INŻYNIERIA GENETYCZNA - Laboratorium
ĆWICZENIE NR III
1) Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania - elektroforeza
preparatywna zlinearyzowanego i defosforylowanego plazmidu.
Zlinearyzowane i defosforylowane DNA plazmidu pGEX-2T poddać horyzontalnej
elektroforezie preparatywnej w żelu agarozowym o stężeniu 0.8 %, przygotowanym
w 1×TBE, zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0.4 µg/ml. Wymiary żelu w przypadku
elektroforezy preparatywnej wynoszą 72 × 85 × 5 mm. Elektroforezę prowadzić w aparacie BIO-RAD, w buforze 1×TBE, przy stałym napięciu 70 V, przez około 2 h. Żel analizować w świetle UV przy dłuższej fali (365 nm) tak, aby nie nastąpiło sieciowanie DNA.
Przygotowanie próbki do naniesienia na żel preparatywny:
20 µl mieszaniny po defosforylacji
5 µl 5× bufor do nanoszenia próbek na żel agarozowy (5×SB)
= 25 µl
Na żel agarozowy nanosić:
*) po 25 µl każdej z przygotowanych próbek defosforylowanego wektora pGEX-2T;
*) 7 µl markera wagowego FastRulerTM DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fermentas);
2) Elucja DNA z żelu agarozowego (metoda Gel-Out®).
(A&A Biotechnology)
1. Po lokalizacji na żelu agarozowym w świetle UV (przy dłuższej fali, tzn. 365 nm) pasma, odpowiadającego fragmentowi DNA o odpowiedniej długości, wyciąć skalpelem
z żelu pasek i przenieść go do zważonej i opisanej probówki Eppendorfa, a następnie
zważyć na wadze analitycznej i zanotować masę netto fragmentu wyciętego żelu. Masa ta
nie powinna przekraczać 200 mg.
2. Do wyciętego skrawka agarozy dodać 400 µl roztworu R7S.
Ćwiczenie III
INŻYNIERIA GENETYCZNA Zima 2011/2012
1
3. Zawartość
probówki
wymieszać
i
inkubować
w
termomikserze
Eppendorf,
w temperaturze 50°C, przy obrotach równych 500 rpm, do momentu rozpuszczenia agarozy (5-8 min). W czasie rozpuszczania agarozy mieszać od czasu do czasu bardzo
delikatnie zawartość probówki tak, aby ułatwić proces rozpuszczania.
4. Następnie dodać 200 µl izopropanolu i dokładnie wymieszać.
5. Mieszaninę krótko odwirować w celu usunięcia resztek roztworu z wieczka i ścianek
probówki.
6. Otrzymaną mieszaninę nanieść na kolumnę do oczyszczania DNA, a następnie całość
wirować ok. 30 s, przy ok. 10 000 × g.
7. Wyjąć kolumnę z probówki, przesącz ( tu nie powinno być DNA) przenieść do czystej probówki Eppendorfa, a kolumnę ponownie włożyć do probówki. Na złoże w kolumnie
nałożyć 600 µl roztworu A1 do płukania.
8. Wirować ok. 30 s przy ok. 10 000 × g.
9. Wyjąć kolumnę z probówki, przesącz odrzucić, a kolumnę ponownie włożyć do
probówki. Na złoże w kolumnie nałożyć 300 µl roztworu A1 do płukania.
10. Wirować ok. 2 min przy ok. 10 000 × g.
11. Wyjąć kolumnę z probówki, przesącz odrzucić, a kolumnę ponownie włożyć do
probówki. W celu osuszenia złoża, kolumnę z probówką inkubować ok. 3 minuty
w temperaturze pokojowej.
12. W celu elucji DNA, osuszoną kolumnę umieścić w pustej, podpisanej probówce
Eppendorfa i na kolumnę nałożyć 30 µl buforu TE tak, aby całkowicie pokryć złoże.
13. Pozostawić kolumnę na ok. 3 minuty w temperaturze pokojowej.
14. Wirować 1 min przy ok. 10 000 × g.
15. Otrzymany przesącz zawierający zlinearyzowany, defosforylowany i oczyszczony
plazmid pGEX-2T przechowywać w temperaturze -20°C.
Ćwiczenie III
INŻYNIERIA GENETYCZNA Zima 2011/2012
2