1

Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej.
Konspekt do zajęć prowadzonych w ramach przedmiotu Fizjologia stosowana dla studentów II roku Wydziału
Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.
Rok akademicki 2008/2009

.

Ćwiczenie 1

Mechanizmy prowadzące do powstania czopu hemostatycznego

oraz testowanie ich sprawności za pomocą badań diagnostycznych

Wprowadzenie

Hemostaza to zespół mechanizmów fizjologicznych, które zapewniają sprawne hamowanie
krwawienia po przerwaniu ciągłości ściany naczyń krwionośnych, szczelności łożyska
naczyniowego i płynności krążącej krwi.
Głównymi elementami hemostazy są: układ krzepnięcia, układ fibrynolizy, płytki krwi (inne
elementy morfotyczne), ściana naczyń krwionośnych, układ fagocytarny (siateczkowo-
śródbłonkowy).
W celu zrozumienia funkcjonowania hemostazy można wprowadzić „roboczy” podział na układ
prokoagulacyjny i antykoagulacyjny. Układ prokoagulacyjny obejmuje wszystkie mechanizmy
biorące udział w tworzeniu czopu hemostatycznego - jego funkcją jest hamowanie
krwawienia.
Układ antykoagulacyjny obejmuje wszystkie mechanizmy ograniczające tworzenie zakrzepów –
jego funkcją jest, więc zachowanie płynności krwi w łożysku naczyniowym.

Zakrzep to czop hemostatyczny, który rozwinął się w sposób niedostatecznie kontrolowany lub
w niewłaściwym miejscu.

Zator to zakrzep całkowicie blokujący przepływ krwi przez naczynie krwionośne.

Hemostaza pierwotna – pierwsza faza aktywacji układu hemostazy: płytki krwi rozpoznają
uszkodzenie naczynia i tworzą czop płytkowy (pierwotny czop hemostatyczny) uwalniając
substancje wspomagające układ krzepnięcia.

Hemostaza wtórna – uszkodzona ściana naczynia jest źródłem czynnika tkankowego (TF,
Tissue Factor), który uaktywnia układ krzepnięcia. Następuje wzmocnienie czopu płytkowego i
tworzenie czopu hemostatycznego (wtórny/właściwy czop hemostatyczny).

Przerwanie ciągłości naczynia krwionośnego zapoczątkowuje sekwencję zdarzeń –
uruchamiane są kolejne elementy (mechanizmy) układu hemostazy.

Poszczególne warstwy ściany naczyń krwionośnych odgrywają istotna rolę w regulacji układu
hemostazy:

-

śródbłonek – mechaniczna izolacja od warstwy prokoagulacyjnej, uwalnianie do

krwioobiegu czynników regulujących funkcje łożyska naczyniowego i układu
hemostazy (t-PA, u-PA, prostacyklina, EDGF, EDRF, PAI, cz. vW, PAF), pełni rolę
organu endokrynnego ( masa około 2 – 3 kg),warstwa podśródbłonkowa –
aktywacja płytek krwi z udziałem białek włókienkowych (kolagenu) oraz ekspresja TF i
aktywacja układu krzepnięcia, mięśniówka – skurcz naczyń.

2

Diagnostyka laboratoryjna
Aktualnie brak jest powszechnie dostępnego badania testującego sprawność hemostatyczną
ściany naczyń krwionośnych. Badaniem o praktycznie historycznym znaczeniu jest test
opaskowy Rumpela-Leedego, stosowany jest również czas krwawienia, a z badań
specjalistycznych biopsja skóry.
Diagnostyka sprawności śródbłonka obejmuje przede wszystkim czynnościowe i obrazowe
badania hemodynamiczne, wykraczające poza zakres tradycyjnej diagnostyki laboratoryjnej.
Do najważniejszych należą:
1. FMD (Flow Mediated Dilatation) - badanie zdolności rozkurczowej naczyń krwionośnych po
zwolnieniu kontrolowanego ucisku,
2. Pletyzmografia – rejestracja zmian tętna (ciśnienia) w naczyniach; PAT (Peripheral Artery
Tonometry) to uproszczona wersja tej metody wykorzystywana do badań śródbłonka,
3. pomiary IMT (Intima Media Thickness) – pomiary grubości kompleksu błona wewnętrzna-
błona środkowa, wykonywane dla tętnicy szyjnej.
Opisano liczne, biochemiczne markery uszkodzenia sródbłonka. W osoczu oznaczane są
stężenia białek adhezywnych, uwalnianych z powierzchni uszkodzonego śródbłonka (ICAM-1,
VICAM-1, endoteliny, selektyny). W czasie uszkodzenia śródbłonka wzrasta we krwi stężenie
czynnika von Willebranda i kwasu moczowego. Badania opisanych markerów są kosztowne i
mało swoiste, stąd nie znalazły szerszego zastosowania w diagnostyce laboratoryjnej.

Płytki krwi najmniejsze (o średnicy 2-4 µm) upostaciowione, pozbawione jądra, elementy krwi
jako pierwsze wykrywają uszkodzenie naczynia. Najczęściej podawana Liczba płytek krwi u
ludzi zdrowych (zakresy referencyjne powinie być wyznaczane w każdym laboratorium) wynosi
150-400 x 10

9

/L. W warunkach fizjologicznych płytki krwi przeżywają w krwioobiegu 8-12 dni.

Aktywacja płytek krwi obejmuje szereg następujących po sobie procesów (zmiana kształtu,
adhezja, degranulacja, agregacja) wywołanych przez kontakt z powierzchnią uszkodzonego
naczynia lub działaniem agonistów (ADP, trombina).

Rola płytek krwi w tworzeniu czopu hemostatycznego: adhezja i agregacja – tworzenie

pierwotnego czopu hemostatycznego, przyśpieszanie tworzenia ostatecznego czopu
hemostatycznego (wpływ na funkcję wszystkich elementów układu hemostazy).

Czop płytkowy jest zbyt słaby aby zahamować wypływ krwi z uszkodzonych naczyń. Dzięki
procesom biochemicznym „kaskady krzepnięcia” następuje wzmocnienie czopu płytkowego i
tworzenie stabilnego czopu hemostatycznego.

Diagnostyka laboratoryjna
Oznaczenie czasu krwawienia jest najprostszą metodą badania sprawności hemostatycznej
płytek krwi. Metoda ta jest mało czuła i specyficzna, szczególnie w wersji znanej jako metoda
Duke’a.
Wersja klinicznie użyteczna to metoda Ivy’ego. W obecnej chwili nie ma wskazań do
rutynowego zlecania wykonania czasu krwawienia. Badanie to wypierane jest przez
instrumentalne metody badania płytek krwi (np. PFA-100).
W przypadku podejrzenia występowania skazy krwotocznej istnieją wskazania do wykonania
czasu krwawienia. W przypadku wydłużonego czasu krwawienia konieczne jest zbadanie
funkcji płytek krwi.

Metody pomiaru agregacji płytek krwi:

1. agregacja turbidymetryczna
2. agregacja we krwi pełnej: metoda impedancyjna, określanie ubytku płytek po

aktywacji

3. pomiar czasu okluzji – PFA-100 (adhezja/agregacja płytek)

Hemostaza wtórna

3

Końcowym efektem działania układu hemostazy jest przekształcenie przez trombinę
rozpuszczalnego fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę.

Czynniki krzepnięcia występujące w osoczu w postaci nieaktywnej po aktywacji układu
krzepnięcia tworzą trzy zespoły enzymatyczne. Każdy kompleks składa się z kofaktora
zakotwiczonego w dwuwarstwie fosfolipidów błony komórkowej oraz z migrujących, zależnych
do witaminy K, proteaz serynowych. Nieczynne zymogeny, przyłączając się do kompleksów
enzymatycznych, przekształcane są w formy aktywne przemieszczające się między
kompleksami. Występuje nieustanny dopływ nieaktywnych form enzymów z osocza, ich
aktywacja w obrębie kompleksów, oraz przemieszczanie aktywnych form między kompleksami.
Kompleksy wytwarzają aktywne formy enzymów przenoszących między kompleksami sygnał
aktywacji (IXa, Xa, IIa).
W toku ewolucji wykształcone zostały liczne sprzężenia zwrotne oraz alternatywne ścieżki
generacji trombiny. Prosty i klarowny schemat kaskadowy niestety ma już jedynie wartość
historyczną.

Kompleksy te to:

Kompleks związany z czynnikiem tkankowym (rdzeń-TF, VII, VIIa, przejściowo nieaktywne
czynniki IX, X, aktywne Xa, IXa)
Kompleks tenazy (rdzeń VIII, przejściowo nieaktywne X, aktywne IXa, Xa)
Kompleks protrombinazy (rdzeń V przejściowo II, IIa, Xa)

Po uszkodzeniu naczynia krwionośnego eksponowany wówczas TF rozpoznawany jest przez
krążącą formę aktywnego cz. VII, która jest w stanie rozpoznać TF, lecz posiada nieaktywne
centrum serynowe i dopiero po połączeniu z TF nabywa zdolności aktywowania kolejnych
cząsteczek czynnika VII, a po przekroczeniu „progu masy krytycznej” efektywnie aktywuje
czynnik IX i czynnik X.
Czynnik X w obecności czynnika V łączy się w kompleks protrombinazy i ostatecznie
protrombina przekształcana jest w trombinę.
Ten fragment jest języczkiem spustowym aktywacji układu krzepnięcia i zostaje szybko
wyhamowany przez inhibitor tkankowego aktywatora (TFPI, Tissue Factor Pathway Inhibitor).
Jednakże minimalna ilość wygenerowanej trombiny (jak iskra na beczce prochu) wystarcza do
uruchomienia układu wzmożonej generacji trombiny (dawniej zwanym „wewnątrzpochodnym”
szlakiem aktywacji). Powstaje kompleks tenazy (X-azy). Powstanie kompleksu, a następnie
uruchomienie głównego szlaku generacji trombiny odbywa się za pośrednictwem głównie
czynnika VIII, istotną rolę odgrywa także czynnik IX. Co do roli czynnika XI zdania są
podzielone (sądzi się, że jest aktywowany przez trombinę powstałą w kompleksie z TF i
aktywuje czynnik IX). Uaktywnione przez trombinę powstałą w kompleksie TF wymienione
czynniki (czynnik IX prawdopodobnie uruchamiany jest także przez kompleks czynnika
tkankowego) mają wielokrotnie większą wydajność (50 razy) generowania trombiny niż
„wygaszony” szlak TF. Dopiero ta droga generacji aktywnej formy czynnika X pozwala
wytworzyć wystarczającą ilość ognisk aktywacji (kompleksów protrombinazy) do wytworzenia
takiej ilości trombiny, która przekształca fibrynogen we włóknik. Włączają się także systemy
samoograniczające. Prawdopodobnie uruchamiane są one w momencie lokalnego
przekroczenia

pewnego

progu

stężenia

trombiny.

Uruchamiany

zostaje

system

antykoagulacyny. Układ białka C, układ antytrombiny, równolegle do aktywacji krzepnięcia
uruchomiony już został układ fibrynolityczny.

Diagnostyka laboratoryjna

4

Wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego (PT) symuluje aktywację układu krzepnięcia
przez tromboplastynę tkankową powstającą po uszkodzeniu naczynia i częściowej degradacji
tkanki. Układ jest oczywiście sztuczny, lecz ze wszystkich badań najbardziej zbliżony do
rzeczywistości.

W świetle aktualnej wiedzy aktywacja tzw. „szlaku wewnątrzpochodnego” nie ma znaczenia
fizjologicznego, jednakże w warunkach laboratoryjnych możliwe jest zastosowanie tak wysokich
stężeń aktywatorów powierzchniowych, które uruchamiają zespół czynników kontaktu.
W powszechnie wykonywanym badaniu – APTT (czas częściowej tromboplastyny po
aktywacji) wykorzystywane są aktywatory powierzchniowo czynne (kaolin, celit) i fosfolipidy
(rekompensata braku płytek krwi).

Badania podstawowe:
diagnostyka skaz krwotocznych: płytki, czas krwawienia, PT, TT, APTT, fibrynogen
diagnostyka stanów nadkrzepliwości: APCR, białko C, białko S, AT, D-dimer.

Badania molekularne:
ELISA: t-PA, PAI, F1+2, PAP, TAT,

β-TG; chromatografia - homocysteina; cytometria

przepływowa – diagnostyka białaczek, ocena funkcji płytek krwi

Badania genetyczne:
PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy): wykrywanie mutacji Leiden cz. V, mutacji 20210 genu
protrombiny

W jakim celu wykonujemy badania?

Diagnostyka skaz krwotocznych

Skazy krwotoczne – stany, w których występuje niewydolność jednej lub kilku składowych
ustrojowego układu hemostazy. Ogólnie mówiąc skaza krwotoczna to skłonność do krwawień:
długotrwałych, zbyt obfitych, pojawiających się bez istotnej przyczyny. Skazy krwotoczne mogą
być uwarunkowane genetycznie lub mają charakter nabyty.
Uwzględniając trzy podstawowe elementy hemostazy wyodrębnia się skazy naczyniowe,
skazy płytkowe i zaburzenia krzepnięcia krwi. Jest to jednak podział uproszczony, ponieważ
w wielu nabytych skazach krwotocznych występują złożone zaburzenia dotyczące zarówno
osoczowych czynników krzepnięcia jak i drobnych naczyń krwionośnych czy płytek krwi.

Naczyniowe skazy krwotoczne związane są z zaburzeniami budowy i czynności drobnych
naczyń krwionośnych – tętniczek, naczyń włosowatych i małych naczyń żylnych. U podłoża
tego typu zaburzeń są wrodzone wady naczyń lub nabyte uszkodzenie ściany naczyniowej na
tle immunologicznym, w wyniku działania toksyn, leków, w przebiegu zakażeń, zmian
zakrzepowych a także zmiany naczyń związane z procesem starzenia, działania urazów
mechanicznych czy nieznanych dotąd czynników. Skaza objawia się najczęściej wybroczynami
lub krwotocznymi wykwitami na skórze i błonie śluzowej, krwawieniami z dziąseł i łatwym
siniaczeniem. Rzadziej występują krwawienia z nosa, dróg rodnych, dróg moczowych czy
przewodu pokarmowego. W badaniach laboratoryjnych nie stwierdza się odchyleń w zakresie
badań płytek krwi, osoczowych czynników krzepnięcia i fibrynolizy. Zwraca uwagę natomiast
dodatni objaw opaskowy.
Najczęściej występujące skazy naczyniowe (plamice):

Wrodzone:

choroba Rendu-Oslera (wrodzona naczyniakowatość krwotoczna)
zespół Marfana

5

Nabyte:

zespół Schonleina-Henocha
plamice polekowe
plamice w przebiegu zakażeń
plamica w dysproteinemiach
plamica starcza
plamice związane ze wzrostem ciśnienia żylnego

Plamice naczyniowe o nieznanej etiologii

plamica zwykła
plamica psychogenna

Płytkowe skazy krwotoczne są związane z nieprawidłową liczbą płytek (małopłytkowości,
nadpłytkowości) lub/i z zaburzeniami czynności płytek krwi (trombocytopatie).
Do najczęściej występujących płytkowych skaz krwotocznych należą małopłytkowości.
Mechanizm ich powstawania polega na niedostatecznym wytwarzaniu (małopłytkowości
„centralne”) lub nadmiernie szybkim usuwaniu płytek z krążenia (małopłytkowości „obwodowe”),
nieprawidłowym rozdziale płytek w organizmie lub ich rozcieńczeniu. Objawy skazy pojawiają
się zwykle wtedy, gdy liczba płytek jest mniejsza niż 30 x 10

9

/L. W wielu przypadkach nie

obserwuje się jednak korelacji między liczbą płytek, długością czasu krwawienia a nasileniem
skazy. W diagnostyce małopłytkowości „centralnych” duże znaczenie ma badanie aspiracyjne
szpiku, które umożliwia ocenę ilości i morfologii magakariocytów. Z zastosowaniem cytometrii
przepływowej można określić frakcję młodych płytek (płytek retykulocytarnych). Inne badanie
diagnostyczne to oznaczenie stężenia trombopoetyny we krwi. Charakterystyczną cechą skazy
małopłytkowej są krwawienia skórno-śluzówkowe – pojawienie się wybroczyn na skórze
kończyn, tułowia, rzadziej twarzy, oraz błonie śluzowej jamy ustnej. Często występują
krwawienia z nosa, dziąseł i dróg rodnych u kobiet. Do ciężkich powikłań należą krwawienia z
przewodu pokarmowego lub krwawienia śródczaszkowe. Małopłytkowości mogą mieć charakter
wrodzony (dziedziczna małopłytkowość, niedobór trombopoetyny) lub nabyty (małopłytkowość o
podłożu immunologicznym, małopłytkowości polekowe, zakrzepowa plamica małopłytkowa). W
diagnostyce

ważny

problem

stanowi

wykluczenie

tzw.

małopłytkowości

rzekomej

(pseudotrombocytopenia), która jest artefaktem pomiarowym, wynikającym z aglutynacji płytek
we krwi pobranej na EDTA.
W nadpłytkowościach liczba płytek krwi przekracza 500 x 10

9

/L i wiąże się ze zwiększeniem

wytwarzania płytek przy prawidłowym czasie ich przeżycia. W zależności od przyczyn
nadpłytkowości dzielimy na pierwotne i wtórne. W nadpłytkowościach pierwotnych zwiększenie
liczby płytek jest wynikiem autonomicznego procesu rozrostowego (samoistna nadpłytkowość,
zespoły mieloproliferacyjne), we wtórnych – objawem innych chorób (ostre i przewlekłe
zapalenia, choroba nowotworowa). Nadpłytkowości pierwotne objawiają się nawracającymi
krwawieniami z przewodu pokarmowego, dróg moczowych lub zmianami zakrzepowymi w
obrębie naczyń śledzionowych, krezkowych czy mózgowych. Nadpłytkowości wtórne
najczęściej przebiegają bezobjawowo a zmniejszenie liczby płytek następuje po wyleczeniu
choroby podstawowej.
Przedłużenie czasu krwawienia przy prawidłowej ilości płytek krwi może być związane z
wrodzonym lub nabytym zaburzeniem czynności płytek. Wrodzone zaburzenia czynności
płytek krwi obejmują:

• anomalie błony płytkowej: zespół Bernarda-Souliera (przedłużony czas krwawienia,

nieznaczna małopłytkowość, olbrzymie i morfologicznie nieprawidłowe płytki),
trombastenia Glanzmanna (przedłużony czas krwawienia, brak agregacji płytek pod
wpływem ADP, kolagenu), defekt receptora kolagenu, zaburzenie prokoagulacyjnej
aktywności płytek (zespół Scotta),

• zaburzenia sekrecji ziarnistości płytkowych: choroba puli magazynowej, zaburzenia

mechanizmu sekrecji.

Nabyte zaburzenia czynności płytek są często występującym ubocznym skutkiem działania
wielu leków (kwas acetylosalicylowy, antybiotyki laktamowe) i niektórych produktów

6

spożywczych (wysokonienasycone kwasy tłuszczowe, alkohol etylowy, cebula, czosnek), mogą
pojawić się również w schorzeniach niehematologicznych (mocznica, choroby wątroby).

Osoczowe skazy krwotoczne związane są z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami,
zaburzeniami funkcji czynników krzepnięcia krwi.

Wrodzone:

• Choroba von Willebranda
• Hemofilia A
• Hemofilia B

Nabyte

• W przebiegu chorób wątroby
• Zespół rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego (DIC)
• Masywne transfuzje

Hemofilia (inaczej zwana "krwawiączką" czy też "chorobą królów") – grupa chorób
spowodowanych genetycznie uwarunkowanym niedoborem czynników krzepnięcia.
Cecha ta dziedziczy się z chromosomem X, co oznacza, iż chorują jedynie osoby z pełną
ekspresją recesywnego genu.
Hemofilia (niezależnie od typu) występuje w Polsce z częstością 1 : 12300 mieszkańców (1 :
5600 mężczyzn).

•

Hemofilia A - niedobór VIII czynnika krzepnięcia krwi (czynnika antyhemolitycznego),
"klasyczna hemofilia"

•

Hemofilia B - niedobór IX czynnika krzepnięcia krwi (czynnika Christmasa), "choroba
Christmasa"

Stosunek częstości występowania hemofilii A do B wynosi w Polsce 6,2 : 1
Zależnie od niedoboru czynnika wyróżniamy trzy postacie hemofilii.

•

postać ciężka - poziom czynnika poniżej 1% normy. Charakteryzuje się częstymi
wylewami pourazowymi i występowaniem tzw. krwotoków samoistnych (bez wyraźnej
przyczyny urazowej)

•

postać umiarkowana - poziom czynnika poniżej 1-5% normy,

•

postać lekka - poziom czynnika powyżej 5% normy.

Choroba von Willebranda najczęściej występująca skaza krwotoczna (1 osoba na 8000
mieszkańców).
Rozpoznanie i właściwa klasyfikacja tej choroby, ze względu na małą dostępność wiarygodnych
badań przesiewowych (pomiar czasu okluzji w analizatorze PFA-100) sprawia wiele trudności.
Wyróżniane są trzy typy z kolejnymi podtypami chvW.
TYP 1 (80% chorych) obniżenie poziomu ale czynnik jest prawidłowy
TYP 2 (20% chorych) budowa i funkcja czynnika jest nieprawidłowa, poziom może być
prawidłowy lub obniżony
TYP 3 (rzadki) o ciężkim przebiegu klinicznym z bardzo niskim poziomem czynnika von
Willebranda i czynnika VIII.
Godna odnotowania jest częstość występowania niedoboru czynników VII i XII (około 1:400000
mieszkańców),. pozostałe niedobory występują bardzo rzadko.

Zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego - zespół DIC (disseminated
intravascular coagulation), zespół chorobowy polegający na niekontrolowanej aktywacji (w
przebiegu różnych chorób) kaskady krzepnięcia i wytworzenie licznych „rozsianych”
mikrozakrzepów w świetle małych naczyń krwionośnych. Dochodzi do zużycia czynników
krzepnięcia oraz płytek krwi, powodując z jednej strony niewydolność narządów a z drugiej
objawy skazy krwotocznej ("koagulopatia ze zużycia").

7

DIC występuje jako powikłanie w wielu sytuacjach klinicznych

• uogólnione zakażenie (sepsa), najczęściej bakteriami gram-ujemnymi,
• powikłania ginekologiczne - zator wodami płodowymi, przedwczesne odklejenie

łożyska,

• uszkodzenia tkanek, takie jak przy oparzeniach, po zabiegu chirurgicznym, po

wypadku,

• hemolityczna reakcja poprzetoczeniowa,
• gorączki krwotoczne wywołane przez różne wirusy (Ebola),
• ostra białaczka promielocytowa,
• ukąszenie przez niektóre jadowite węże,
• choroby trzustki (rak, nawracające zapalenia).

Rozpoznanie skazy krwotocznej opiera się na wywiadzie, badaniu przedmiotowym i

badaniach laboratoryjnych i sprowadza się do ustalenia czy skaza ma charakter wrodzony lub
nabyty, czy towarzyszy innej chorobie lub jest wynikiem stosowanych leków, jaki jest charakter i
nasilenie skazy.

Dla podsumowania, do najczęściej stosowanych testów przesiewowych w diagnozie skaz
krwotocznych stosuje się badanie liczby płytek krwi, czasu krwawienia oraz oznaczenie czasów
krzepnięcia: czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT), czas protrombinowy (INR),
czas trombinowy.
W przypadku badań przesiewowych w kierunku występowania choroby von Willebranda należy
zwrócić szczególną uwagę na stosowanie odpowiednio czułych odczynników do wykonania
APTT. Pomiary czasu okluzji w analizatorze PFA-100, mimo ich potwierdzonej wartości w
wykrywaniu chvW, w Polsce, ze względu na wysokie koszty są wykonywane bardzo rzadko.
Badania specjalistyczne obejmują natomiast oznaczenie funkcji płytek krwi, poziomu
czynników krzepnięcia oraz inhibitorów krzepnięcia.
Pod względem przebiegu i obrazu klinicznego skazy naczyniowe i płytkowe różnią się od skaz
uwarunkowanych zaburzeniem krzepnięcia krwi (tabela).

Objawy kliniczne skaz krwotocznych

Skazy osoczowe

Skazy płytkowe i naczyniowe

Najczęstsze objawy

wylewy krwi do mięśni i
stawów, późne krwawienia
pourazowe

plamica, skłonność do
siniaczenia, krwawienia z
błon śluzowych

Krwawienia pooperacyjne

często późne krwawienia,
bardzo niebezpieczne

krwawienia podczas zabiegu,
mało niebezpieczne

Wybroczyny i sińce

wybroczyny występują
rzadko, sińce pojedyncze

często liczne wybroczyny i
sińce

Wynik ucisku miejsca
krwawienia

po zwolnieniu ucisku
nawrót krwawień

krwawienie zatrzymuje się
często na stałe

8

Diagnostyka laboratoryjna skaz krwotocznych

Przykłady zestawów badań koagulologicznych

koagulogram: liczba płytek krwi, czas krwawienia (BT), czas protrombinowy, APTT, stężenie
fibrynogenu.
skrócony koagulogram: liczba płytek krwi, czas protrombinowy, APTT.

Przykłady zastosowania wypranych badań układu hemostazy w diagnostyce skaz krwotocznych

Wyniki badań

Rodzaj zaburzenia

PT

APTT

Fg

BT

Skazy płytkowo-naczyniowe

N

N

N

⇑

⇑

⇑

⇑

Choroba von Willebrandta

N

⇑

⇑

⇑

⇑

N

⇑

⇑

⇑

⇑

Hemofilia A i B, niedobór czynników XI, XII,
krążące antykoagulanty

N

⇑

⇑

⇑

⇑

N

N

Hypo-, dysfibrynogenemie

⇑

⇑

⇑

⇑

⇑

⇑

⇑

⇑

⇓

⇓

⇓

⇓

N

Należy zaznaczyć, że w badaniach przesiewowych, w diagnostyce choroby von Willebranda
często stosowany jest analizator PFA-100. Wydłużony czas okluzji sugeruje konieczność
dalszej diagnostyki w tym kierunku.

Przykładowe zmiany parametrów układu hemostazy w zespole rozsianego wykrzepiania
wewnątrznaczyniowego - zespół DIC

• Obniżone miano płytek krwi < 100 x 10

9

/L z tendencją spadkową. Przedłużone

„czasy”(PT, APTT).

• Istotnie podwyższone stężenie FDP/D-Dimerów.
• Obniżone stężenie inhibitorów (AT, białka C).Obniżone stężenie czynników

krzepnięcia (V, VIII, X, XIII).

Diagnostyka zaburzeń układu hemostazy po zabiegach chirurgicznych

Zależnie od rodzaju zabiegu chirurgicznego występuje różne ryzyko powikłać ze strony układu
hemostazy, możemy mieć do czynienia zarówno z krwawieniami jak i zakrzepicą.
Ze szczególnie dużym ryzykiem powikłań należy się liczyć w przypadku zabiegów
kardiochirurgicznych, ortopedycznych a także, w pewnych przypadkach w czasie zabiegów
ginekologicznych.
• W okresie operacyjnym.

aktywacja układu krzepnięcia, aktywacja układu fibrynolizy, aktywacja płytek krwi

• W okresie okołooperacyjnym (do 6 godzin po zabiegu).

wzmożona fibrynoliza, dysfunkcja układu krzepnięcia (zużycie czynników krzepnięcia oraz
efekt niezneutralizowanej heparyny, spadek liczby płytek krwi i ich dysfunkcja (osłabiona
agregacja) mogą prowadzić do krwawień – obserwujemy wydłużenie PT, APTT, TT, spadek
stężenia fibrynogenu i miana płytek krwi.

• W okresie pooperacyjnym (powyżej drugiej doby po zabiegu)

zahamowanie układy fibrynolizy, wzrost stężenia czynników układu krzepnięcia i białek
ostrej fazy (fibrynogen), zwiększona liczba płytek krwi i wzmożona ich reaktywność.

9

Praktyczne zastosowanie podstawowych badań układu krzepnięcia

1) Czas protrombinowy (PT)

1. Testowanie sprawności szlaku aktywacji uruchamianego przez TF
2. Monitorowanie leczenia doustnymi antykoagukantami

Sposoby wyrażania czasu protrombinowego:

• wskaźnik %

-PT (sek) wzorcowe x 100

PT (sek) badane

• % aktywności – obliczany z krzywej rozcieńczeń osocza prawidłowego

• współczynnik -

PT (sek) badane

PT (sek) wzorcowe

• INR -

( współczynnik )

ISI

ISI – międzynarodowy współczynnik czułości (wyliczany w laboratorium wykonującym PT)

W celu ujednolicenia wyrażania czasu protrombinowego, dla potrzeb monitorowania leczenia
doustnymi antykoagulantami, wprowadzono międzynarodowy współczynnik znormalizowany
INR (International Normalized Ratio). Współczynnik INR uwzględnia różnice w czułości
stosowanych odczynników i aparatury.

Laboratoryjna kontrola leczenia doustnymi antykoagulantami:

INR – zakres terapeutyczny

Mechaniczne zastawki serca:

3.0 – 4.0

Biologiczne zastawki serca:

2.0 – 3.0

Migotanie przedsionków:

2.0 – 3.0

Leczenie śChZZ:

2.0 – 3.0

Leczenie zatoru tętnicy płucnej:

2.0 – 3.0

2) Czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT)

1. Testowanie sprawności szlaku aktywacji uruchamianego przez czynniki kontaktu.
2. Monitorowanie leczenia heparyną, wykrywanie hemofilii.

Laboratoryjna kontrola leczenia heparyną niefrakcjonowaną:

Do uzyskania terapeutycznego konieczne jest utrzymanie w osoczu aktywności heparynowej w
granicach 0.2 – 0.6 j./ml

metoda

zakres terapeutyczny

Czas krzepnięcia met. LW:

przedłużenie 1.5 – 3.0 razy

Czas krzepnięcia po aktywacji (ACT):

przedłużenie 1.5 – 3.0 razy

APTT:

przedłużenie 1.5 – 2.5 razy

10

Instrukcja wykonania ćwiczenia

1. Omówienie wykonania objawu opaskowego


2. Wykonanie (prezentacja) oznaczenia czasu krwawienia – 2 grupy po 5 osób
Materiały: nożyki do nakłuwania, gaziki, spirytus, rękawiczki jednorazowe
Czas krwawienia metodą Duke’a.
Płatek ucha nakłuwa się igłą. Wypływającą krew usuwa się gazikiem do chwili ustania wypływu
krwi.

Prezentacja czasu krwawienia wykonywanego metodą Ivy’ego.

Sposób przedstawiania wyników: czas wyrażony sekundach



3. Badania układu krzepnięcia

Pięcioosobowe grupy studentów mają wykonać oznaczenia, które ułatwią zrozumienie
złożonych mechanizmów regulacyjnych hemostazy wtórnej (badania układu krzepnięcia i
fibrynolizy).

Aktywacja układu krzepnięcia

a. aktywacja za pomocą tromboplastyny tkankowej (w tzw. dawniej w układzie

„zewnątrzpochodnym”) – wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego

b. badanie układu wspomagającego (tzw. dawniej układ „wewnątrzpochodny”) - wykonanie

oznaczenia APTT

Materiały: łaźnia wodna, pipety na 100

µl, końcówki do pipet, odczynniki (tromboplastyna, APTT

reagent), chlorek wapnia, probówki, osocze mrożone, rękawiczki


3a. Wykonanie oznaczenia czasu protrombinowego

Czas protrombinowy wg Quicka:

Zasada. Po dodaniu do osocza tromboplastyny i chlorku wapniowego następuje aktywacja
protrombiny, a następnie zamiana fibrynogenu w fibrynę. Wynik pomiaru zależy od zawartości
w osoczu protrombiny, czynników V, VII i X oraz fibrynogenu.
Odczynniki

tromboplastyna

0.025 M roztwór CaCl

2

Wykonanie. Do probówki zawierającej 100 µl osocza ubogopłytkowego należy dodać 100 µl
roztworu

tromboplastyny.

Całość

dokładnie

wymieszać

i

inkubować

przez

1 min. w łaźni wodnej (37

o

C). Po inkubacji dodać 100 µl roztworu CaCl

2

. Mierzyć czas

upływający od momentu dodania chlorku do wykrzepienia próby.

11

Zadanie do wykonania

Oznaczyć PT w dwóch oznakowanych próbkach osocza. Wynik czasu protrombinowego
przedstawić

w

postaci

wskaźnika

czasu

protrombinowego,

współczynnika

czasu

protrombinowego oraz INR (ISI=1.0). Porównać i zinterpretować otrzymane wyniki.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe wynoszą 10-16 sekund. Czas protrombinowy jest
przedłużony w następstwie obniżenia aktywności 3 spośród 4 czynników krzepnięcia zależnych
od witaminy K (II, VII i X). Przedłużenie czasu protrombinowego obserwuje się w awitaminozie
K, chorobach miąższu wątroby czy w zespole rozsianego krzepnięcia śródnaczyniowego.



3b. Wykonanie oznaczenia APTT

(czas częściowej tromboplastyny po aktywacji – Activated Partial Thromboplastin Time)

Zasada. Mierzy się czas krzepnięcia osocza zmieszanego z cytrynianem po maksymalnej
aktywacji czynników XI i XII oraz w obecności stałych stężeń fosfolipidu. Czynniki XI i XII są
aktywowane podczas wstępnej inkubacji osocza z zawiesiną kaolinu (zamiast kaolinu może być
celit). Kaolin jest odpowiednikiem kolagenu, natomiast kefalina – fosfolipidów. Efektem opisanej
reakcji jest wytrącenie włóknika i wytworzenie skrzepu.

1. Do dwóch ogrzanych probówek dodać:

100 µl osocza,
100 µl odczynnika aktywującego (fosfolipidy + aktywator powierzchniowy),
inkubować 2 min.,
dodać 100 µl CaCL

2

i zmierzyć czas krzepnięcia.

2. Do dwóch ogrzanych probówek dodać:

100 µl osocza,
100 µl odczynnika aktywującego (fosfolipidy + aktywator powierzchniowy),
Do jednej probówki dodać 10 µl odczynnika A do drugiej 10 µl odczynnika B,
inkubować 2 min.,dodać 100 µl CaCL

2

i zmierzyć czas krzepnięcia.

Sposoby wyrażania APTT:
czas wyrażony sekundach
Współczynnik: czas próby badanej/ czas próby kontrolnej

Zadanie do wykonania
Oznaczyć APTT w dwóch probówkach, należy porównać i zinterpretować otrzymane
wyniki.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe zależą od zastosowanego testu i wynoszą 25-40
sekund. Nieprawidłowy czas APTT występuje u pacjentów leczonych doustnie lub parenteralnie
lekami przeciwzakrzepowymi oraz gdy poziom czynników krzepnięcia toru wewnętrznego
(prekalikreina, wysokocząsteczkowy kininogen HMGH, czynniki VIII, IX, XI, XII) lub wspólnego
(I, II, V, X) uległ obniżeniu do 30-40% wartości wyjściowych. Jednoczesne stwierdzenie
prawidłowego czasu protrombinowego pozwala wykluczyć niedobór protrombiny, czynników V,
VII i X i hipofibrynogemię jako przyczynę przedłużania APTT.

12

4. Wykonanie agregacji płytek we krwi pełnej

Pomiar agregacji metodą ubytkową - SPC (Single Platelet Couting)


Zasada. Oznaczamy miano płytek we krwi pobranej na EDTAK

2

przed i po dodaniu ADP

(aktywatora płytek krwi). Agonista powoduje tworzenie agregatów płytkowych i spadek miana
płytek w badanej krwi. Obliczamy współczynnik ubytku płytek jako miara tworzenia agregatów
płytkowych:

wsp. agreg. = ((Plt0 – Pltaktyw)/Plt0)*100

Odczynniki

roztwór 1 (0.9% NaCl)
roztwór 2 (1 mM ADP)

Zadanie do wykonania

Do dwóch probówek dodajemy (po zamieszaniu) po 0,5 ml krwi pełnej;

oznaczyć miano płytek w obu probówkach,
do jednej probówki dodać 10 µl roztworu 1, a do drugiej 10 µl roztworu 2, mieszamy,
inkubować 3 minuty,
oznaczyć miano płytek krwi,
oznaczyć współczynnik agregacji.

Współczynnik agregacji wyrażany jest w procentach.

Interpretacja wyników: Wartości prawidłowe agregacji wynoszą > 60 %, niższe wyniki
związane są z dysfunkcją płytek lub stosowaniem leków przeciwpłytkowych.