człowieka, ale również w produkcji żywności.
Mikrobiologiczne wytwarzanie beta-karotenu
na skalę przemysłową jest możliwe przy udzia-
le glonów lub drożdży. Większą wydajność
można otrzymać w hodowlach z wykorzy-
staniem mikroorganizmów modyfikowanych
technikami rekombinacji DNA. Czynnikiem
ograniczającym wykorzystanie udoskonalonych
szczepów w procesach fermentacyjnych są
jednak stosunkowo wysokie koszty biosyntezy.
Oddzielnym zagadnieniem jest optymalizacja
podłoża do wydajnej mikrobiologicznej bio-
syntezy karotenowców. Transgeniczne rośliny
wzbogacone w prowitaminę A mogą także
przyczynić się do poprawy wartości żywieniowej
wielu płodów rolnych i zmniejszyć światowy

deficyt witaminy A. Uzyskane tymi drogami
produkty konkurują z naturalnymi produktami
pochodzenia roślinnego.
Wiele aspektów metabolizmu karoteno-
idów w organizmach żywych pozostaje do
wyjaśnienia. Skuteczność profilaktyczna
beta-karotenu teoretycznie wynika zarówno
z jego właściwości przeciwutleniających, jak
i ze zdolności wzmagania sił obronnych
organizmu. Beta-karoten jest przekształca-
ny w przewodzie pokarmowym, ponadto
dociera do wątroby, płuc, nerek i tkanki
tłuszczowej, gdzie w razie potrzeby również
ulega przemianie w kwas retinowy, który
może być przydatny do zwalczania np.
komórek nowotworowych. Czy może być

Mikroorganizm – hodowla

Karotenoidy

[mg/L]

Rhodotorula mucinaginosa – wyizolowany z jeziora Toncek w Patagonii (1700 m n.p.m.)

2,32

Rhodotorula rubra – kohodowla w obecności starterów jogurtowych (Lactobacillus

bulgaricus, Streptococcus thermophilus)

13,09

Rhodotorula glutinis, mutant 32 szczepu NCIM 3353 – mutageneza, manipulacja

temperaturą i światłem zwiększyła biosyntezę około 11-krotnie

250,00

Rhodotorula glutinis, szczep DBVPG 3853 – kohodowla w obecności Debaryomyces

castellii

4,40

Dunaliella salina – manipulacja światłem zwiększyła biosyntezę ok. 5-krotnie

10,35

Dunaliella salina – manipulacja temperaturą zwiększyła biosyntezę 2-krotnie

40,00

Tabela 3. Biosynteza karotenoidów przez drożdże i glony (Bhosale, 2004).

lepsza zachęta do spożywania naturalnych
produktów bogatych w beta-karoten?

‰

Piśmiennictwo
1. Abushita A.A., Daood H.G., Biacs P.A., Change in carotenoids

and antioxidant vitamin in tomato as a function of varietal and
technological factors. „Journal of Argicultural Food Chemistry”,
48, 2000, 2075-2081.

2. Bhosale P., Environmental and cultural stimulants in the

production of carotenoids from microorganisms. „Applied
Microbiological Biotechnology”, 63, 2004, 351-361.

3. Bhosale P., Gadre R.V., Optimalization of carotenoid

production from hyper-producing Rhodotorula glutinis
mutant 32 by a factorial approach. „Letters in Applied
Microbiology”, 33, 2001, 12-16.

4. Borowska J., Szajdek A., Zadernowski R., Jakość żywieniowa

soków przecierowych i napojów (2). „Przemysł Fermentacyj-
ny i Owocowo-Warzywny”, 3, 2004, 28-29.

5. Carper J., Żywność – twój cudowny lek. Hannah Publishing

Ltd, Londyn 1995.

6. Koch T.C., Goldman I.L., Relationship of carotenoids and

tocopherols in a sample of carrot root-color accessions and
carrot germplasm carrying Rp and rp alleles. „Journal of
Agricultural Food Chemistry”, 26, 53(2), 2005, 325-331.

7. Moise A.R., von Lintig J., Palczewski K., Related enzymes

solve evolutionary recurrent problems in the metabolism of
carotenoids. „Trends in Plant Science”, 10(4), 2005, 178-186.

8. Mosiewicz R., Karotenoidy – schwytane promienie słoneczne.

„Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny”, 4, 2002, 2-3.

9. Stahl W., Heinrich U., Jungmann H., Sies H., Tronnier H.,

Carotenoids and carotenoids plus vitamin E protect against
ultraviolet light-induced erythema in humans. „American
Journal of Clinical Nutrition”, 71, 2000, 795-798.

10. Yamini S., West K.P., Wu L., Dreyfuss M.L., Yang D.X.,

Khatry S.K., Circulating levels of retinol, tocopherol and caro-
tenoid in Nepali pregnant and postpartum women following
long beta-carotene and vitamin A supplementation. „European
Journal of Clinical Nutrition”, 55(4), 2001, 252-259.

Do lat 80. XX wieku listerioza, choroba wy-
woływana przeważnie przez bakterię Listeria
monocytogenes, była głównie zmartwieniem
służb weterynaryjnych, ponieważ powodowa-

stwierdzono pierwsze przypadki listeriozy
u ludzi spowodowane zakażoną sałatką wa-
rzywną. Od tego momentu Listeria zaczęła
być uważana za groźny patogen występujący
w żywności, z uwagi na rozpowszechnienie
w przyrodzie, zdolność przeżywania przez
długi okres w niesprzyjających warunkach
środowiska oraz wzrost w niskich tempera-
turach (do -0,4°C).

Listeria monocytogenes
a listerioza

Historia Listeria monocytogenes zaczyna się
w roku 1924, kiedy Murray, Webb i Swann

Listeria monocytogenes

jako niebezpieczne zakażenie
żywności – wykrywanie,
zapobieganie, zwalczanie

dr inż. Paweł Satora

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Akademia Rolnicza w Krakowie

ła poronienia i zapalenia opon mózgowych
u owiec i bydła. Ewidencja zachorowań
wykazała, że rozprzestrzeniała się ona przede
wszystkim drogą pokarmową. W roku 1981

Modern processing and packaging techniques have enabled production of
food with extended shelf-lives. With regard to listeriosis, partly processed
food, which supports the growth of Listeria monocytogenes during a long
shelf-life and is consumed without further heating, is of the greatest concern.
L. monocytogenes’ psychrotrophic and facultatively anaerobic nature and its
ability to grow in wide pH and a

w

ranges make it difficult to control in products

and in food processing facilities.Thus, to prevent product contamination with
L. monocytogenes, it is essential to understand listerial contamination routes
in food processing industries. By evolving efficient prevention measures, cases
of listeriosis can ultimately be prevented.

Rys. 1. Zdjęcie Listeria monocytogenes wyko-
nane przy użyciu mikroskopu elektronowego
(powiększenie 3000 x).

wykorzystanie drobnoustrojów |

związki karotenoidowe...

Mikrobiologia

2005

28

wyizolowali z martwych królików i świnek morskich Gram-dodatnie
pałeczki zaokrąglone na końcach, długości 1-2 µm i szerokości 0,5 µm
(rys. 1), które nazwali Bacterium monocytogenes. W kolejnych latach
wyodrębniono osobny rodzaj gatunku, w 1940 roku przemianowany
na Listeria – na cześć Lorda Josepha Listera. Nazwa ta została zaak-
ceptowana, pomimo że już wcześniej istniał rodzaj storczyków oraz
dwuskrzydłych (owady) pod taką samą nazwą. Obecnie rodzaj Listeria
zawiera oprócz L. monocytogenes pięć innych gatunków: L. grayi, L. in-
nocua, L. ivanovii, L. seeligeri oraz L. welshimeri. Głównym patogenem
ludzkim i zwierzęcym jest L. monocytogenes, jednakże stwierdzono
kilka przypadków, szczególnie listeriozy bydlęcej, spowodowanych
przez L. ivanovii.
Listeria monocytogenes jest szeroko rozpowszechniona w przyrodzie,
głównie w glebie, zarówno pól uprawnych, jak i nieużytków, a także
w lasach, ściekach oraz środowisku wodnym. Obecność komórek
L. monocytogenes stwierdzono u różnych gatunków zwierząt oraz
u człowieka. Stopień nosicielstwa u zdrowych osób w populacji ludz-
kiej szacuje się na 1-6%.
Prawie wszystkie zwierzęta domowe są podatne na infekcje wy-
woływane przez bakterie Listeria, jednakże najczęściej listeriozy
występują wśród przeżuwaczy. U zwierząt monogastrycznych
listerioza jest stosunkowo rzadka i objawia się głównie posoczni-
cą. Najczęstszymi objawami klinicznymi listeriozy przeżuwaczy
są: zapalenie opon mózgowych, posocznica oraz poronienia
płodu. Bakteria może przenikać do mleka zarówno chorych,
jak i zdrowych zwierząt, a także – poprzez łożysko – do wnętrza
płodu. Obecność komórek L. monocytogenes w surowym mleku
charakteryzuje się dużą sezonowością, a większa częstotliwość
w miesiącach zimowych sugeruje, że zakażenie przedostaje się do
organizmu zwierzęcia z pomieszczeń gospodarskich i/lub podczas
karmienia kiszonką.
U ludzi listerioza może przybierać postać inwazyjną lub niein-
wazyjną. Listerioza inwazyjna ma przebieg ostry, jest związana ze
ściśle określoną grupą ryzyka, a stopień śmiertelności jest wysoki,
podczas gdy dość łagodne infekcje nieinwazyjne występują głównie
u osób zdrowych. Postać inwazyjna jest stosunkowo rzadka, rocznie
stwierdza się 2-9 przypadków na milion osób, jednakże jest ona jedną
z najbardziej niebezpiecznych infekcji pokarmowych, charaktery-
zującą się śmiertelnością sięgającą 30%. Listerioza atakuje głównie
ludzi z osłabioną odpornością immunologiczną lub chorych, tj.
kobiety w ciąży, niemowlaki, chorych na nowotwory, po zabiegach
transplantacji, terapii imunosupresywnej, alkoholików, chorych
na cukrzycę, ludzi w podeszłym wieku oraz nosicieli wirusa HIV.
Następstwem listeriozy są infekcje centralnego układu nerwowego,
posocznica, poronienia, infekcje lub obumieranie płodu. Czas
inkubacji listeriozy inwazyjnej wynosi od jednego dnia do kilku
tygodni. Dawka infekcyjna nie jest znana i przypuszcza się, że różni
się w poszczególnych przypadkach.
Bakteremia L. monocytogenes u kobiet w ciąży charakteryzuje się
symptomami zbliżonymi do grypy, jednakże w końcowym efekcie
może prowadzić do poronienia albo urodzenia martwego płodu lub
zainfekowanego wcześniaka. U noworodków listerioza objawia się
posocznicą, kiedy zakażenie następuje z powodu zakażenia macicy,
lub zapaleniem opon mózgowych, albo ma miejsce w kanale rod-
nym. W przeciwieństwie do łagodnego przebiegu choroby u matek,
wystąpienie posocznicy u noworodków kończy się śmiercią w 8-38%
przypadków.

U dorosłych najczęstszymi symptomami inwazyjnej listeriozy są
bakteremia i infekcje centralnego układu nerwowego. Bakteremii
towarzyszy najczęściej gorączka i inne niespecyficzne objawy, takie
jak apatia i zmęczenie. Pacjenci z infekcją centralnego układu
nerwowego wykazują wysoką gorączkę, złe samopoczucie, ataksję,
częste zmiany stanu psychicznego.
Oprócz ostrej listeriozy L. monocytogenes powoduje infekcje nieinwa-
zyjne u zdrowych ludzi, których wynikiem są: zapalenie żołądka i jelit
oraz skóry. Łagodna choroba układu żołądkowo-jelitowego związana
z L. monocytogenes została po raz pierwszy zaobserwowana w 1994
roku. Mikroorganizm ten nie jest jednak zwykle badany w przypad-
kach zapalenia żołądkowo-jelitowego występującego wraz z gorączką,
stąd brakuje danych o jego udziale w tego typu schorzeniach. Symp-
tomy postaci nieinwazyjnej obejmują gorączkę, biegunkę, ból głowy
i mięśni oraz wymioty, które występują po krótkim okresie inkubacji,
wynoszącym od 18 do 28 godzin. Wykazano, że żywność wywołująca
ten typ listeriozy zawiera duże ilości L. monocytogenes, wynoszące
od 1,9

×

10

5

do 1,6

×

10

9

jtk/g, co wskazuje na to, że do powstania

stanów zapalnych potrzebna jest duża liczba komórek bakterii.
Kontaktowe zapalenie skóry spowodowane L. monocytogenes ob-
serwowane jest szczególnie na dłoniach i rękach weterynarzy oraz
rolników. W tym przypadku zakażenie następuje poprzez bezpo-
średni kontakt z zainfekowanym materiałem, np. podczas odbioru
porodu. Bakterie dostają się do organizmu ludzkiego poprzez otarcia
skóry. Podobnie jak w przypadku zapalenia żołądkowo-jelitowego,
wywoływane przez L. monocytogenes zapalenie skóry ma przebieg
łagodny i jest szybko leczone.

29

listeria monocytogenes jako niebezpieczne zakażenie żywności...

| zwalczanie mikrobów

Mikrobiologia

2005

Mimo że L. monocytogenes była uznawana
za patogen ludzki już od 1929 roku, droga
rozprzestrzeniania się infekcji nie była znana
aż do lat 80., kiedy to wybuchy epidemii
listeriozy powiązane zostały ze spożyciem
zakażonej żywności. Przyczyną tak późnego
wykrycia natury listeriozy były jej symptomy,
znacznie różniące się od objawów innych zna-
nych chorób związanych ze skażoną żywno-
ścią. Co więcej, listerioza jest rzadką chorobą,
pojawiającą się głównie u ludzi należących
do grupy ryzyka, a długi czas jej inkubacji
utrudnia śledzenie nośnika infekcji.
Pierwsze przekonujące dowody świadczące
o tym, że L. monocytogenes rozprzestrzenia
się drogą pokarmową, zostały zaprezento-
wane przez Schlechla i współpracowników
w 1983 roku. Badacz wykazał, że przyczyną
wybuchu epidemii listeriozy w Nowej
Szkocji (Kanada) w 1981 roku była surówka
warzywna. Kapusta użyta w sałatce nawożona
była obornikiem owczym, pochodzącym
od stada z przypadkami bydlęcej listeriozy.
W kolejnych latach stwierdzono dalsze cztery
epidemie, dwie w Stanach Zjednoczonych,
jedną w Szwajcarii i jedną w Danii. Epidemie
te spowodowane były spożyciem nabiału,
co przyczyniło się do dodania produktów
mlecznych do listy możliwych nośników L.
monocytogenes. Przypadki epidemii listerio-
zy w latach 1990-2002 związanych ze skażoną
żywnością wyszczególniono w tabeli 1.

Wykrywanie
i identyfikacja

Istnieją trzy podstawowe protokoły służące
do wykrywania mikroorganizmów pato-
gennych: (1) bezpośredni posiew na płytki
z podłożem selektywnym, (2) bezpośrednie

namnażanie selektywne oraz (3) namnażanie
wstępne. Wybór metody uzależniony jest od
oczekiwanej ilości komórek w próbce i/lub
standardów prawnych. Prawidłowa izolacja
i identyfikacja we wszystkich trzech protoko-
łach zależy od: (1) liczby i stanu fizjologicz-
nego badanego mikroorganizmu w próbce,
(2) selektywności podłoża, (3) warunków
inkubacji (czas, temperatura, obecność tlenu)
oraz (4) wybiórczości medium izolacyjnego
(łatwość w odróżnieniu badanego mikroor-
ganizmu od pozostałej mikroflory).
Otrzymanie czystych kultur i izolacja
L. monocytogenes z próbek, tj. krwi lub
płynów mózgowo-rdzeniowych pobranych
od pacjentów chorych na listeriozę, jest
stosunkowo łatwe, ponieważ bakteria ta
jest jedynym obecnym mikroorganizmem
i rośnie dobrze na większości podłoży mi-
krobiologicznych. Jednakże izolacja bakterii
ze złożonych prób, tj. żywności, środowiska
lub kału, zawierających obfitą mikroflorę
„tła” i niską liczbę komórek Listeria, wymaga
namnożenia komórek L. monocytogenes
przed detekcją. Początkowo wykorzysty-
wano w tym celu metodę tzw. „zimnego”
namnażania, bazującą na psychrotroficznej
naturze L. monocytogenes i obejmującą in-
kubację w nieselektywnym bulionie w niskiej
temperaturze (2-5

o

C) przez kilka tygodni lub

miesięcy. Ta czasochłonna metoda szybko
została zastąpiona techniką składającą się

z selektywnego namnażania i posiewu na
podłoża, które hamowały wzrost flory „tła”
w wyniku obecności inhibitorów, tj. chlor-
ku litu, kwasu nalidyksowego, akryflawiny,
cefotentanu, ceftazydymu, kolistyny, cyklo-
heksimidu, fosfomycyny i/lub polimyksyny
B. Obecnie istnieje kilka standardowych
metod (FDA, IDF, ISO i NCFA) wykrywania
L. monocytogenes, jednakże żadna z nich
nie wydaje się właściwa do wszystkich ty-
pów analizowanych produktów. Selektywne
namnażanie, zarówno jedno-, jak i dwustop-
niowe, jest przeprowadzane w temperaturze
30-37°C. Najczęściej używane są: bulion
EB (Listeria enrichment broth) w namna-
żaniu jednostopniowym oraz buliony LEBI
i LEBII lub bulion Frasera w metodzie
dwustopniowej. Podłoże EB zawiera TSBYE
(bulion tryptonowo-sojowy z ekstraktem
drożdżowym) wzbogacony w czynniki
selektywne: kwas nalidyksowy, akryflawinę
oraz cykloheksimid. Wadą bulionu EB jest
niższa pojemność buforowa w porównaniu
z innymi stosowanymi mediami. Buliony
LEB i Fraser służące do namnażania dwu-
stopniowego w drugim etapie zawierają
podwyższone ilości czynników selektywnych
w stosunku do tych stosowanych podczas
wstępnego namnażania. Oprócz składników
inhibujących (kwasu nalidyksowego i akry-
f lawiny), buliony LEB i Fraser zawierają
chlorek litu oraz cytrynian amonu, służący

18-24 godziny

48 godzin

Oxford agar

Kolonie o wielkości 0,5-1 mm

Ciemnobrązowe

Otoczone czarną strefą

1-2 mm

Czarne z wklęsłym środkiem

Otoczone czarną strefą

PALCAM agar

Kolonie o wielkości 0,5-1 mm

Szarozielone

Otoczone czarną strefą

1-2 mm

Szarozielone

Otoczone czarną strefą

Tabela 2. Wyniki pozytywne wzrostu Listeria monocytogenes na stałych podłożach selektywnych.

Rok

Produkt żywnościowy

Państwo

Liczba stwierdzonych

przypadków

Przypadki utraty ciąży

(% przypadków)

Śmiertelność

(% przypadków)

Serotyp

1990

Pasztet i pasty mięsne

Australia

11

11 (100,0)

6 (54,5)

1/2a

1991

Wędzone małże

Tasmania, Australia

4

0 (0)

0 (0)

1/2a

1992

Wędzone małże

Nowa Zelandia

4

0 (0)

0 (0)

1/2

1992

Jęzory wieprzowe w galarecie

Francja

280

93 (33,2)

63 (22,5)

4b

1994-1995

Wędzone owoce morza

Szwecja

9

3 (33,3)

2 (22,2)

4b

1995

Łagodnie dojrzewające sery,

>50% wilgotności (brie, feta,

camembert, mozzarella)

Francja

33

9 (45,0)

4 (20,0)

4b

1997

Ser Pont l’Eveque

Francja

14

Nieznane

0 (0)

4b

1998-1999

Masło

Finlandia

25

0 (0)

6 (0)

3a

1998-1999

Hot dogi, wędliny

USA

101

Nieznane

21 (20,8)

4b

1999

Pasztet

USA

11

2 (18,2)

Nieznane

1/2a

2000

Wędliny z indyka

USA

29

8 (27,6)

7 (24,1)

NZ

2000-2001

Wytwarzany domowymi

sposobami ser meksykański

z surowego mleka

USA

12

10 (83,3)

5 (41,7)

NZ

2002

Wędliny z indyka, w plastrach

USA

63

3 (4,8)

7 (11,1)

NZ

Tabela 1. Wybuchy epidemii listeriozy w latach 1990-2002 związane ze skażoną żywnością (NZ – brak danych).

zwalczanie mikrobów |

listeria monocytogenes jako niebezpieczne zakażenie żywności...

Mikrobiologia

2005

30

do wykrywania hydrolizy eskuliny (ciemnie-
nie pożywki).
Po wybiórczym namnażaniu następuje
posiew na płytki ze stałym medium selek-
tywnym. Poza czynnikami selektywnymi
większość stałych pożywek zawiera substancje
wskaźnikowe, chromogeny lub krew, mające
za zadanie odróżnić bakterie L. monocy-
togenes od innych przedstawicieli rodzaju
Listeria oraz mikroflory „tła”. Stałymi po-
żywkami selektywnymi dla rodzaju Listeria są
zwykle podłoża Oxford i PALCAM (tab. 2),
zawierające eskulinę oraz żelazowy octan
amonu, służący jako substancja wskaźniko-
wa odróżniająca rodzaj Listeria od innych
bakterii. Stosowanie obu pożywek zwiększa
dokładność oznaczenia, ponieważ różnią się
one między sobą selektywnością.
Wykorzystanie podłoży chromogennych
znacznie zwiększa dokładność oznaczenia
i jest zalecane m.in. przez zmodyfikowaną
normę ISO 11290, nad którą prace dobie-
gają końca. W tych pożywkach odróżnienie
L. monocytogenes od innych bakterii Listeria
oparte jest na produkcji fosfatydyloinozyto-
lo-specyficznej fosfatazy C przez L. mono-
cytogenes, która hydrolizuje substrat dodany

do podłoża, tworząc nieprzezroczyste halo
wokół kolonii. Obecnie komercyjnie dostęp-
ne są następujące podłoża chromogenne: agar
ALOA, BCM system, CHROM agar oraz
Rapid’ L. mono.
Typowe kolonie zaklasyfikowane do rodzaju
Listeria poddawane są badaniom potwierdza-
jącym przy użyciu metody Grama, testu na
aktywność katalazy i oksydazy oraz zdolności
ruchu w temperaturze 25°C. Gram-dodatnie,
katalazo-pozytywne, oksydazo-negatywne
pałeczki, wykazujące ruch w 25°C, są da-
lej weryfikowane jako L. monocytogenes
poprzez badanie

β-hemolizy, testowanie

zdolności fermentowania ramnozy i ksylo-
zy oraz test CAMP. Ponieważ tradycyjne
metody izolacji i identyfikacji patogenów
z żywności są czaso- i pracochłonne, opra-
cowano liczne szybkie techniki wykrywania
L. monocytogenes.
Serologia jest klasycznym narzędziem wykry-
wania typów serologicznych L. monocyto-
genes. W oparciu o antygeny: somatyczny
(O) oraz wici (H) gatunek podzielono na
13 serotypów. Ponad 95% szczepów izolowa-
nych z chorych pacjentów i żywności należy
jednak tylko do serotypów 1/2a, 1/2b i 4b, co

ogranicza wykorzystanie tej metody w bada-
niach epidemiologicznych oraz zakażeń.
Wśród metod molekularnych na szczególną
uwagę zasługuje elektroforeza żelowa w polu
pulsacyjnym (PFGE). Polega ona na pocię-
ciu całego genomu bakteryjnego na kilka
(5-20) stosunkowo dużych (10 do 800 kb)
fragmentów DNA. Duże fragmenty są słabo
rozdzielane lub nie są wcale rozdzielane
przy użyciu konwencjonalnej elektroforezy
żelowej, dlatego w tym celu wykorzystywana
jest elektroforeza z zastosowaniem zmienne-
go pola elektrycznego. W PFGE bakteryjny
DNA jest izolowany in situ, aby uzyskać
nienaruszony materiał genetyczny. Komórki
są najpierw osadzane na żelu agarozowym
i oczyszczane z detergentów i enzymów. Cały
genom jest trawiony przy użyciu enzymów
restrykcyjnych, a uzyskane w rezultacie
fragmenty są rozdzielane przy użyciu PFGE.
Omawiana metoda jest powtarzalna i silnie
różnicuje poszczególne szczepy, istnieją
również liczne bazy danych dla mikroorgani-
zmów. PFGE jest bardzo często używana do
charakteryzowania izolatów L. monocytoge-
nes. Zaproponowano także standaryzowane
protokoły dla tego typu oznaczeń.

Podłoża mikrobiologiczne
Testy enzymatyczne
Testy immunoenzymatyczne

do oznaczania Salmonelli, Listerii, E. coli 0157,
mikotoksyn, histaminy

Od lat ułatwiamy codzienną praktykę laboratoryjną. Naszym klientom oferujemy testy

i podłoża diagnostyczne renomowanych firm. Poprawa jakości

i wprowadzanie systemu HACCP przy zastosowaniu naszych metod stają się dużo prostsze.

Testy Petrifilm

TM

gotowe płytki do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów, bakterii z grupy coli, E. coli,
drożdży i pleśni, bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, gronkowców

Testy Easicult

®

, Hygicult

®

gotowe testy do badania wody technologicznej, stanu higienicznego linii

technologicznych i urządzeń w zakładach

Bioluminometry

Uni-Lite i Uni-Lite NG

umożliwiają szybką i dokładną kontrolę linii

produkcyjnych opartą na pomiarze ATP

Testy Pro-Tect

szybkie testy do badania pozostałości

białkowych na liniach produkcyjnych

®

B I O T R C E

M E A S U R A B L

Y

B E T T E R

®

B I O T R C E

M E A S U R A B L

Y

B E T T E R

Biok ar Diagnostics

NOACK POLEN Sp. z o.o.

02-738 Warszawa, ul. Dominikańska 11c

tel. [phone]

fax [phone]

www.noackgroup.com

31

listeria monocytogenes jako niebezpieczne zakażenie żywności...

| zwalczanie mikrobów

Mikrobiologia

2005

Występowanie
L. monocytogenes
w zakładach
spożywczych i żywności

L. monocytogenes jest fakultatywnym bez-
tlenowcem i może rozwijać się w żywności
zapakowanej pod próżnią i w atmosferze
modyfikowanej. Optymalna temperatura jej
wzrostu zawiera się pomiędzy 30 a 37°C,
bakteria przeżywa jednakże również w tem-
peraturach chłodniczych (około 0,5°C),
a nawet podczas zamrażania. Wzrost bakterii
ograniczają temperatury powyżej 45°C, a jej
komórki są całkowicie niszczone w procesie
pasteryzacji (71,6°C przez 15 sekund).
L. monocytogenes może rosnąć w szerokim
zakresie pH (4,3-9,6), z optimum wzrostu
występującym w środowisku obojętnym
lub lekko zasadowym. Minimalna wartość
aktywności wodnej dla tego mikroorgani-
zmu wynosi 0,90, jednakże może również
przeżywać dłuższe okresy przy niższej a

w

.

L. monocytogenes rozwija się w środowisku
zawierającym chlorek sodu w stężeniu 12%,

dlatego ograniczanie wzrostu tego mikro-
organizmu poprzez solenie jest zupełnie
nieskuteczne.
L. monocytogenes jest wrażliwa in situ na de-
zynfektanty powszechnie stosowane w prze-
myśle spożywczym. Wykazano jednak, że ma-
teriał organiczny znacznie obniża aktywność
tych związków, a bakterie rosnące w postaci
biofilmów są na nie bardziej odporne niż
komórki zawieszone. Co więcej, stwierdzono
duże różnice szczepowe we wrażliwości na
dezynfektanty oraz możliwość występowania
zjawiska adaptacji krzyżowej.
L. monocytogenes jest szeroko rozpowszech-
niona w przyrodzie. Jest często wykrywana
w glebie i wodzie oraz na materiale roślinnym,
jest również wydalana przez liczne gatunki
zwierząt, stąd może być wprowadzana do
żywności np. podczas uboju zwierząt lub
dojenia krów. Obecność L. monocytogenes
w surowcach na podstawie wyników badań eu-
ropejskich naukowców przedstawia tabela 3.
Obecność L. monocytogenes w surowym
mleku jest z reguły rzadka, a poziom skażenia

– bardzo niski. Wiadomo, że L. monocy-
togenes przedostaje się do mleka zarówno
chorych, jak i zdrowych zwierząt, a zakażenie
mleka może być spowodowane złymi warun-
kami sanitarnymi panującymi na farmie lub
zapaleniem wymienia u krów.
Komórki L. monocytogenes stwierdzane
były w rzeźniach, zarówno drobiowych,
jak i bydlęcych. Źródłem zanieczyszczenia
są głównie żywe zwierzęta, a szczególnie
ich odchody, gruczoły chłonne oraz skóra.
Skażenie tusz po uboju jest jednak głównie
związane ze złymi warunkami sanitarnymi
panującymi w rzeźni oraz podczas uboju.
Występowanie L. monocytogenes w tuszkach
drobiowych jest wyższe niż w wołowych
(tab. 3). Mimo to jest mało prawdopodobne,
aby drób był powszechnym rezerwuarem
bakterii Listeria, ponieważ badania żywego
inwentarza wykazały brak lub niskie poziomy
tego mikroorganizmu.
Chociaż naturalnym środowiskiem wegetacji
L. monocytogenes jest gleba, bakteria jest
również izolowana ze słodkiej i morskiej
wody, szczególnie na obszarach przybrzeż-
nych, oraz w wodzie obciążonej ściekami.
U ryb L. monocytogenes jest znajdowana
na skórze, skrzelach, głowie oraz w śluzie,
a wielkość skażenia jest uzależniona od obec-
ności bakterii w wodzie, z której dokonano
połowu. Ilość komórek Listeria w mięsie
łososia różni się w zależności od przetwórni,
w której znajdują się ryby; przypuszcza się,
że niektóre ubojnie mogą być skolonizowane
przez ten mikroorganizm.
L. monocytogenes wykrywana jest w licz-
nych zakładach spożywczych, m.in. w mle-
czarniach, zakładach przetwórstwa ryb-
nego i mięsnych, a także wytwarzających
produkty „ready-to-eat”. W zakładach
przetwórczych wykrywana jest najczęściej
w miejscach, które nie mają bezpośredniego
kontaktu z żywnością. Obszarem wystę-
powania komórek L. monocytogenes są
głównie powierzchnie podłóg, drzwi, ścian,
wózków i studzienek ściekowych. Stwier-
dzano ją również na obuwiu pracowników,
wycieraczkach sanitarnych oraz w myjniach
stóp. Zakażonymi powierzchniami mający-
mi bezpośredni kontakt z żywnością są rę-
kawiczki i fartuchy pracowników oraz sprzęt
przetwórczy, tj. przenośniki taśmowe, tanki,
urządzenia chłodzące i zamrażające, a także
maszyny służące do skórowania, krojenia,
wypełniania nadzieniem oraz pakowania.
Wymieniony sprzęt często charakteryzuje się
dużą złożonością, licznymi przewężeniami

Próbka

Liczba prób pozytywnych/wszystkich (%)

Kraj

Surowe mleko

Krowy

1/59 (2)

25/1459 (2)

28/774 (4)

3/294 (1)

160/2647 (3)

Finlandia

Francja

Hiszpania

Szwecja

Słowacja

Tuszki

Drób

Wołowina

Wieprzowina

132/552 (24)
103/320 (32)

15/100 (15)

11/50 (22)

0/13 (0)

0/144 (0)

0/20 (0)

27/317 (9)

1/49 (2)
0/25 (0)

0/480 (0)
0/480 (0)

0/36 (0)
4/90 (4)

45/478 (9)

Belgia, Francja

Dania

Hiszpania

Belgia

Norwegia

Szwajcaria

Holandia

Polska

Belgia

Norwegia
Norwegia

Szwecja

Swajcaria

Holandia

Polska

Surowe mięso

Drób

Wołowina

Wieprzowina

Jagnięcina

112/410 (27)

8/17 (47)

38/61 (62)
13/17 (76)
55/90 (61)
19/30 (63)
12/94 (13)

1/4 (25)

13/34 (38)

107/296 (36)

4/15 (27)
7/17 (41)

Belgia, Francja

Dania

Finlandia

Grecja

Norwegia

Wielka Brytania

Holandia

Wielka Brytania

Grecja

Holandia

Wielka Brytania
Wielka Brytania

Surowe ryby

Łosoś

Pstrąg tęczowy

Inne

0/16 (0)
0/50 (0)
6/7 (86)
0/40 (0)

16/215 (7)

7/8 (88)
1/48 (2)

8/633 (1)

Włochy

Norwegia
Norwegia
Norwegia

Norwegia, Wyspy Owcze

Wielka Brytania

Portugalia

Polska

Tabela 3. Obecność Listeria monocytogenes w surowcach zwierzęcych w Europie.

zwalczanie mikrobów |

listeria monocytogenes jako niebezpieczne zakażenie żywności...

Mikrobiologia

2005

32

oraz strefami o utrudnionym dostępie,
w których obniżona jest skuteczność mycia
i dezynfekcji. Nie jest więc niczym zaskaku-
jącym obecność komórek bakterii w tego
rodzaju miejscach.
Również temperatura i stan powierzchni mają
duży wpływ na występowanie L. monocyto-
genes. Powierzchnie o niskiej temperaturze
charakteryzują się częstszą obecnością tych
bakterii, podczas gdy na obszarach o sto-
sunkowo wysokiej temperaturze (>10°C)
L. monocytogenes jest często nieobecna.
Jednocześnie gładkim powierzchniom ze stali
nierdzewnej towarzyszy znacznie niższy po-
ziom bakterii niż powierzchniom porowatym
lub uszkodzonym.
Prowadzono liczne badania w celu określenia
występowania L. monocytogenes w żywności.
Produkty o podwyższonym ryzyku wystę-
powania tego mikroorganizmu przedstawia
tabela 4.
Wykazano, że zarówno produkty poddawane
obróbce termicznej, jak i te nieprzetwarzane
mogą zawierać komórki tej bakterii. Produk-
tami najczęściej zakażonymi bakterią Listeria
są sery (do 30% wyrobów), a najwyższą jej
obecność stwierdzono w serach miękkich.
W mięsie, drobiu i produktach „gotowych
do spożycia” (RTE) zawartość tych drobno-
ustrojów może być również znaczna (0-24%).
Pomimo że produkty rybne są mniej nara-
żone na działanie bakterii Listeria niż mięso
i nabiał, wyniki badań wykazały ich częstą
obecność (od 0 do 50% badanych prób).

Owoce morza

Wędzone owoce morza (np. ryby i mięczaki)

Surowe owoce morza (np. ryby i mięczaki)

Konserwowane ryby (np. suszone, wędzone, marynowane)

Gotowane „gotowe do spożycia” skorupiaki (np. krewetki i kraby)

Płody rolne

Warzywa (surowe)

Nabiał

Świeże sery miękkie (np. Queso Fresco, Queso de Creama i Queso de Puna)

Miękkie sery niedojrzewające, >50% wilgotności (np. serki ziarniste, sery smarowne

i ricotta)

Miękkie sery dojrzewające, >50% wilgotności (np. brie, camembert, feta i mozzarella)

Półmiękkie sery, 39-50% wilgotności (np. blue, brick, monterey i muenster)

Twarde sery, <39% wilgotności (np. cheddar, colby i parmesan)

Sery topione

Pasteryzowane mleko

Niepasteryzowane mleko

Lody i mrożone produkty mleczarskie

Produkty mleczne z kulturami mikroorganizmów (np. jogurt, śmietana i maślanka)

Wysokotłuszczowe produkty mleczarskie i inne (np. masło, śmietanka)

Mięso

Frankfurterki (podgrzewane i niepodgrzewane)

Suche/półsuche kiełbaski fermentowane

Wędliny „gotowe do spożycia”

Pasztet i pasty mięsne

Żywność

mieszana

Różne sałatki – owocowe, warzywne, mięsne, makaronowe, jajeczne, rybne i inne

Tabela 4. Grupy artykułów spożywczych o potencjalnym ryzyku rozwoju Listeria monocytogenes.

Oprócz ogólnej obecności L. monocytogenes
w produktach żywnościowych, istotny jest rów-
nież poziom skażenia; 100 jtk/g w momencie
spożycia uważa się za niskie ryzyko dla kon-
sumenta. Badania zakrojone na szeroką skalę
(ponad 10 000 próbek żywności) prowadzone
w Danii i Francji potwierdziły duże zróżnico-
wanie poziomu L. monocytogenes w wyrobach
spożywczych. W Danii stwierdzono, że 1,3%
produktów mięsnych po obróbce cieplnej oraz
konserwowane wyroby mięsne i rybne wyka-
zywały poziom skażenia powyżej 100 jtk/g.
Podobne wyniki uzyskano we Francji.
Wprowadzone w 1993 roku we Francji
monitorowanie żywności pod kątem jej
skażenia L. monocytogenes zaowocowało
obniżeniem ilości produktów wykazujących
ponad 100 jtk bakterii w 1 g z 1,3 (1993-94)
do 0,8 % (1995-96). Podobny plan wdrożony
w Finlandii spowodował redukcję liczby za-
każonych produktów rybnych z 15-50 (1996-
-98) do 5% (2000); równocześnie wyroby
zawierające ponad 100 jtk Listeria/g zostały
całkowicie wyeliminowane.

Kontrola
i zapobieganie rozwojowi
L. monocytogenes

Wiele państw ustanowiło prawnie minimalną
ilość komórek L. monocytogenes, która
może być obecna w żywności. W Stanach
Zjednoczonych nie może ona występować
w 50 g produktu. Dyrektywa Unii Euro-
pejskiej określa „zerową tolerancję” dla

PHU SELMA IMPORT-EXPORT
ul. Cieszyñska 4/85,
02-716 Warszawa
tel. [phone],

0-601 347421

tel./fax [phone]
www.selma.pl
e-mail: [e-mail]

Zapraszamy na targi
EUROLAB 2005

KOMORY LAMINARNE

I WYCI¥GI LABORATORYJNE

LAMIL

Zapraszamy na targi
EUROLAB 2005

33

listeria monocytogenes jako niebezpieczne zakażenie żywności...

| zwalczanie mikrobów

Mikrobiologia

2005

25 g żywności; pojawienie się ponad 10 jtk
w 25 g produktu uważa się za niedopusz-
czalne. Nieco łagodniejsze regulacje prawne
istnieją w Niemczech, gdzie obecność do-
piero ponad 10 jtk/g produktu powoduje
jego wycofanie ze sprzedaży. Mimo że inne
gatunki z rodzaju Listeria niezwykle rzadko
bywają przyczyną stanów patologicznych,
przyjmuje się, że są one wskaźnikami złych
warunków sanitarnych w zakładzie, dlatego
w produktach eksportowanych nie można
tolerować ich obecności.
Liczni naukowcy zajmujący się bezpieczeń-
stwem żywności zgadzają się, że wymagana
jest bardzo restrykcyjna jej kontrola w celu
zapobieżenia rozwojowi pokarmowych
listerioz. Owa kontrola polega na: (1) labo-
ratoryjnym monitoringu zagrożeń, (2) wyko-
rzystywaniu systemu HACCP, (3) stosowaniu
tzw. „płotków” (np. wysokiej temperatury),
a także (4) edukacji osób odpowiedzialnych
za proces produkcji w zakładzie.
Przestrzeganie Dobrej Praktyki Przemysłowej
(GMP) oraz Standardowych Procedur Sani-
tarnych (SSOP) w zakładach przemysłu spo-
żywczego zapobiega ponownemu zakażaniu
żywności podczas jej przetwarzania. Efektyw-
ne odkażanie urządzeń powinno obejmować:
mycie na sucho, wstępne płukanie w wodzie,
mycie chemiczne i mechaniczne, płukanie
wodą, wizualny przegląd wyposażenia oraz
suszenie i usuwanie stojącej wody. Ostatnie
dwa etapy są szczególnie ważne, ponieważ
zapobiegają rozwojowi bakterii Listeria na
podłogach hal produkcyjnych, a mikroor-
ganizm ten wymaga do swojego wzrostu
wilgoci. Przetwórcy muszą również określać
skuteczność mycia oraz lokalizować poten-
cjalne źródła zakażenia poprzez dokonywanie
analiz mikrobiologicznych zarówno środowi-
ska hal, jak i powierzchni mających kontakt
z produkowaną żywnością. Testy powinny
obejmować określanie ilości tlenowców meto-
dą płytkową, posiewy na podłoża selektywne
dla rodzaju Listeria lub oznaczenia biolumi-
nescencyjne ATP. Częstotliwość odkażania
uzależniona jest od rodzaju wytwarzanej
żywności oraz potencjalnego ryzyka. Sprzęt
i narzędzia wytwórcze winny być poddawane
zabiegom sanitarnym przed i po użyciu,
a ich kontakt z posadzką w halach musi być
restrykcyjnie ograniczony. Podczas mycia hal
produkcyjnych należy unikać nadmiernego
rozpryskiwania się wody w celu zmniejszenia
ryzyka tworzenia się bioaerozoli.
Udowodniono, że najwyższą skutecznością
w stosunku do L. monocytogenes charakteryzują

się czwartorzędowe związki amonowe (400-
-800 ppm), jodofory (200 ppm), roztwory
chloru oraz nowe dezynfektanty zawierające
kwas nadoctowy lub nadoktanowy. Niektóre
zakłady dokonują okresowych zmian substan-
cji myjących (co miesiąc lub co dwa miesiące),
aby zapobiec uodpornianiu się bakterii na
substancje odkażające. Jednocześnie należy
wybierać detergenty kwaśne, aby unikać two-
rzenia się mydlin i kamienia, które prowadzą
do powstawania biofilmów. Wysoką efektyw-
ność wykazuje również odkażanie powierzchni
przy użyciu wysokiej temperatury w postaci
gorącej wody o temperaturze ponad 80°C
lub pary wodnej.
Kontrola L. monocytogenes w samej żywności
jest bardzo trudna ze względu na jej zdolności
do wzrostu w temperaturach zamrażalniczych,
tolerancji niskiego pH oraz stosunkowo wy-
sokich stężeń chlorku i azotanu sodu, które
hamują rozwój innych patogenów. Obniżenie
temperatury może jednak ograniczyć tempo
namnażania się bakterii. Przyjmuje się, że
obniżenie temperatury przechowywania
frankfurterek z 7 do 2°C zwiększa ich trwałość
5-krotnie. Równoczesne wykorzystanie atmos-
fery modyfikowanej CO

2

może całkowicie

wyeliminować L. monocytogenes z produktu.
Efekt tego zjawiska nie jest jednak jeszcze do
końca poznany.
Wśród środków chemicznych najlepszym dzia-
łaniem hamującym wzrost L. monocytogenes
odznaczają się mleczan i diacetyl sodu. Związ-
ki te, dodawane w postaci mieszanki, obniżają
pH i mogą być stosowane jako dodatek głów-
nie do wyrobów mięsnych i drobiowych. Ich
skuteczność ulega znacznej poprawie, kiedy
produkty są przetrzymywane w temperaturze
chłodniczej (4,5°C) oraz w atmosferze mody-
fikowanej. Potencjalne zastosowanie przeciw
bakteriom Listeria przedstawiają również:
monolaurynian, który rozprowadzany jest
na powierzchni wędlin w postaci roztworu
(800 ppm), oraz olejek goździkowy, który może
również być dodawany do serów.
Bakteriocyny produkowane przez niektóre ga-
tunki bakterii kwasu mlekowego są białkami
wykazującymi silne działanie przeciwbakteryj-
ne, a jako naturalne substancje konserwujące
mogą być stosowane w żywności. Najbardziej
znana – nizyna, a także inne bakteriocyny,
głównie z klasy IIa, są zabójcze dla licznych
mikroorganizmów patogennych, tj. Staphy-
lococcus aureus, Enterococcus faecalis czy
wreszcie L. monocytogenes. Gdy omawiana
grupa związków jest stosowana wraz z innymi
substancjami, tj. NaCl, kwasem mlekowym,

azotanami, monolaurynianem i monosor-
binianem potasu, wzrasta efektywność jej
działania na komórki L. monocytogenes.
Zastosowanie innych metod, np. napromienio-
wania czy manotermosonifikacji (wykorzystanie
niskiego ciśnienia, ultradźwięków i temperatu-
ry), wydaje się również skutecznym sposobem
na wyeliminowanie zakażeń L. monocytogenes,
jednakże ze względu na brak unormowań
prawnych, szczególnie w przypadku tej drugiej
metody, nie mogą one być jak na razie wyko-
rzystywane na skalę przemysłową.
Nowoczesne przetwórstwo i techniki pako-
wania umożliwiły produkcję żywności, która
może być przechowywana przez dłuższy czas.
Równocześnie pojawiły się nowe zagrożenia
mikrobiologiczne, które potrafią zaadapto-
wać się do nowych warunków panujących
w zakładach przemysłowych. W przypadku
listeriozy największą troskę stanowi częściowo
przetworzona żywność, która wspiera wzrost
L. monocytogenes w czasie przechowywania
i jest spożywana bez dalszego podgrzewania.
Ponieważ L. monocytogenes jest psychrotro-
fem i fakultatywnym beztlenowcem, a także
wykazuje zdolność wzrostu w szerokim
zakresie pH i aktywności wodnej, jej obec-
ność jest bardzo trudna do kontrolowania
w żywności i zakładach przetwórczych.
Zatem aby zapobiegać zanieczyszczeniu
żywności tym patogenem, niezmiernie ważne
jest zrozumienie dróg rozprzestrzeniania
się L. monocytogenes w zakładach prze-
mysłowych. Poprzez doskonalenie środków
prewencyjnych przypadki listeriozy powinny
zostać ostatecznie wyeliminowane.

‰

Piśmiennictwo
1. Autio T., Tracing the sources of Listeria monocytogenes

contamination and listeriosis using molecular tools.
Praca doktorska, Uniwersytet w Helsinkach, 2003.

2. Beumer R.R., Hazeleger W.C., Listeria monocytoge-

nes: diagnostic problems. „FEMS Immunol. Med.
Microbiol.”, 35, 2003, 191-197.

3. Bouttefroy A., Linder M., Milliere J.B., Predictive

models of the combined effects of curvaticin 13,
NaCl and pH on the behaviour of Listeria monocy-
togenes ATCC 15313 in broth. „J. Appl. Microbiol.”,
88, 2000, 919-929.

4. Kwiatek K., Occurence of Listeria monocytogenes

in selected food of animal origin. „Bull. Vet. Inst.
Pulawy”, 48, 2004, 269-272.

5. Suslow T., Harris L., Guideline for controling Listeria

monocytogenes in small- to medium-scale packing
and fresh-cut operations. Materiały Uniwersytetu
w Kaliforni, 2000.

6. Vrinda Menon K., Garg S.R., Inhibitory effect of clove

oil on Listeria monocytogenes in meat and cheese.
„Food Microbiol.”, 18, 2001, 647-650.

7. Walczycka M., Satora P., Listeria monocytogenes

w żywności. Materiały Seminarium IPH, Kraków,
5 maja 2004.

zwalczanie mikrobów |

listeria monocytogenes jako niebezpieczne zakażenie żywności...

Mikrobiologia

2005

34