WYKŁAD 10
Przypomnienie z wykładu poprzedniego:
W stadium blastuli komórki endodermy oddziałują na leżące nad nimi komórki rejonu równikowego i indukują je w kierunku powstawania mezodermy. To działanie powoduje zróżnicowanie mezodermy wzdłuż przyszłej osi grzbieto - brzusznej zarodka. Mamy do czynienia z czynnikami wywodzącymi się z endodermy. W przyszłym rejonie grzbietowym zarodka aktywna jest β-katenina. Powstaje centrum Neuwkoopa, które jest rejonem oddziałującym indukcyjnie na mezodermę - wytwarza w jej rejonie organizator, będzie to górna warga pragęby, która organizuje cały zarodek. W ten sposób powstaje zróżnicownie grzbieto - brzuszne.
W rejonie prospektywnej ektodermy zaindukowana zostaje neuroektoderma. Z jednej strony mamy dorsalizujące działanie organizatora, a z drugiej strony działanie rejonu przeciwnego do miejsca organizatora, tzw. centrum wentralizującego(wydziela białko BMP4 z rodziny TGF-β itp). Centrum dorsalizujące hamuje to działanie (wydziela min. chordynę, noggin, folistatynę). Jest to wydzielane przez chordomezodermę.
Przedni rejon, wywodzący się z organizatora, ten który będzie tworzył mezenchymę głowy i endodermę przełyku, oprócz tego, że będzie produkował białka hamujące BMP, to jeszcze czynniki hamujące szlak przekaźnictwa zależnego od Wnt - to jest sygnał, że tu utworzy się rejon głowowy.
Szlak przekaźnictwa Wnt hamuje białko Frezzled - uniemożliwia ono białku Wnt związanie się ze swoim receptorem - dzięki temu różnicują się struktury głowowe.
Indukcja jest również zróżnicowana wzdłuż przyszłej osi przodo-tylnej zarodka. Przejawia się to różnicowaniem się różnych struktur mózgowia z neuroektodermy. Najbardziej tylne rejony wnikające przez wargę pragęby różnicują się np. w somity części ogonowej zarodka.
Lata 30 - klasyczne doświadczenie dotyczące przestrzennego zróżnicowania indukcji:
Z jednego zarodka już w stadium neuruli pobierano różne odcinki. A to bardziej z przodu leżące, a to z tylnej części dachu prajelita - czyli te tkanki, które się wywodzą z rejonu organizatora. Przeszczepiano to do młodej gastruli.
Rejon przedni indukował rejony głowowe. Dalszy fragment tułów, a części najbardziej tylne indukowały tkanki ogonowe.
Zróżnicowanie przodo-tylne zarodka może być związane ze zróżnicowaną zawartością β-kateniny. Wydaje się, że szlak przekaźnictwa β-kateniny (szlak przekaźnictwa Wnt) jest ważnym elementem instruującym zarodek jeśli chodzi o jego oś przodo - tylną.
Współczesny model zróżnicowania grzbieto-brzusznego i przodo-tylnego zarodka płaza:
grzbieto-brzuszne - gradient stężenia BMP wzdłuż osi brzuszno - grzbietowej. Po stronie brzusznej duże. Po grzbietowej znoszone przez antagonistów BMP.
przodo -tylne - gradient stężenia Wnt. Z tyłu duże i coraz niższe w kierunku przednim. Mówimy tutaj o posterioryzacji i anterioryzacji.
Inne czynniki posterioryzujące:
czynnik wzrostu fibroblastów
kwas retinojowy
Oba też wydzielane przez tkanki organizatora.
Pozytywne czynniki, jeśli chodzi o wytworzenie strony przedniej zarodka:
insulinopodobny czynnik wzrostowy - wydzielany przez tkanki, które indukują różnicowanie w kierunku głowy.
Zróżnicowanie osi przodo - tylnej centralnego układu nerwowego, a także somitów będzie też związane ze zróżnicowaną ekspresją genów z grupy Hox.
Rozwój zarodków płazów i w ogóle rozwój tego typu ma cechy regulacyjne - czyli blastomer, zanim zostanie zdeterminowany może różnicować się w cokolwiek.
Rozwój regulacyjny:
Kiedyś dominowało przeświadczenie, że rozwój przebiega w sposób mozaikowy. Wydawało się, że informacja genetyczna jest tracona w miarę rozwoju zarodka. Nie wiedzieli jeszcze wtedy, że determinanty są cytoplazmatyczne, a nie jądrowe, że wszystko zależy od tego który rejon cytoplazmy jądro odziedziczy. Dominowało przekonanie, że komórki na siebie nie oddziałują.
Techniki klasycznej embriologii eksperymentalnej:
uszkodzenie części zarodka i obserwacja rozwoju pozostałej części
izolowanie zarodka i obserwacja co się z nim dzieje
rekombinacja części zarodka
transplantacja fragmentów zarodka od innego
Zaczęto to stosować w XIX wieku, aby potwierdzić hipotezę, że wszystkie organizmy rozwijają się jak żachwy - w modelu mozaikowym.
Doświadczenie, które potwierdziło (o dziwo) te przypuszczenia:
Zabito przy pomocy gorącej igły jeden z dwóch blastomerów żaby i drugi rozwijał się w „półzarodek”, który nawet przechodził połowiczną gastrulację, tworzyła się płyta nerwowa...
Potwierdziło to teorię Weismana (uogólniono ją trochę, że segregacja determinant zachodzi w ten sam sposób od początku)- zarodki już na stadium dwóch blastomerów dziedziczą różne determinanty.
Krył się jednak tam błąd metodyczny - bo zabicie blastomeru i pozostawienie tej martwej tkanki sygnalizowało temu drugiemu, że coś tam jednak jest i dlatego tworzyła się połówka zarodka.
Kłopot z obrazem „wszechmozaikowego rozwoju” pojawił się gdy zaczęto pracę na jeżowcach.
Zachodzą u nich dwa podziały w płaszczyźnie południkowej i trzeci w równikowej. Dopiero czwarty podział jest nierównomierny - odcina mezomery, makromery i mikromery.
Hans Dish izolował pojedyncze blastomery z zarodków 4-komórkowych. Okazało się, że każdy z tych blastomerów może rozwinąć się w pluteusa. Wstrząsający ówcześnie wynik.
Przeprowadził nowe doświadczenie - spłaszczył zarodki między szkiełkami - zmieniło to płaszczyznę podziału. Przez to trzecia bruzda przebiegała też południkowo i ten zarodek też rozwinął się normalnie.
To trochę zaburzyło wiarę Disha w biologię i został filozofem.
Inny badacz izolował zarodki ośmiokomórkowe wzdłuż płaszczyzny południkowej - wtedy rozwinęły się dwa normalne pluteusy - i wzdłuż płaszczyzny równikowej - wtedy powstał pluteus z części wegetatywnej, a z animalnej permanentna blastula. Zaczęto podejrzewać jakieś oddziaływania indukcyjne.
W stadium 60 komórkowym mamy u jeżowców zarodek już właściwie zdeterminowany. Półkula animalna będzie tworzyła ektodermę. Potem dwa piętra makromerów, które dadzą komórki endodermalne i mezodermalne (wtórną i pierwotną). Ale okazuje się, że los niektórych rejonów można jeszcze zmienić.
Gdy z jednego zarodka w stadium 16 komórkowym odczepimy mikromery i przeszczepimy je na biegun animalny innego zarodka to rozpoczyna się tam druga gastrulacja - a są tam przecież mezomery. Czyli można podejrzewać, że takim centrum, które organizuje zarodek są właśnie mikromery.
Inne doświadczenie:
Z jeżowca w stadium 60 komórek odcina się komórki animalne i hoduje same to one się nie różnicują, a jeśli przyczepia się do nich mikromery to powstanie coś, co przypomina pluteusa - z tkankami z wszystkich listków zarodkowych. Te komórki ektodermalne zaczynają się różnicować nawet w jelito.
Dlaczego mikromery?
W rejonie wegetatywnym zarodka w stadium blastuli jest w jądrach aktywna β-katenina. Gromadzi się przede wszystkim w mikromerach. W tych, które stworzą struktury szkieletowe i tych, które stworzą woreczki celomatyczne. Gromadzi się też w pierwszym okółku komórek wywodzących się z makromerów.
Jeżeli sprawimy, że β-katenina obecna będzie we wszystkich jądrach to zarodek różnicuje się wyłącznie w struktury endodermalne i mezodermalne.
Czyli β-katenina działa jak czynnik transkrypcyjny. Gdy zaburzy się wnikanie β-kateniny do jądra to powstaną wyłącznie struktury ektodermalne.
Aktywna β-katenina obecna w jądrach oddziałuje (przy współudziale czynnika transkrypcyjnego otx) z rejonem promotorowym genu Primar 1 i aktywuje go.
Gen ten koduje białko Primar 1 i jest represorem represora... czyli w komókrach bez aktywnej β-kateniny aktywne jest białko represorowe, które hamuje cały szereg białek, które powodują różnicowanie się w kierunku mezenchymy pierwotnej i zapobiegają wydzielaniu sygnałów, które powodują, że mikromery sygnalizują komórkom kontaktującym się z nimi, że mają się różnicować w określonym kierunku. Więc białko Primer 1 blokuje represora i aktywowane są czynniki transkrypcyjne i geny, które powodują różnicowanie się mezenchymy, aktywne mogą być też geny, które przesyłają sygnał do komórek leżących w tym okółku na mikromerach(komórek Veg 2) aby różnicowały się w kierunku endodermy i mezodermy wtórnej.
Aktywowany jest szlak przekaźnictwa Delta noch (?) - komórki które mają receptor tego sygnału wyróżnicują się w kierunku endodermy i mezodermy. Kaskada reakcji pobudza następny okółek (Veg 1). Jeżowiec ma oś animalno-wegetatywną - powstaje ona na skutek kaskady reakcji. Los komórek jest zdeterminowany dopiero, gdy eksprymowane są w nich geny dotyczące tkanki, która ma z nich powstać.
Organizmy rozwijające się w ten sposób mają duże zdolności regulacyjne.
Olbrzymie zdolności regulacyjne mają ssaki - oddziaływania u nich badane przez prof. Andrzeja Tarkowskiego.
Zniszczenie 1 blastomeru myszy nie przeszkadza drugiemu przekształcić się w blasctocystę, a ta bez problemu daje się wszczepić do macicy. Powstaje normalna, płodna i zdrowa mysz.
U myszy blastomery izolowane powyżej 4 nie dały dobrych rezultatów (chyba, że im się doda cytoplazmy i będą cięższe, to się rozwiną normalnie) ale np. owce, gdy rozdzielimy je w stadium 4 - blastomerowym to powstaną czworaczki monozygotyczne - jest to tzw. Klonowanie zarodka.
U owcy czy królika czasem nawet blastomery ze stadium 8 - komórkowego dają normalny organizm. U myszy 1/8 to powstanie blastocysta.
U ssaków nie tylko blastomery, ale też blastocysta wykazuje duże zdolności regulacyjne.
U owcy, czy krowy, jeżeli przetniemy blastocystę w ten sposób, że każda z połówek odziedziczy fragment węzła zarodkowego, to taki zarodek może się zróżnicować w parę bliźniąt.
Zdolności regulacyjne człowieka:
1 na 400 urodzeń to bliźnięta monozygotyczne- do końca nie wiemy jak powstają, ale na podstawie układu błon płodowych możemy stwierdzić kiedy nastąpiło rozdzielenie zarodka na dwa.
Do piątego dnia ciąży wytwarza się trofektoderma, co jest związane z powstaniem kosmówki. Jeżeli oba płody rozwijają się w osobnych owodniach i każdy ma swoją kosmówkę, to rozdzielenie ,musiało powstać na bardzo wczesnym etapie (np. dwóch blastomerów) - musiały powstać dwie blastocysty. Jest to około 1/3 bliźniąt monozygotycznych.
Zarodki mają wspólną kosmówkę, a osobne owodnie - rozdzielenie powstało między piątym a dziewiątym dniem rozwoju. Owodnia wykształca się dziewiątego dnia. Jest to około 2/3 bliźniąt monozygotycznych.
Zarodki mają wspólną kosmówkę i owodnię. Jest to bardzo rzadki przypadek i pojawia się niebezpieczeństwo, że urodzą się zroślaki.
Proces powstawania bliźniąt monozygotycznych można nazwać naturalnym klonowaniem zarodka człowieka.
Najliczniejsza grupa wieloraczków monozygotycznych znanych nauce to kanadyjskie pięcioraczki (dziewczynki)- urodzone w latach 30.
1 na 200 tyś żywych urodzeń to zroślaki. Najsławniejszym przykładem byli bracia Czang i Eng urodzeni w Tajlandii. Byli zrośnięci klatką piersiową, mieli wspólną wątrobę. Wyemigrowali do stanów, występowali w cyrku i dorobili się majątku. Ożenili się z dwiema siostrami i mieli wspólnie 21 dzieci. Zmarli jednocześnie.
Skrajnym przykładem zroślaków jest fetus-in-fetu. Jedno z bliźniąt ulega zahamowaniu w rozwoju i ten niedorozwinięty płód znajdzie się w ciele drugiego bliźniaka. Czyli możemy u siebie wykryć guza, który okazuje się braciszkiem
Poliembrionia - z jednego zarodka rozwija się kilka płodów. Charakterystyczne dla pancerników (nie wszystkich) - z jednego zarodka 4 płody u jakiegośtam gatunku. Tarczka zarodkowa rozpada się zawsze na cztery części.
Zdolności regulacyjne ssaków wyrażają się też w tym, że można uzyskiwać zarodki chimerowe. Doświadczenie:
Zlepiamy ze sobą 2 ośmioblastomerowe zarodki myszy różniące się kolorem sierści. Powstaje wspólna blastocysta, którą przeszczepiamy do samicy w ciąży rzekomej. Rodzą się zwierzęta chimerowe, złożone z tych dwóch zarodków, co widać po kolorze sierści. Zwierzę ma wtedy 4 biologicznych rodziców.
Można tak też zrobić z 3 zarodkami, a wtedy zwierzę ma 6 biologicznych rodziców.
Takie chimery mogą również powstać, gdy zfuzjują nieidentyczne bliźniaki ludzkie
Dlaczego jest to możliwe akurat u ssaków? Najpilniejszą potrzebą zarodka ssaków jest wejście w kontakt z łożyskiem, aby pobierać substancje odżywcze. Pierwszy okres rozwoju ssaka to wytworzenie trofektodermy i węzła zarodkowego. Dopiero potem, dość późno różnicuje się ten węzeł zarodkowy, dość długo jest on zupełnie niezróżnicowany. Blastocysta myszy: trofektoderma i węzeł zarodkowy. Całe ciało zarodka i większa część błon płodowych wytworzy się z węzła zarodkowego, jego komórki dość długo zachowują totipotencję. Nazywamy je wtedy komórkami macierzystymi, można je hodować i proliferować.
Można wykorzystać właściwości tych komórek macierzystych np. aby wyhodować myszy transgeniczne (takie, które mają wprowadzone obce geny do genomu). Komórki macierzyste wstrzykuje się do blastocysty i komórki te chętnie zasiedlą węzeł zarodkowy, zwierzę rozwinie się w organizm chimerowy.
Jeżeli akurat z tych komórek powstaną pierwotne komórki płciowe to potomstwo będzie wywodzić się z komórek macierzystych, czyli tych wprowadzonych do blastocysty.
Jak wprowadzimy jedną komórkę macierzystą do tetraploidalnej blastocysty (która powinna być zniszczona w dalszym rozwoju) to powstanie zarodek, u którego 100% tkanek wywodzić się będzie z tej komórki macierzystej.
To wszystko są dowody na to, że wczesne stadia zarodków ssaków są bardzo plastyczne.
Uzyskiwanie nokautów genowych:
Wybieramy jakiś gen, który chcemy znokautować - unieczynnić. Hodujemy komórki macierzyste in vitro i przez odpowiednie dobranie konstruktu genetycznego, w którym transformujemy te komórki, jesteśmy później w stanie wyselekcjonować te bardzo rzadkie komórki, gdzie zaszła rekombinacja genetyczna..
Wstrzykujemy te komórki do blastocysty i powstają chimery. Te chimery możemy krzyżować i doprowadzić do powstania homozygot lub heterozygot pod względem tego konkretnego genu. Pozwalamy im się rozwijać i obserwujemy, czy rozwój jest prawidłowy.
Można np. uzyskać homozygoty i heterozygoty z uszkodzonym genem BMP7 i obserwować jak się rozwijają. Czy przeżyją itp. Myszy pozbawione tego genu rozwiną się w zwierzęta z nieprawidłowo funkcjonującymi nerkami
Jest to obecnie najważniejsza technika badania funkcji genów.
Komórki macierzyste mają też olbrzymi potencjał w projektach stosowania terapii genowej.
Jesteśmy w stanie uzyskać komórki macierzyste i utrzymać w postaci niezróżnicowanej w hodowli (nie u wszystkich gatunków, np. u szczura nie udało się ich uzyskać. U myszy i człowieka potrafimy je otrzymać)
Znamy sposoby, aby ukierunkować różnicowanie tych komórek w hodowli. Np. u myszy można dzięki nim odbudować uszkodzony mięsień sercowy - do krwi wstrzykujemy macierzyste komórki miokardiocytów i one odbudowują uszkodzenie
Kilka lat temu próbowano leczyć tym sposobem dzieci z chorobami układu krwiotwórczego, ale spowodowało to rozwijanie się nowotworów.
Komórki takie można różnicować w określonym kierunku. Wprowadzenie kwasu retinojowego do hodowli spowodowało wykształcenie się z nich prawidłowych neuronów, a wprowadzenie czynnika płytkowego powoduje powstawanie komórek gleju itp.
Klonowanie reprodukcyjne:
Owca Dolly.
Hodowano in vitro komórki z gruczołu mlecznego jednej owcy. Z drugiej pobrano oocyt, z którego mikrochirurgicznie usunięto materiał genetyczny i zfuzjowano z komórką somatyczną z hodowli. Część tych zarodków po sztucznej aktywacji jest w stanie rozwinąć się do stadium blastocysty, którą transplantowano do dróg rodnych samicy. Urodziło się zwierze powstałe z komórek somatycznych gruczołu mlecznego.
Proces ten jest bardzo niewydajny. Większość tych zarodków nie rozwija się normalnie, ma całą masę zaburzeń w okresie przed i pourodzeniowym.
Klonowanie terapeutyczne:
W stadium blastocysty - z zarodka uzyskanego przez rekonstrukcję oocytu, po usunięciu jego genomu i zfuzjowaniu z komórką somatyczną - uzyskuje się linię komórek macierzystych. Jeżeli uzyskamy tą linię z komórek somatycznych pacjenta, któremu coś chcemy przeszczepić to uzyskujemy komórki macierzyste identyczne z komórkami somatycznymi z ciała pacjenta. Powinien to być teoretycznie idealny materiał do przeszczepu.
Profesor Chwang z Chin miał uzyskać dwa lata temu komórki macierzyste zarodków ludzkich, ale jakieś dwa tygodnie temu wyszło na jaw, że to był wielki szwindel i profesor Chwang stanął przed sądem.