Znakowanie
przeciwciał
1
Schemat budowy przeciwciała
2
Zapamiętaj podstawowe zasady
znakowania przeciwciał
1. Przeciwciała przed reakcjami sprzęgania muszą zostać oczyszczone:
 chromatografia powinowactwa: antygen związany ze zło\
em, białko A
związane ze zło\
em, itp.
 przeciwciała monoklonalne te\
powinny być oczyszczone
2. Nale\
y dobrać właściwie sposób sprzęgania aby zachować własności
przeciwciała.
W niektórych przypadkach modyfikacja chemiczna mo\
e powodować utratę
zdolności do wiązania antygenu!
3. Miejsce wiązania antygenu znajduje się na końcach  ramion Y
 mo\
na wykorzystywać nie tylko całe przeciwciała, ale tak\
e ich
fragmenty: F(ab), F(ab )2...
3
Zapamiętaj podstawowe zasady znakowania przeciwciał
4. Cząsteczki przeciwciał zawierają wiele miejsc nadających się do
sprzęgania
 grupy aminowe i karboksylowe na powierzchni przeciwciał.
ALE!
 rozkład tych grup jest w miarę równomierny  modyfikacji ulegną wszystkie
rejony przeciwciała, co mo\
e zakłócać ich funkcjonowanie!
 grupy sulfhydrylowe
ALE!
 konieczność redukcji wiązań disiarczkowych
5. Koniugacja przeciwciała ze znacznikami z reguły nie powoduje obni\
enia
funkcjonalności przeciwciała, gdy znaczniki są obecne w ograniczonej
ilości i w miejscach wystarczająco odległych od miejsca wiązania
antygenu.
Takie sprzęganie mo\
na uzyskać wykorzystując grupy SH lub reszty
cukrowcowe.
4
Koniugaty przeciwciał z enzymami
Przyłączanie enzymu przez grupy sulfhydrylowe przeciwciał
- Wolne grupy SH z rejonu zawiasu (po redukcji 2-merkaptoetyloaminą)
- Heterobifunkcjonalny związek sieciujący
5
Koniugaty przeciwciał z enzymami
Przyłączanie enzymu przez grupy aminowe przeciwciał
- SATA (N-bursztynoimidylo S-acetylotiooctan)  wprowadzenie  chronionych grup -SH
- Mimo, \
e wiązanie SATA odbywa się na powierzchni całej cząsteczki
przeciwciała, wprowadzenie do 6 cząsteczek SATA nie powoduje obni\
enia zdolności
wiązania antygenu.
6
Koniugaty przeciwciał z enzymami
Znakowanie enzymem fragmentów przeciwciał
7
Koniugaty przeciwciał z enzymami
Znakowanie enzymem fragmentów Fab przeciwciał
Sprzęganie przez wolne grupy -SH fragmentów Fab przeciwciał
(po trawieniu pepsyną)
8
Koniugaty przeciwciał z enzymami
Znakowanie enzymem fragmentów Fab przeciwciał
Sprzęganie przez I-rzędowe grupy aminowe fragmentów Fab przeciwciał
(po trawieniu papainą)
9
Biotynylacja przeciwciał
Biotynylacja przeciwciał przez reszty  SH i grupy aminowe.
Mo\
na przyłączyć wiele reszt biotyny bez upośledzenia funkcji przeciwciała = wiele
miejsc do wiązania streptawidyny lub awidyny.
Przykład: sprzęganie przez I-rzędowe NH2
10
System detekcji LAB
(labelled avidin-biotin system)
System BRAB
(bridged avidin-biotin system)
Wykorzystuje dodatkowe miejsca
wiązania awidyny
1. Biotynylowane przeciwciało
wią\
e się z antygenem
2. Dodanie awidyny
3. Dodanie biotynylowanego enzymu
4. Dodanie substratu  barwny lub
fluorescencyjny produkt
11
System detekcji ABC  najczulszy system z wykorzystaniem enzymów
Tworzy się wysokocząsteczkowy kompleks biotynylowanych przeciwciał i awidyny
Powstały kompleks dodaje się do związanych z antygenami biotynylowanych
przeciwciał.
12
Izotopowe piętnowanie przeciwciał
13
Znakowanie fluorescencyjne przeciwciał
14
Znakowanie przeciwciał toksynami
Do przeciwciała (lub jego fragmentu) mo\
na przyłączyć całą toksynę lub tylko łańcuch
A.
A
ańcuch A jest przyłączony przez związek sieciujący
zawierający wiązanie disiarczkowe.
Przeciwciało pełni rolę łańcucha B  rozpoznaje
i wią\
e się do komórki docelowej.
Koniugat Ig-łańcuch A mo\
e jednak nie
wykazywać takiej samej cytotoksyczności
15
jak koniugat Ig-AB.
Znakowanie przeciwciał toksynami
Przyłączenie toksyny do przeciwciała w oparciu o reakcję wymiany tiol-
disiarczek
16
Znakowanie przeciwciał toksynami
Przyłączenie łańcucha A do przeciwciała w oparciu o reakcję wymiany tiol-
disiarczek
17
Znakowanie cząsteczek lipidów
18
Liposomy
Powszechnie u\
ywane jako makromolekularne przenośniki kosmetyków i
leków, związków do detekcji fluorescencyjnej, peptydów, białek i kwasów
nukleinowych do wnętrza komórki in vivo.
Do powierzchni liposomów mo\
na przyłączyć cząsteczki kierujące liposom
do konkretnego typu komórek.
(Przykład: przyłączenie odpowiednich przeciwciał kieruje liposomy do komórek
nowotworowych)
Kowalencyjne przyłączenie przeciwciał do powierzchni liposomów generuje
doskonałe ogromne kompleksy specyficzne względem danego antygenu.
Kowalencyjne przyłączenie antygenu do powierzchni liposomu daje
doskonałe ogromne kompleksy immunologiczne dla odpowiednich
przeciwciał lub jako przenośnik szczepionek.
19
Morfologia liposomów
Sztuczne struktury
Zbudowane głównie z dwuwarstwy fosfolipidów, wykazujących charakter
amfifilowy. Ponadto mogą zawierać cholesterol i kwasy tłuszczowe.
Organizacja liposomów w środowisku wodnym mo\
e być dość
skomplikowana i zale\
y od:
- składu liposomów
- składu środowiska
- temperatury
20
Przygotowanie liposomów
Mieszanina fosfolipidów w środowisku wodnym będzie spontanicznie
tworzyć struktury liposomów.
Aby uzyskać liposomy o morfologii odpowiedniej do znakowania, konieczne
jest kontrolowanie tego procesu, aby powstały liposomy o odpowiednim
rozmiarze i kształcie.
Metody te obejmują zasadniczo trzy etapy:
1. Rozpuszczenie mieszaniny lipidów w roztworze organicznym
2. Dyspersja w fazie wodnej
3. Frakcjonowanie w celu uzyskania odpowiedniego rozmiaru liposomów.
UWAGA!
Ustalić odpowiedni stosunek składników mieszaniny fosfolipidów
Chronić przed czynnikami utleniającymi i światłem
21
Chemiczne składniki liposomów
Głównymi składnikami liposomów są fosfolipidy. W naturze znane są dwa
typy fosfolipidów:
Pierwszy  fosfolipidy zawierające szkielet glicerolowy oraz
Drugi  pochodne sfingozyny.
Do konstrukcji liposomów najistotniejszy jest pierwszy typ.
22
Fosfolipidy zawierające szkielet glicerolowy
(grupy hydroksylowe zestryfikowane grupami karbolsylowymi kwasów tłuszczowych)
Fosfolipidy  pochodne sfingozyny
23
Reszty kwasów tłuszczowych wchodzących w skład danego
fosfolipidu mogą się znacznie ró\
nić:
 długością łańcucha węglowego (C16-C24)
 stopniem nienasycenia i miejscem występowania wiązań podwójnych.
W związku z tym do konstrukcji liposomów korzystne jest u\
ywanie
syntetycznych fosfolipidów, zawierających zdefiniowane składniki.
Dzięki temu mo\
na przewidzieć dokładnie ich chemiczne własności.
W syntetycznych fosfolipidach u\
ywanych do konstrukcji liposomów
znajdują się trzy rodzaje reszt kwasów tłuszczowych:
1. mirystynowego (C14)
2. palmitynowego (C16)
3. stearynowego (C18)
24
Sfingolipidy
Pochodne sfingozyny, naturalnie występujące w błonach komórkowych.
W niektórych przypadkach obecność sfingolipidów może mieć korzystny wpływ na
integralność błon liposomowych.
Przykład: Sfingomielina może wytwarzać wiązania wodorowe z przyległymi
fosfoglicerydami, zwiększając stabilność liposomu. Ta stabilność może zmniejszać
prawdopodobieństwo utraty zawartości liposomu.
Liposomy zawierające sfingomielinę lub glikolipidy (gangliozydy) wykazują także
dłuższy czas życia in vivo.
Problem: otrzymanie czystych preparatów sfingolipidów jest kosztowne.
25
Cholesterol
W naturalnych błonach komórkowych zawartość cholesterolu wynosi 10-50%
(stosunek molarny).
W liposomach stosuje się 50% udział cholesterolu.
Cholesterol jest sztywnym elementem błon i w znaczący sposób wpływa na
parametry błon:  temperaturę przejść fazowych (\
elowy płynny),
 płynność i przepuszczalność błon.
Cholesterol zwiększa płynność i przepuszczalność błon w temperaturach
poni\
ej punktu tranzycji; w temperaturach powy\
ej punktu tranzycji 
przeciwny efekt.
26
Grupy funkcyjne fosfolipidów
 Głowy fosfolipidów zawierają ugrupowania, które być bezpośrednio
wykorzystane do reakcji sprzęgania lub mogą być zmodyfikowane do
odpowiednich grup funkcyjnych.
Wiele fosfolipidów zawiera grupy aminowe, które mogą być wykorzystane
do reakcji podstawienia nukleofilowego,
np. fosfatydyloseryna, fosfatydyloetanoloamina.
Mogą zawierać grupy karboksylowe,
np. fosfatydyloseryna
W wielu lipidach występują grupy hydroksylowe,
np. fosfatydyloglicerol, fosfatydyloinozytol, glikolipidy.
Najczęściej wykorzystuje się grupę aminową fosfatydyloetanoloaminy.
27
28
Tworzenie koniugatów liposomów z
innymi biocząsteczkami
Lipidy mogą być modyfikowane przed tworzeniem liposomów lub ju\
po ich
utworzeniu.
Strategie:
1. Redukcyjna aminacja  połączenie reszt aldehydowych z aminami.
Grupy aldehydowe mogą być utworzone przez utlenienie grup OH (np.
fosfatydyloglicerolu) pod wpływem nadjodanu.
29
2. Połączenie grupy aminowej z karboksylową za pośrednictwem
karbodiimidu lub aminowej z fosforanową.
3. Strategia wieloetapowa  z wykorzystaniem heterobifunkcjonalnych
związków sieciujących.
Najczęściej stosuje się związki sieciujące zawierające na jednym końcu estry
NHS (gr. aminowe), a na drugim reszty maleimidowe, jodoacetylowe lub
disiarczki pirydylu (-SH).
W przypadku sprzęgania białek, związki sieciujące powinny zawierać długie
ramię łączące ze względu na mo\
liwą zawadę przestrzenną.
Np. u\
ycie krótkiego ramienia w przypadku przyłączania cząsteczek IgG nie
daje dobrych wyników.
30
Modyfikacja fosfolipidów przed utworzeniem liposomów
Fosfatydyloetanoloamina jest najczęściej aktywowana przed formowaniem
liposomów.
Zmodyfikowana fosfatydyloetanoloamina mo\
e być przechowywana, a
następnie mo\
na przetestować ró\
ne proporcje lipidów.
31
Modyfikacja fosfolipidów po utworzeniu liposomów
Uzyskujemy modyfikację wyłącznie zewnętrznych grup funkcyjnych. Takie
postępowanie jest konieczne w sytuacji, gdy substancja zamknięta w
liposomie jest wra\
liwa lub mo\
e przereagować ze związkiem sieciującym.
Przykład 1: Sprzęganie przez reszty aminowe z zastosowaniem związku
sieciującego heterobifunkcyjnego.
32
Przykład 2: Sprzęganie przez reszty aminowe z zastosowaniem związku
sieciującego homobifunkcyjnego.
33
Koniugacja antygenów lub haptenów
z liposomami
Liposomy wykazują in vivo własności adjuwanta  mogą być używane jako nośniki
cząsteczek antygenów lub haptenów w celu uzyskania lepszej odpowiedzi
immunologicznej.
Morfologia liposomów, ich skład lipidowy, ładunek powierzchniowy, cząsteczki związane z
powierzchnią mają wpływ na odpowiedz
immunologiczną.
34
Koniugacja przeciwciał z liposomami
Umożliwia dostarczenie kompleksu w konkretne miejsce w tkance lub roztworze.
W liposomie można zamknąć cząsteczki leku  możliwe zastosowanie w terapii.
ALE! liposomy są ogromne  problem z wędrówką w organizmie. Zastosowanie
ograniczone do systemu retikuloendotelialnego.
Poza tym liposomy uwalniają swoją zawartość na zasadzie endocytozy  nale\
y 35
dopasować wielkość liposomów do rozmiaru pęcherzyków endocytalnych.
Wykorzystanie koniugatów przeciwciał z liposomami
Detekcja antygenów w preparatach
tkankowych.
Umieszczenie w liposomie znacznika
Immunoterapia w oparciu o system
fluorescencyjnego  du\
a czułość
koniugatów przeciwciało-liposom
detekcji.
Liposomy ze znacznikiem
fluorescencyjnym znakowane
przeciwciałami wykorzystuje się tak\
e w
36
cytometrii przepływowej.
Biotynylacja liposomów
37
Wykorzystanie biotynylowanych liposomów
Liposomy zawierające biotynylowane lipidy mogą być wykorzystane do
wzmocnienia sygnału.
W pęcherzyku liposomu mo\
na zawrzeć nawet 105 cząsteczek fluoroforu.
Alternatywnie, mo\
na wykorzystać do detekcji enzym związany z awidyną -
Daje to nawet 100-krotne zwiększenie sygnału w stosunku do klasycznego testu
ELISA.
38
LISA  liposome immunoadsorbent assay
Terminy prezentacji
Prezentacje  znakowanie białek i lipidów
20 listopada  4 prezentacje; tematy 1-4
27 listopada  4 prezentacje; tematy 5-8
4 grudnia  4 prezentacje; tematy 9-12
11 grudnia  2 prezentacje; tematy 13 i 14
Prezentacje  znakowanie kwasów i cukrów
11 grudnia  2 prezentacje; tematy 1 i 2
18 grudnia  4 prezentacje; tematy 3-6
8 stycznia  4 prezentacje; tematy 7-10
15 stycznia  4 prezentacje; tematy 11-14
22 stycznia  tylko prezentacje, które nie uzyskały zaliczenia w
pierwszym terminie
39