BARWIENIA I MIKROSKOPY
Opcje barwienia:
preparat natywny - nie barwione bakterie oglądane przyżyciowo
preparat barwiony
barwienie pozytywne
proste - z użyciem jednego barwnika, uwidacznia kształt bakterii
złożone - z użyciem kilku barwników, wykazuje różnice w barwliwości bakterii G(+) i G(-) lub struktury komórki bakteryjnej
barwienie pozytywno - negatywne - wybarwione tło i bakterie, stosowane do wykazywania obecności otoczek
negatywne - wybarwione tło ale nie bakterie, uwidacznianie kształtu bakterii; zwykłe barwniki czarne (nigrozyna) lub czerwone (czerwień Kongo)
barwienia specjalne - histopatologiczne (Giemzy, Wrighta. Wrighta - Giemzy, PAS)
Przygotowanie preparatu
Szkiełko podstawowe odtłuścić nacierając je kawałkiem mydła a następnie należy wytrzeć kawałkiem flanelki. Na szkiełko nałożyć ezą kroplę bulionowej hodowli bakterii lub kroplę soli fizjologicznej i wyżarzoną, ostudzoną, ezą dotknąć kolonii bakteryjnej na podłożu stałym (płytka). Następnie ezą zamieszać w kropli soli fizjologicznej. Ezę wyżarzyć i odstawić, a preparat pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu szkiełko ująć w szczypczyki i przeciągnąć trzykrotnie przez płomień palnika (utrwalenie). Szkiełko pozostawić do ostygnięcia, a następnie barwić.
Barwienie proste metodą Locfflera (błękitem Locfflera)
Utrwalony preparat zalać błękitem Loefflera na 5 - 10 min. Po tym czasie spłukać wodą, osuszyć w bibule i oglądać w mikroskopie świetlnym (obiektyw 100x + olejek imersyjny). W metodzie Locfflera wszystkie bakterie barwią się na kolor niebieski.
Złożona metoda barwienia Grama
Utrwalony preparat zalać fioletem krystalicznym na 3 min, a następnie barwnik spłukać wodą. Zlać wodę ze szkiełka.
Zalać płynem Lugola (bejca) na 1,5 min i ponownie spłukać wodą. Zlać wodę ze szkiełka.
Preparat odbarwić alkoholem przez 30 s i spłukać wodą. Zlać wodę ze szkiełka.
Podbarwić fuksyną zasadową przez 30 s i spłukać wodą. Zlać wodę ze szkiełka i osuszyć preparat w bibule Oglądać przy powiększeniu 1000x (okular 10x, obiektyw 100x w układzie imersyjnym - na gotowy preparat nałożyć kroplę olejku imersyjnego i zanurzyć niej obiektyw).
Metoda Grama dzieli wszystkie eubakterie na G(+) fioletowe i G(-) czerwone. Różnice w barwliwości obu rodzajów bakterii wynikają z różnic w budowie ściany komórkowej - bakterie G(+) mają wiele warstw mureiny (peptydoglikanu), natomiast G(-) zasadniczo tylko jedną. Fiolet krystaliczny penetruje osłonki komórki bakteryjnej. Po dodaniu płynu Lugola następuje zastąpienie atomu chlory atomem jodu w cząsteczce barwnika i powstają wewnątrzkomórkowe duże agregaty fioletu krystalicznego. Etanol rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii G(+) oraz dwie błony (cytoplazmatyczną i zewnętrzną) bakterii G(-) i powoduje częściowe odwodnienie ściany, zmniejszając wymiary poryn w mureinie. Gruba mureiny bakterii G(+) zatrzymuje kompleks barwnika, natomiast przechodzi on przez cieniutką jej warstwę w ścianie bakterii G(-) zostaje wypłukany. Fuksyna zabarwia pozostałość bakterii G(-) n kolor czerwony.
Mikroskopy:
świetlny - do oglądania preparatów barwionych i natywnych przy powiększeniach 400x (preparaty natywne) lub 1000x (preparaty barwne)
z ciemnym polem widzenia - do oglądania przy powiększeniu 400x dużych obiektów, np. bakterii spiralnych, pasożytów - tylko w preparatach natywnych
fluorescencyjny - do oglądania przy powiększeniu 400x preparatów specjalnie barwionych - barwnikami fluoryzującymi (oranż akrydyny, auramina, rodamina, fluoresceina). np. preparaty prątków gruźlicy barwione oranżem akrydyny, które obserwuje się na ścianie prątków lub preparatów immunofluoresccncyjnych. w których przeciwciało swoiste jest sprzężone z barwnikiem fluoryzującym.
Procedura mikroskopowania:
Włączyć źródło światła i odsłonić przesłonę kondensora znajdująca się pod stolikiem
Wprowadzić obiektyw o mniejszym powiększeniu (np. 20x) w oś optyczną mikroskopu
Podnieść tubus poprzez obrót śruby mikrometrycznej tak, aby obiektyw znalazł się 3-5 cm nad stolikiem
Umieścić przygotowany preparat na stoliku mikroskopu i docisnąć zaciskami
Opuścić tubus przez obrót śruby mikrometrycznej tak, aby obiektyw znalazł się tuż nad preparatem - sprawdzamy to patrząc z boku, nie poprzez okular.
Patrząc w okular podnieść powoli tubus za pomocą śruby mikrometrycznej aż do mementu ukazania się obrazu preparatu. Ostrość obrazu poprawić śrubą mikrometryczną
Skorygować oświetlenie obrazu
Jeżeli zachodzi potrzeba obejrzenia obrazu przy większym powiększeniu, należy zmienić obiektyw na silniej powiększający np. 40x, i wyregulować ostrość za pomocą śruby mikrometrycznej.
Po zakończeniu mikroskopowania podnieść obiektyw za pomocą śruby mikrometrycznej na kilka cm nad stolik i zdjąć preparat.
ŚRUBA MIKROMETRYCZNĄ ŚLUZY WYŁĄCZNIE DO REGULOWANIA OSTROŚCI OBRAZU, A NIE DO JEGO POSZUKIWANIA.