSA metodą ORAC(FL)

Rejestracja widm emisji fluorescencji była przeprowadzana dla próbek znajdujących się w temperaturze 37^oC w roztworze PBS o pH=7,4. Pomiary były wykonywane bezpośrednio po dodaniu odpowiednich objętości roztworów podstawowych do roztworu PBS.

Rys.20 Natężenie fluorescencji fluoresceiny w funkcji czasu w zależności od stężenia HSA i kwercetyny. Przedstawione zostały pomiary natężenia fluorescencji dla roztworów kwercetyny i HSA oraz dla roztworów kwercetyny i HSA w różnym stosunku stężeniowym. Linie przedstawiają: krzywa wzorcowa (czarna linia), kwercetyna (czerwona linia), HSA (niebieska linia), kwercetyna i HSA w stosunku 1:1 (zielona linia, kwercetyna i HSA w stosunku 1:3 ( różowa linia). Użyto kwercetyny w stężeniu 10µM i HSA w stężeniu 10 µM i 30 µM.

Próbki kwercetyny i HSA o stężeniu 10 µM były przygotowane przez dodanie odpowiednio 80 µl roztworu podstawowego kwercetyny i 200 µl roztworu podstawowego HSA, a także 450 µl roztworu podstawowego AAPH i 10 µl roztworu podstawowego fluoresceiny. Każda z nich była uzupełniana buforem PBS pH 7,4 do objętości 2 ml. Po każdym dodaniu odpowiedniego roztworu podstawowego próbka była starannie mieszana za pomocą Vortex'u

Rysunek 20 przedstawia spadek fluorescencji fluoresceiny w czasie dla kwercetyny, HSA i połączenia kwercetyny z HSA w stosunku 1:1 i 1:3. Zaobserwować można wzrost właściwości antyoksydacyjnych kwercetyny wraz ze wzrostem stężenia białka. Z rysunku możemy również wywnioskować, że HSA również posiada właściwości antyoksydacyjne, a wspólne występowanie obu związków powoduje połączenie ich siły antyoksydacyjnej.

Rys.21 Zależność wartości pola pod wykresem od pojemności antyutleniającej kwercetyny z HSA. ∆P otrzymano poprzez obliczenie różnicy między polem pod krzywą z antyoksydantem, a polem pod krzywą wzorcową. Obliczenia pola były wykonane dla stężeń kwercetyny i HSA użytych w badaniu widm emisji fluorescencji, które zostały przedstawione na rysunku 20. Słupek numer 4 i 6 powstał poprzez odpowiednie dodanie wartości słupków 1 i 2 i przedstawia wartości teoretyczne.

∆P otrzymano poprzez obliczenie różnicy miedzy polem pod krzywą z antyoksydantem, a polem pod krzywą wzorcową.

Rysunek 21 przedstawia wartości pola pod wykresem badanych próbek. Słupek numer 1 odpowiada wartość pola pod wykresem kwercetyny, numer 2 wartość pola pod wykresem HSA. Kolejny, czyli numer 3, przedstawia wartość pola pod wykresem kwercetyny i HSA w stosunku 1:1, natomiast słupek numer 4 powstał przez dodanie wartości pola pod wykresem kwercetyny (słupek nr 1) do wartości pola pod wykresem HSA (słupek nr 2). Kolejny piąty słupek odpowiada za pole pod wykresem kwercetyny i HSA w stosunku 1:3. Ostatni słupek, numer 6, został obliczony analogicznie do słupka czwartego, czyli przez dodanie wartości pola pod wykresem HSA (słupek nr 2) pomnożonej 3-krotnie, do wartości pola pod wykresem kwercetyny (słupek nr 1). Po porównaniu słupków 3 i 4 oraz 5 i 6 możemy stwierdzić, że kwercetyna i HSA w połączeniu wykazują obniżone działanie antyoksydacyjne w stosunku do działania jakie wykazują osobno.

Rys.22 Wartość anizotropii fluorescencji dla fluoresceiny i FITC. Brak połączenia fluoresceiny z białkiem. Pomiar miał za zadanie wykluczyć możliwość ochronnego wpływu białka na fluoresceinę.

Rysunek 22 przedstawia pomiar anizotropii fluorescencji dla fluoresceiny z HSA. Pomiar ten miał za zadanie wykazać, czy fluoresceina łączy się z białkiem, miało to na celu wykluczyć możliwość ochronnego wpływu białka na fluoresceinę. Ochronny wpływ miałby polegać na niedostępności, związanych przez białko, molekuł fluoresceiny dla rodników generowanych przez AAPH. Pomiar anizotropii był bliski zeru, co oznacza, że nie doszło do związania cząsteczek fluoresceiny z białkiem. Dla porównania umieszczono pomiar anizotropii fluorescencji dla HSA z FITC, w którym to nastąpiło połączenie pomiędzy molekułami. FITC jest zmodyfikowaną formą fluoresceiny, która ma zwiększone powinowactwo do białek.

Rejestracja widma fluorescencji kwercetyny z HSA

Próbki zawierały stężenie kwercetyny w stosunku do HSA 1:1. Do badania użyto 80 µl roztworu podstawowego kwercetyny i 200 µl roztworu podstawowego HSA , a także 450 µl roztworu podstawowego AAPH. Każda z nich była uzupełniana buforem PBS pH 7,4 do objętości 2 ml.

Rys.23 Natężenie fluoryzacji kwercetyny z HSA w funkcji czasu w zależności od obecności AAPH. Zaobserwować można wyraźną różnicę w czasie fluoryzacji kwercetyny w momencie pojawienia się rodników (czerwona linia) w porównaniu z czasem fluoryzacji kwercetyny przy braku rodników (czarna linia). Stężenie kwercetyny i HSA wynosiło 10µM.

Doświadczenie miało na celu wykazać, czy właściwości antyoksydacyjne kwercetyny są obserwowane gdy jest ona połączona z HSA. Kwercetyna wykazuje fluoryzację tylko w przypadku połączenia z białkiem, w przypadku utleniania kwercetyny fluorescencja spada. Na rysunku 23 czas fluoryzacji kwercetyny w obecności rodników jest krótszy, co świadczy o tym, że pomimo połączenia z HSA wykazuje ona zdolność do blokowania działania rodników poprzez szybsze utlenianie. Oznacza to, że ma ona zdolność do odłączania się od białka, gdy w pobliżu pojawiają się wolne rodniki.

Pomiar absorpcji utlenionego HSA

Zaawansowane produkty utleniania białek (AOPP - advanced oxidation protein products) zostały zidentyfikowane na podstawie metody opracowanej przez Witko-Sarsat i wsp.. Metoda oparta jest na reakcji tych związków z jodkiem potasu w środowisku kwaśnym i pomiar absorbancji przy długości fali 340 nm.

Rys.24 Absorbancja HSA w różnych przedziałach czasowych w zależności od stopnia degradacji białka. Fragmenty widma absorbancji przedstawiają ewolucję czasową HSA wywołaną utlenianiem białka przez rodniki generowane przez AAPH. Rejestracja poszczególnego widma absorbancji była prowadzona co 5 minut.

Badana próbka uzupełniona była roztworem PBS pH=7,4 do objętości 3 ml i zawierała 200 µl kwasu octowego, 100 µl jodku potasu, 200 µl HSA, 450 µl AAPH oraz 80 µl kwercetyny.

Stężenie AOPP (advanced oxidation protein products) oznaczono metodą spektrofotometryczną opartą na reakcji barwnej końcowych produktów oksydacji białek z jodkiem potasu w środowisku kwaśnym jakie tworzył nam kwas octowy. Na rysunku 24 możemy zaobserwować wzrost absorbancji przy długości fali 360 nm, co jest ściśle skorelowane z oksydacją białka. Oksydacja albuminy wpływa na modyfikacje jej składu aminokwasowego. Uważa się, że modyfikacje te są głównie odpowiedzialne za zmiany konformacyjne obserwowane w HSA (np. zmniejszenie liczby α-helis) [57].

• Podsumowanie

Na podstawie przeprowadzonych badań można wysunąć następujące wnioski:

• badania widma absorpcji kwercetyny wykazały że posiada ona właściwości antyoksydacyjne. Wzrost absorbancji przy długości fali 327 nm świadczył o tym, że kwercetyna uległa utlenieniu. W związku z tym możemy stwierdzić, że oddała ona dwa atomy wodoru w celu neutralizacji wolnych rodników.

• na podstawie badań przeprowadzonych metodą ORAC-FL można stwierdzić, że kwercetyna jest antyoksydantem, gdyż jest w stanie chronić cząsteczki fluoresceiny przed szkodliwym działaniem wolnych rodników generowanych przez AAPH. Ponadto czas ochrony fluoresceiny zależał od stężenia kwercetyny jakie zostało zastosowane. Im wyższe stężenie kwercetyny, tym czas ochrony się wydłużał, co oznacza, że kwercetyna chroniła cząstki fluoresceiny do momentu, w którym uległa całkowitemu utlenieniu. Po obliczeniu pola pod wykresem dla poszczególnych stężeń kwercetyny jakie zostały zastosowane, można powiedzieć, że jej właściwości antyoksydacyjne rosną wraz ze wzrostem stężenia, a co więcej wzrost ten jest wprost proporcjonalny do wzrostu jej stężenia.

• pomiar natężenia fluorescencji kwercetyny z HSA wykazał, że kwercetyna łączy się z albuminą. Fluorescencja kwercetyny jest zależna od tego czy jest ona związana czy też nie. Wraz ze wzrostem stężenia HSA zauważalny jest wzrost natężenia fluorescencji. Powodem tego wzrostu jest to, że w wyższym stężeniu HSA występuje więcej molekuł, które przyłączają kwercetynę i dlatego fluorescencja jest intensywniejsza. Przy stężeniu białka 30 µM nastąpiło całkowite wysycenie kwercetyny i zaobserwowano maksimum natężenia fluorescencji.

• pomiar natężenia fluorescencji kwercetyny w połączeniu z HSA, w obecności wolnych rodników i przy ich braku, wykazał, że pomimo połączenia z białkiem kwercetyna nie traci swoich właściwości antyoksydacyjnych, jednak ulegają one zmniejszeniu. Po obliczeniu pól pod wykresem można powiedzieć, że w połączeniu kwercetyny z białkiem, oba związki wykazują obniżone działanie antyoksydacyjne w stosunku do działania jakie wykazują osobno.

• Czas fluoryzacji kwercetyny związanej z HSA w obecności rodników jest krótszy, co świadczy o tym, że pomimo połączenia z HSA wykazuje ona zdolność do blokowania działania rodników. Stwierdzić też można, że połączenie kwercetyny z HSA nie jest wiązaniem kowalencyjnym, czyli jest wiązaniem odwracalnym. Oznacza to, że wykazuje ona zdolność do odłączania się od białka, gdy w pobliżu pojawiają się wolne rodniki.

• Pomiar absorbancji metodą spektrofotometryczną wykazał szkodliwość wolnych rodników generowanych przez AAPH. Pomiar oparty był na barwnej reakcji końcowych produktów oksydacji białek z jodkiem potasu w środowisku kwaśnym jakie tworzył nam kwas octowy - reakcja Witko Sarsat. Na wykresie zaobserwowano wzrost absorbancji przy długości fali 360 nm, co jest ściśle skorelowane z oksydacją białka.

Badania przeprowadzone w pracy metodami spektroskopii optycznej potwierdziły aktywność antyoksydacyjną kwercetyny. Także wykazały pozytywne interakcje pomiędzy HSA i kwercetyną.

• Streszczenie

Zarówno promieniowanie ultrafioletowe, jak i wiele innych czynników środowiska, takich jak wysoka lub niska temperatura, zanieczyszczenia powietrza, dym papierosowy, wywołują uszkodzenia wolnorodnikowe, a przede wszystkim procesy biochemiczne zachodzące w organizmach, zwłaszcza te związane z oddychaniem, prowadzą do powstawania wolnych rodników tlenowych. Wolne rodniki w organizmie są przyczyną uszkodzeń DNA, białek, lipidów i są rozważane jako przyczyna starzenia się organizmu. Reakcjom rodnikowym zapobiegać mogą niektóre związki tzw. zmiatacze wolnych rodników, czyli substancje reagujące z rodnikami i obniżające ich stężenie w danym układzie. Do substancji takich zaliczane są flawonoidy.

Aktywność antyoksydacyjna flawonoidów zależy głównie od rodzaju i ilości podstawników przy pierścieniu B, również od ich umiejscowienia w pozostałej części cząsteczki. Zdolności do wyłapywania wolnych rodników rosną, kiedy do pierścienia B przyłączona jest np. grupa katecholowa C₆H₄(OH)₂ lub pirogallolowa C₆H₃(OH)₃. Największą jednak rolę w usuwaniu wolnych rodników odgrywają grupy hydroksylowe, a ich ilość jest ściśle skorelowana z siłą antyoksydacyjną związku.

Metody spektroskopii optycznych zastosowano w pracy z uwagi na to, że pozwalają one określić bądź przewidzieć szereg biofizycznych właściwości związków o znaczeniu terapeutycznym. Przedstawiona praca wskazuje na szerokie możliwości eksperymentalne jakie dają metody fizyki w badaniach biomedycznych.

Badania przeprowadzone metodą ORAC-FL wykazały zdolności antyoksydacyjne kwercetyny, a także wykazały, że są one wprost proporcjonalne do wzrostu jej stężenia. Pomiar natężenia fluorescencji kwercetyny z HSA wykazał zdolność do łączenia się tych dwóch cząsteczek. Pomiar natężenia fluorescencji kwercetyny w połączeniu z HSA wykazał, że kwercetyna pomimo połączenia z białkiem wykazuje aktywność atyoksydacyjną, ale jest ona mniejsza w stosunku do aktywności jaką wykazuje kwercetyna występująca w roztworze bez białka. Działa to na takiej samej zasadzie w stosunku do białka tzn. białko w roztworze bez kwercetyny posiada wyższą aktywność antyoksydacyjną. Reakcja prowadzona metodą opracowaną przez Witko-Sarsat wykazała szkodliwy wpływ wolnych rodników na HSA.

Przeprowadzone badania potwierdziły właściwości antyoksydacyjne kwercetyny. Wykazały również pozytywne interakcje pomiędzy kwercetyną i HSA. Potwierdziły również destrukcyjny wpływ anionorodnika ponadtlenkowego na białko surowicy ludzkiej - albuminę.

• Bibliografia

1. Bartosz G., Druga twarz tlenu. Wyd. Naukowe, PWN, Warszawa 2003.

2. Puzanowska-Tarasiewicz H., Starczewska B., Kuźmicka L., Reaktywne formy tlenu, Bromat. Chem. Toksykol. - XLI, 2008, 4, str. 1007-1015.

3. Zabłocka A., Janusz M., Dwa oblicza wolnych rodników, Postepy Hig Med Dosw. (online), 2008; 62: 118-124

4. Drőge W., Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev., 2002; 82: 47-95

5. Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., Telser J., Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2007; 39: 44-84

6. Bonizzi G., Piette J., Merville M.P., Bours V., Cell type-specifi c role for reactive oxygen species in nuclear factor kB activation by IL-1. Biochem. Pharmacol., 2000; 59: 7-11

7. Los M., Schenk H., Hexel K., Baeuerle P.A., Drőge W., Schulze-Osthoff K., IL-2 gene expression and NF-kB activation through CD28 requires reactive oxygen production by 5-lipoxygenase. EMBO J., 1995;14: 3731-3740

8. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C., Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood, 1998; 92: 3007-3017

9. Los M., Drőge W., Stricker K., Baeuerle P.A., Schulze-Osthoff K., Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur. J. Immunol., 1995; 25: 159-165

10. Weinert B.T., Timiras P.S., Theories of ageing. J. Appl. Physiol., 2003; 95: 1706-1716

11. Ponczek M.B., Wachowicz B., Oddziaływanie reaktywnych form tlenu i azotu z białkami. Post. Biochem., 2005; 51: 140-145

12. Schuessel K., Frey C., Jourdan C., Keil U., Weber C.C., Müller-Spahn F., Müller W.E., Eckert A., Aging sensitizes towards ROS formation and lipid peroxidation in PS1M146L transgenic mice. Free Radic. Biol. Med., 2006; 40: 850-862

13. Sohal R.S., Role of oxidative stress and protein oxidation in the aging process. Free Radic. Biol. Med., 2002; 33: 37-44

14. Lushchak V.I., Free radical oxidation of proteins and its relationship with functional state of organisms. Biochemistry (Mosc.), 2007; 72: 809-827

15. Hensley K., Robinson K.A., Gabbita S., Salsman S., Floyd R.A., Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury. Free Radic. Biol. Med., 2000; 28: 1456-1462

16. Alvarez B., Radi R., Peroxynitrite reactivity with amino acids and proteins. Amino Acids, 2003; 25: 295-311

17. Higuchi Y., Chromosomal DNA fragmentation in apoptosis and necrosis induced by oxidative stress. Biochem. Pharmacol., 2003; 66: 1527-1535

18. Cooke M.S., Evans M.D., Dizdaroglu M., Lunec J., Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation and disease. FASEB J., 2003; 17: 1195-1214

19. Stołowska M., Kłobus G., Charakterystyka flawonoidów i ich rola w kosmetyce i terapii. Postępy kosmetologii, 2010; 1(1): 8-12

20. Miller E., Malinowska K., Gałęcka E., Mrowicka M., Kędziora J., Rola flawonoidów jako przeciwutleniaczy w organizmie człowieka, Pol. Merk. Lek., 2008, XXIV, 144: 556 - 560

21. Ostrowska J., Skrzydlewska E., Aktywność biologiczna flawonoidów., Postępy Fitoterapii 2005; 16(3-4): 71-79

22. Małolepszy U., Urbanek H., Flawonoidy roślinne jako związki biochemicznie czynne, Wiadomości botaniczne 2000; 44(3/4): 27-37

23. Lek. med. Miktus Małgorzata, Barwy natury - roślinni sprzymierzeńcy witaminy C, Nutrition & Heath 2010; 2(51): 1-12

24. Majewska M, Czeczot H., Flawonoidy w profilaktyce i terapii, Farm Pol, 2009, 65(5): 369-377

25. Cao G., Sofic E., Perior R.L., Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: Structutre -activity relationships. Free Radic. Biol. Med. 1997, 22: 749-760.

26. Wolski T., Kalisz O., Gerkowicz M., Morawski M., Rola i znaczenie antyoksydantów w medycynie ze szczególnym uwzględnieniem chorób oczu, Postępy Fitoterapii 2007, 2: 82-90

27. Czeczot H., Biological activities of flavonoids - a review. Pol. J. Ford Nutr. Sci. 2000, 50(4): 3-13.

28. Olszewska M., Flawonoidy i ich zastosowanie w lecznictwie. Farm. Pol. 2003, 59(9): 391-401.

29. Middleton J.E., Kandaswami C., Theoharides T.C., The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, hart disease, and cancer. Pharmacol. Rev. 2000, 52(4): 673-751.

30. Moon Y.J., Wang X., Morris M.E., Dietary flavonoids: effects on xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicol. In Vitro. 2006, 20(2): 187-210.

31. Fuhrman B., Aviram M., Flavonoids protect LDL from oxidation and attenuate atherosclerosis. Curr. Opin. Lipidol. 2001, 12,(1): 41-48.

32. Violi F., Pignatelli P., Pulcinelli F.M., Synergism among flavonoids in inhibiting platelet aggregation and H₂O₂ production. Circulation.2002, 105(8): 53-54.

33. Sanderson J., McLauchlan R.W., Williamson G., Quercetin inhibits hydrogen peroxide-induced oxidation of the rat lens. Free Radic. Biol.Med. 1999, 26(5/6): 639-645.

34. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/q0125?lang=pl&region=PL

35. Polifenole roślinne w terapii schorzeń układu krążenia, Panacea2004, 3(8): 22-26

36. Pałgan K., Sinkiewicz W.: Ochronna rola flawonoidów w chorobach układu sercowo-naczyniowego. Czynniki ryzyka, 1998.

37. Majewska-Wierzbicka M., Czeczot H., Flawonoidy w prewencji i leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego, Pol. Merk. Lek., 2012, XXXII(187): 50-53

38. Matreska Małgorzata, Quercetin and its derivatives: chemical structure and bioactivity - a review, Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, 58(4): 407-413

39. Kwiatkowska Edyta, Składniki herbat w zapobieganiu chorób układu krążenia, Postępy Fitoterapii 2007, 2: 91-94

40. Ketan V. Hirpara, Pawan Aggarwal, Amrita J. Mukherjee, Narendra Joshi, Anand C. Burman, Quercetin and Its Derivatives: Synthesis, Pharmacological Uses with Special Emphasis on Anti-Tumor Properties and Prodrug with Enhanced Bio-Availability, Anticancer Agents Med Chem. 2009, 9 (2): 138-161

41. Vargas A.J., Burd R.: Hormesis and synergy: pathways and mechanisms of quercetin in cancer prevention and management. Nutrition Reviews. 2010, 68(7): 418-428.

42. Hadi S.M. i wsp.: Oxidative breakage of cellular DNA by plant polyphenols: A putative mechanism for anticancer properties. Seminars in Cancer Biology. 2007, 17: 370-376.

43. Olaf J. Rolinski, Andrew Martin, and David J. S. Birch, Human serum albumin and quercetin interactions monitored by time-resolved fluorescence: evidence for enhanced discrete rotamer conformations, J. Biomed. Opt.2007, 12(3): 1-7

44. Bhattacharya, A. A.; Curry, S.; Franks, N. P. Binding of the General Anesthetics Propofol and Halothane to Human Serum Albumin. The Journal of Biological Chemistry 2000, 275(49): 38731-38738

45. Yang, Feng, et al. Effect of human serum albumin on drug metabolism: Structural evidence of esterase activity of human serum albumin. Journal of Structural Biology 2006, 157: 348-355

46. Jóźwiak Z., Bartosz G., Biofizyka. Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami, PWN Warszawa 2005.

47. Kęcki Zbigniew, Podstawy spektroskopii molekularnej, PWN Warszawa 1992

48. Lakowicz J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, 2006.

49. Haken W., Wolf H.Ch., Fizyka molekularna z elementami chemii kwantowej, PWN Warszawa 1998.

50. R. Kocjan, Chemia analityczna. Podręcznik dla studentów. Analiza instrumentalna. Tom 2, PZWL, Warszawa

51. Badanie przejść fazowych w błonach biologicznych metodą pomiaru anizotropii fluorescencji, http://www.zbf.wbbib.uj.edu.pl/documents/3312903/e4024f4e-dddb-4a34-ada0-95de2d7521fc

52. Kohri S, Fujii H, Oowada S, Endoh N, Sueishi Y, Kusakabe M, Shimmei M, Kotake Y. An oxygen radical absorbance capacity-like assay that directly quantifies the antioxidant's scavenging capacity against AAPH-derived free radicals. Anal. Biochem. 2009, 386(2): 167-171.

53. Badanie pojemności antyoksydacyjnej produktu GanoCafe Classic metodą fluorymetryczną, test ORAC-FL.,Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie, Zakład chemii fizycznej, Wydział farmaceutyczny

54. http://www.caymanchem.com/app/template/Product.vm/catalog/82235

55. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/46955?lang=pl&region=PL

56. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/enzyme-reagents/human-albumin.html

57. Piwowar A., Zaawansowane produkty utleniania białek. Część I. Mechanizm powstawania, struktura i właściwości., Pol. Merk. Lek., 2010, XXVIII, 164: 166-169

58. Bhattacharya, A. A.; Curry, S.; Franks, N. P. Binding of the General Anesthetics Propofol and Halothane to Human Serum Albumin. The Journal of Biological Chemistry 2000, 275(49): 38731-38738

59. Stadtman ER, Levine RL (2003) Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins. Amino Acids 25: 207-218

60. Grune T, Merker K, Sandig G, Davies KJ (2003) Selective degradationof oxidatively modified protein substrates by the proteasome. Biochem Biophys Res Commun 305: 709-718

61. Ryazanov AG, Nefsky BS (2002) Protein turnover plays a key role in aging. Mech Ageing Dev 123: 207-213

62. Berlett BS, Stadtman ER (1997) Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem 272: 20313-20316

63. http://www.chem.univ.gda.pl/kchfiz/assets/Uploads/kchfiz/files/luminofory_organiczne/cwiczenie%209.pdf

64. Vincent, J. L. Revelance of albumin in modern critical care medicine. Baillière's best practice & research. Clinical anaesthesiology 2009, 23(2):183- 191

65. Nicholson, J P, M R Wolmarans and G R Park. The role of albumin in critical illness. British Journal of Anaesthesia 2000, 85: 599-610.

66. Iwao Y., Anraku M., Hiraike M. i wsp.: The structural and pharmacokinetic properties of oxidized human serum albumin, advanced oxidation protein products (AOPP). Drug Metab. Pharmacokinet., 2006, 21: 140-146.

4

---