Wykład 12 09.01.2012

Diagnostyka cytochemiczna i immunologiczna chorób układu krwiotwórczego

Określenie aktywności fosfatazy alkalicznej granulocytów FAG

• Fosfatazy są enzymami należącymi do esteraz

• W neurocytach znajduje się fosfomonoesteraza odszczepiająca jedno wiązanie estrowe, a optimum jej działania występuje w środowisku zasadowym (FAG lub FAN)

• Pojawia się ona w neurocytach na etapie metamielocyta

• Aktywność tego enzymu oznaczamy tylko w postaciach dojrzałych (segmenty, pałeczki).

• Aktywność FAG jest całkowicie niezależna od zmian w aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy

Wykrywanie FAG

Zasada metody polega na wytrącaniu barwnego nierozpuszczalnego związku powstającego w następstwie sprzęgania naftolu z solą diazową. Osad wytrąca się w cytoplazmie neutrofilów. Im większa aktywność FAG tym bogatszy jest osad związku.

Ocena aktywności FAG (półilościowo)

• Preparat oglądany w powiększeniu pod imersją

• Aktywność FAG ocenia się wyłącznie w neurocytach z jądrem segmentowanym lub pałeczkowatym

• 100 kolejnych granulocytów zalicza się do 5 klas aktywności FAG

Klasy aktywności FAG

STOPIEŃ 0- cytoplazma bezbarwna. Osad barwnika nie występuje.

STOPIEŃ 1- cytoplazma blado-żółta lub bezbarwna. Ziarnistości pojedyncze, drobne, słabo zabarwione.

STOPIEŃ 2- cytoplazma blado-żółta, bezbarwna, ziarnistości nieliczne lub dość liczne, średniej wielkości, nie tworzą skupisk.

STOPIEŃ 3- cytoplazma żółta, ziarnistości liczne, średnie lub duże, częściowo w skupieniach, silnie zabarwione.

STOPIEŃ 4- cytoplazma niewidoczna. Ziarnistości bardzo liczne, średnie lub duże, prawie wyłącznie w skupieniach, zakrywają całą lub prawie całą cytoplazmę.

Obliczanie wskaźnika aktywności (metoda półilościowa)

0 40% 0x40=0

1 30% 1x30=30

2 15% 2x15=30

3 13% 3x13=39

4 2% 4x2=8

R AZEM: 107 wynik FAG

Prawidłowa aktywność FAG wynosi 20-100. Każda pracownia ustala własne normy.

Wahania fizjologiczne

• U kobiet i dzieci do 5 r.ż. aktywność FAG jest większa niż u mężczyzn;

• U noworodków i kobiet w ciąży aktywność FAG często przekracza 300;

• W podeszłym wieku aktywność FAG oscyluje w dolnych granicach normy.

Spadek aktywności FAG

• W PBSz (w fazie przewlekłej, nieleczona)

• U osób narażonych na działanie benzenu i promieni jonizujących

• W nocnej napadowej hemoglobinurii

• Często w przebiegu zakażeń wirusowych.

Wzrost aktywności FAG

• W nowotworach złośliwych zwłaszcza w okresie z przerzutami

• W zwłóknieniu szpiku, aplazja szpiku, czerwienica prawdziwa, choroba Hodgkina, PBL

• W ostrych i przewlekłych zakażeniach bakteryjnych.

Zastosowanie określania aktywności FAG

1. Różnicowanie PBSz (aktywność FAG zmniejszona) ze zwłóknieniem szpiku (aktywność FAG często zwiększona).

2. Różnicowanie PBSz z odczynem białaczkowym.

3. Różnicowanie czerwienicy prawdziwej (zwiększenie aktywności FAG) z różnymi postaciami nadkrwistości wtórnej (FAG prawidłowy).

Wykrywanie żelaza hemoglobinowego

• Do wykrywania żelaza komórkowego służy reakcja błękitu pruskiego.

• Wykrywa się wówczas żelazo pozahemoglobinowe- hemosyderynę, ferrytynę.

• SIDEROBLASTY- erytroblasty z dodatnią reakcją na żelazo.

• SIDEROCYTY- krwinki czerwone z ziarnami żelaza.

• SIDEROMAKROFAGI- makrofagi dające dodatnią reakcję błękitu pruskiego.

Żelazo pozahemowe ujawnia się w postaci niebiesko-granatowych ziarnistości różnej wielkości.

SIDEROBLASTY

Prawidłowe syderoblasty zawierają pojedyncze, drobne ziarna żelaza, które służą do syntezy hemu. W zaburzeniach gospodarki żelazem dochodzi do zalegania większych ilości żelaza pozahemoglobinowego w erytroblastach. Występują wówczas syderoblasty patologiczne z większą liczbą dużych ziaren.

Syderoblasty pierścieniowe- charakteryzują się występowaniem grubych ziaren żelaza wokół jądra oraz w pozostałych częściach cytoplazmy. Charakterystyczny około jądrowy układ ziaren jest wynikiem obecności żelaza w mitochondriach umiejscowionych w okolicy jądra. Na ogół jest to niepełny pierścień około jądrowy.

Zachowanie się syderoblastów w szpiku kostnym w niedokrwistościach

• W niedokrwistości z niedoboru żelaza- zmniejszenie liczby syderoblastów i sideromakrofagów.

• W niedokrwistościach chorób przewlekłych- liczba syderoblastów zmniejszona, a sideromakrofagów prawidłowa lub zwiększona.

• W niedokrwistościach sideroblastycznych i niektórych MDS- wyraźne zwiększenie liczby syderoblastów (obecność syderoblastów pierścieniowych).

Podtyp RA-MDS- mniej niż 15% syderoblastów pierścieniowych.

Podtyp RA-S-MDS- więcej niż 15% syderoblastów pierścieniowych.

Cytochemiczna diagnostyka ostrych białaczek

• Wykrywanie mieloperoksydazy (odczyn MPO, POX)

Albo

• Wykrywanie lipidów Sudanem czarnym b

Oraz

• Wykrywanie glikogenu (odczyn PAS)

• Wykrywanie niespecyficznej esterazy opornej na fluorek sodu.

Mieloperoksydaza

• POX jest umiejscowiony wyłącznie niektórych komórkach wytworzonych w szpiku kostnym. Stąd nazwa mieloperoksydaza.

• Najczęściej wykrywa się POX za pomocą metody Grahama i Knalla z użyciem benzydyny jako substratu.

• W obecności POX benzydyna utlenia się do benzopireny wypadającej w miejscu działania enzymu.

Wartości prawidłowe POX

POX występuje w komórkach:

• Dojrzałych granulocytach i ezynocytach oraz ich prekursorach z wyjątkiem mieloblastów.

• Większości monocytów- reakcja POX jest jednak słabsza niż w granulocytach (dyfuzyjna).

• Niektórych bazocytach.

POX nie występuje:

• Mieloblastach

• Krwinkach czerwonych i ich prekursorach

• Płytkach krwi i ich prekursorach.

Odchylenia od wartości prawidłowych

Występowanie granulocytów POX ujemnych

• Niektóre przypadki MDS i ostrych białaczek poprzedzonych zespołem MDS.

• Anomalia Aliusa- rzadko występujący wrodzony brak POX w komórkach.

Zastosowanie POX w diagnostyce

Służy głównie do rozpoznania ostrych białaczek szpikowych. W ostrej białaczce szpikowej występuje powyżej 3% blastów POX (+).

Wykrywanie lipidów

Do wykrywania lipidów w komórkach krwi stosuje się najczęściej Sudan czarny b. jest to metoda równoważna do POX.

Interpretacja

Sudan czarny b =reakcja POX.

Wykrywanie obecności glikogenu (odczyn PAS)

Glikogen jest zawarty głównie w:

1. Cytoplazmie komórek szeregu granulocytarnego w ilościach coraz większych w miarę narastania stopnia ich dojrzałości.

2. W płytkach krwi i megakariocytach

3. W limfocytach (małe ilości).

Nie występuje w prawidłowych erytroblastach, natomiast znajduje się w erytroblastach chorych na erytroleukemię (podtyp M6 ostrej białaczki szpikowej).

• Odczyn ten jest przydatny do różnicowania ostrych białaczek.

• W ostrych białaczkach limfo blastycznych limfoblasty wykazują w cytoplazmie obecność gruboziarnistych złogów PAS dodatnich ułożonych w krąg wokół jądra (PAS kroplowy).

• W OBS mieloblasty są PAS ujemne.

P OX + ostra białaczka szpikowa

P AS+ ostra białaczka limfo blastyczna

Niespecyficzna esteraza (oporna na NaF)

Cytochemiczne oznaczanie aktywności esterazy w komórkach krwi i szpiku jest przydatne w różnicowaniu ostrych białaczek monocytarnych z innymi podtypami ostrych białaczek szpikowych.

Istotne jest to, że niespecyficzne esterazy wypadają dodatnio w niemal wszystkich granulocytach i monocytach, ale tylko w monocytach reakcja ulega zahamowaniu po dodaniu do roztworu fluorku sodu.

Diagnostyka immunologiczna ostrych białaczek

Trafność rozpoznań przy użyciu badań morfologicznych i cytochemicznych nie przekracza 80%. Uzupełnieniem są badania immunologiczne za pomocą przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają odpowiednie Ag określane mianem CD w błonie komórkowej lub cytoplazmie. Umożliwiają one zaszeregowanie komórek do odpowiedniej linii (trafność rozpoznania wzrosła do 98%).

Przeciwciała w ostrych białaczkach

Mają na celu określenie czy blasty pochodzą z linii mieloidalnej czy limfoidalnej. Dalsze określenie podtypu rozrostu w obrębie poszczególnych linii. Badanie najlepiej przeprowadzić za pomocą cytometrii przepływowej co najmniej 4-kolorowej z użyciem różnych kombinacji p/c.

Panel wstępny

Obejmuje on:

1. Ag CD34, CD38, HLA-DR- dla niedojrzałych komórek pnia.

2. Ag CD13, CD14, CD117, CD33, VD65- dla linii mieloidalnej

3. Ag CD10, CD19, CD20, CD22- dla linii limfoidalnej B-komórkowej.

4. Ag CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD56 dla linii T-komórkowej i NK.

Ostra białaczka szpikowa

M0- CD34, CD13, CD33 (+/-), cyPOX

M1- CD34, CD13, CD33(+/-), CD117

M2- CD34 (-/+), CD13, CD33, CD117(-)

M3- CD34(-), CD15(+)dla pro mielocytów

M4, M5- CD14

M6- Gf (glikoforyna)- erytroleukemia

M7 – CD42, CD41, CD61.

Ostre białaczki limfo blastyczne B-komórkowe

Wyróżnia się 4 podtypy OBL B-komórkowe

1. Pre-pre OBL (TdT, HLA-DR, CD34, CD19, CD22, CD24)

2. Common OBL (CD19, CD22, CD24, CD10)

3. Pre- B OBL (CD19, CD22, CD24, CD20, cyIgM)

4. B-OBL (CD19, CD20(+/-), CD22, CD24, powierzchniowe IgM

Ostra białaczka limfo blastyczna T-komórkowa

Wyróżnia się dwa główne podtypy OBL T-komórkowe

1. Pre T OBL (TdT, HLA-DR, CD34, CD2, CD5, CD7, cy CD3)

2. OBL z dojrzałych komórek T (TdT, HLA-DR(-), CD34(-), CD2, CD3, CD5, CD7, CD4(+), CD8 (+/-).

Diagnostyka fenotypowa chłoniaków

• Ag CD19 linia B

• Ag CD3 linia T

• Do ustalenia rozpoznania konieczna jest ocena ekspresji innych Ag

• W CLL występuje ko ekspresja Ag CD19+/CD5+

• W białaczce włochato komórkowej należy stwierdzić ekspresję Ag CD11C, CD22, CD25 oraz CD103.

• Dla różnicowania CLL od chłoniaka z małych limfocytów oraz chłoniaka strefy płaszcza określa się dodatnią ekspresję CD23, FMC7.

• Białaczka z dużych ziarnistych limfocytów wykazuje dodatkowo ekspresję Ag CD57 na komórkach CD8+.

7