Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych metodą GC-MS Chemiczna analiza instrumentalna

CHROMATOGRAFIA GAZOWA ZE SPEKTROMETRIĄ MAS (GC-MS)

Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych

Prowadzący ćwiczenie: dr Anna Sadowska-Rociek

Laboratorium 1.82, I piętro, III segment

Chromatografia gazowa jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych metod instrumentalnych w

chemii analitycznej. Rozdzielenie składników analizowanych metodami chromatograficznymi mieszanin

jest wynikiem różnego ich podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego.

Przy jej pomocy można analizować substancje mające w warunkach analizy postać gazów lub par.

Chromatografia gazowa obejmuje wszystkie metody chromatograficzne, w której fazą ruchomą jest

gaz. W zależności od typu stosowanej fazy nieruchomej (stacjonarnej) wyróżnia się:

• chromatografię adsorpcyjną (fazą nieruchomą jest adsorbent, rozdzielanie polega na różnej

adsorpcji składników próbki przez fazę stacjonarną, jest tzw. chromatografia w układzie gaz-ciało

stałe);

• chromatografię podziałową (fazą nieruchomą jest ciecz, która jest rozpuszczalnikiem dla

rozdzielanych substancji, rozdzielanie polega na podziale składników próbki pomiędzy fazę ciekłą i

gazową, jest to tzw. chromatografia w układzie gaz-ciecz).

Rys.1. Schemat chromatografu gazowego

BUDOWA CHROMATOGRAFU GAZOWEGO

Jako gaz nośny (faza ruchoma) stosuje się najczęściej wodór, azot, argon lub hel. Rodzaj gazu

nośnego ma mały, zwykle pomijalny wpływ na wynik rozdzielania chromatograficznego i jest głównie

uzależniony od rodzaju użytego detektora. Jego czystość ma wpływ na pracę detektora i wypełnienie

kolumn, które może ulegać dezaktywacji. Gaz nośny nie może zawierać zanieczyszczeń, przede

wszystkim tlenu, pary wodnej i węglowodorów.

1

Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych metodą GC-MS Chemiczna analiza instrumentalna

Dozownik (ang. injector)

Jest elementem umożliwiającym wprowadzenie próbki w strumień gazu nośnego, który przenosi ją

do kolumny. Wprowadzona do kolumny próbka musi mieć możliwie najmniejszą objętość. Sposób

wprowadzenia próbki zależy od jej stanu skupienia. Próbki ciekłe dozuje się za pomocą specjalnych

mikrostrzykawek. Próbka powinna odparować lub odsublimować w dozowniku w możliwie jak

najkrótszym czasie. W tym celu temperatura dozownika jest zwykle około 20 oC wyższa od temp.

wrzenia najwyżej wrzącego składnika próbki. Za wysoka temp. dozownika może powodować termiczny

rozkład próbki i pojawienie się na chromatogramie pików produktów tego rozkładu (pików duchów).

Natomiast za niska temp. dozownika powoduje długi czas wprowadzania próbki na kolumnę, co objawia

się pikami rozmytymi, niesymetrycznym lub ich złym rozdziałem.

Próbki ciał stałych wprowadza się przeważnie w postaci ich roztworów. Jeśli nie jest to możliwe,

próbkę wprowadza się specjalną strzykawką do dozowania substancji stałych. Gazy dozuje się bądź to

za pomocą specjalnych strzykawek bądź za pomocą specjalnych zaworów dozujących (popularny jest

tzw. zawór sześciodrożny).

Kolumna chromatograficzna

W kolumnie chromatograficznej zachodzi właściwy proces rozdziału analizowanych mieszanin.

Najczęściej stosowane są kolumny kapilarne i pakowane. Obecnie najpopularniejszymi kolumnami są

kolumny kapilarne tzn. kolumny o średnicy 0,2–0,6 mm i długości do kilkudziesięciu metrów.

Charakteryzują się one dużą zdolnością rozdzielczą. Mają one postać zwoju i wytwarzane są ze szkła

lub topionego kwarcu. W celu zwiększenia wytrzymałości i trwałości mechanicznej kolumny kwarcowe

pokrywa się z zewnątrz warstwą tworzywa sztucznego. Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych

mogą być zarówno adsorbentami, jak i cieczami i są osadzone na ściankach w różny sposób. Dzieli się

je na kolumny z gładkimi ścianami pokrytymi ciekłą fazą stacjonarną (WCOT)- najczęściej stosowane,

kolumny z warstwą porowata na ściankach (PLOT) oraz kolumny na ścianki których naniesiono nośnik

nasycony ciekłą faza stacjonarna (SCOT). Grubość warstwy stacjonarnej wynosi zwykle 0,1-0,3 mm.

Cieńsza warstwa powoduje, że kolumna jest sprawniejsza i krótsze są czasy rozdzielania, grubsza

zapewnia większą pojemność sorpcyjną kolumny. Przy niektórych typach detektorów (GC-MS) kolumny

kapilarne są jedynymi możliwymi do zastosowania.

Kolumny pakowane wypełnia się cząstkami adsorbentu lub nośnika z osadzoną na nim fazą ciekłą.

Cząstki wypełnienia powinny mieć wąski zakres frakcji sitowej i kulisty kształt, gdyż zapewnia to małe

opory przepływu gazu przez kolumnę i małe rozmycie dyfuzyjne. Wypełnienie kolumny oraz własności

wypełnienia (polarność) mają ogromne znaczenie przy rozdziale substancji.

Detektor

Jego rolą jest wykrywane substancji rozdzielonych na kolumnie. Istota działania detektorów

stosowanych w chromatografii gazowej polega na tym, że reagują one na różnice we właściwościach

fizykochemicznych czystego gazu nośnego i gazu zawierającego substancję eluowaną z kolumny.

2

Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych metodą GC-MS Chemiczna analiza instrumentalna

Zadaniem detektora jest przetworzenie stężenia substancji w fazie ruchomej w sygnały elektryczne.

Powstający sygnał często wymaga dodatkowego wzmocnienia. Detektor chromatograficzny powinien

charakteryzować się dużą czułością, niską granicą wykrywalności, dużą stabilnością, dużym zakresem

liniowości wskazań oraz dobrą odtwarzalnością. Poszczególne właściwości detektora nabierają

znaczenia w zależności od wymogów analizy. Niektóre detektory niszczą wykrywane substancje. W

zasadzie każda właściwość fizyczna lub fizykochemiczna substancji różniąca ją od gazu nośnego może

być stosowana jako podstawa detekcji, ograniczenia wynikają z wymagań stawianych detektorom.

Rozróżnia się detektory uniwersalne (do wykrywania wszystkich substancji) i selektywne (do wykrywania

tylko niektórych grup związków, np. halogenopochodnych lub zawierających siarkę).

Liczba typów detektorów znajdujących się dzisiaj w praktycznym użyciu wynosi przeszło 30.

Najczęściej wykorzystuje się następujące detektory:

Detektor płomieniowo-jonizacyjny - FID (ang. flame jonisation detector)

Jest detektorem uniwersalnym, przydatnym do wykrywania prawie każdego związku organicznego.

Ma szczególnie duże znaczenie przy analizie węglowodorów i ich pochodnych. Jego duża czułość,

stabilność oraz uniwersalność powoduje, że jest to najbardziej rozpowszechniony detektor. Do jego

działania potrzebny jest wodór i powietrze. Stosunek natężenia przepływu tych gazów wpływa na jego

czułość i specyficzność. W detektorze spalany jest wodór, przy czym płomień znajduje się między

dwiema elektrodami. Zasada pomiaru polega na zmianie przewodnictwa elektrycznego płomienia

wodoru w polu elektrycznym po wprowadzeniu substancji organicznej. Jeżeli do płomienia kolumny

dochodzi tylko gaz nośny, to wytwarzane są termojony tego gazu, które powodują pojawienie się w

układzie stałego prądu jonowego o bardzo małym natężeniu - prosta linia podstawowa na taśmie

rejestratora. Gdy do płomienia wodorowego wraz z gazem nośnym wprowadza się substancję

wymywaną z kolumny, wówczas jest ona spalana w detektorze i pojawia się większa liczba termojonów.

Tworzenie się termojonów następuje przez rozpad cząsteczek organicznych wychodzących z kolumny i

następujące po nim utlenianie produktów rozpadu tlenem doprowadzonym do płomienia z zewnątrz.

Prąd jonowy wzrasta i po wzmocnieniu zapisywany jest na taśmie w postaci piku przez czas

odpowiadający czasowi spalania się eluowanej substancji.

Detektor wychwytu elektronów - ECD (ang. electron capture detector)

Jest detektorem radiojonizacyjnym, w którym jonizacja analizowanych chromatograficznie

substancji następuje pod wpływem promieniowania jonizującego. Zasada działania tego detektora

polega na zdolności wszystkich substancji (z wyjątkiem gazów szlachetnych) do przyłączania wolnych

elektronów w fazie gazowej. Ta zdolność jest uzależniona od struktury wykrywanego związku i jest

szczególnie duża dla związków zawierających atomy fluorowców.

Cząstka promieniowania jonizującego b, pochodząca z wbudowanego radioaktywnego źródła

promieniowania zawierającego Ni-63, powoduje jonizacje gazu nośnego z uwolnieniem elektronu.

Cząstki b jonizują gaz nośny, przy czym powstają dodatnie jony gazu nośnego i powolne elektrony.

3

Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych metodą GC-MS Chemiczna analiza instrumentalna

N2 + b = N2+ + e-

Wskutek powstawania w tej reakcji elektronów płynie prąd, który jest prądem podstawowym

detektora i na taśmie rejestratora otrzymuje się linie prostą. Jeżeli z kolumny eluowana jest substancja

mająca odpowiednie powinowactwo elektronowe, to wychwytuje ona powolne elektrony, tworząc jony

ujemne: M + e- = M-

Ten proces może zachodzić w połączeniu z dysocjacją lub bez niej. Ujemne jony wykrywanych

substancji rekombinują z dodatnimi jonami gazu nośnego, tworząc obojętne cząsteczki. Przez to zostają

usunięte z układu ostatnie elektrony i prąd zerowy w obecności substancji staje się słabszy - jest to

zapisywane w postaci piku na taśmie rejestratora. Gdy elucja danej substancji z kolumny zostaje

zakończona, natężenie prądu powraca do stanu początkowego - linia zerowa.

Do detektorów selektywnych (oprócz ECD) zaliczamy jeszcze detektor płomieniowo-fotometryczny

(FPD) (związki siarki i fosforu), detektor chemiluminescencyjny - SCD (związki siarki), detektor

termojonowy- TID (związki fosforu, azotu i halogenoorganiczne), detektor emisji atomowe - AED

(zanieczyszczenia środowiska, związki metaloorganiczne i produkty petrochemiczne).

Do detektorów uniwersalnych zaliczamy detektor fotojonizacyjny-PID (może on być również

stosowany jako selektywny), detektor jonizacyjno- wyładowczy.

Jako detektor w chromatografii gazowej bywa także stosowany olfaktometr (sprzężenie GC-O),

który pozwala na informację o stężeniu zapachu pochodzącym od konkretnego związku. Podczas

analizy, próbka wstrzykiwana jest do chromatografu gazowego, gdzie następuje jej rozdzielenie na

poszczególne substancje. Eluat z kolumny po jej opuszczeniu dzielony jest na dwa strumienie: pierwszy

trafia do tradycyjnego detektora (np. MS lub FID), drugi kierowany jest do olfaktometru. Grupa

oceniających ma za zadanie ocenić rodzaj zapachu oraz

oszacować jego intensywność. Wszystkie wskazania

grupy oceniających są rejestrowane (tworzony jest tzw.

aromagram) i następnie porównywane z wynikami

analizy GC-MS lub GC-FID. Porównanie sygnałów z

detektora MS lub FID (pik związku) z informacją z

olfaktometru (rodzaj i intensywność zapachu) pozwala

na ustalenie, które ze zidentyfikowanych związków

Rys.2. Chromatograf gazowy sprzężony z

olfaktometrem

charakteryzują się zapachem, jaki jest jego typ i

natężenie. Technika GC-O wykorzystywana jest do

badań mieszanin gazowych obdarzonych zapachami i znalazła zastosowanie przede wszystkim w

analizie żywności, środków zapachowych oraz próbek środowiskowych.

4

Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych metodą GC-MS Chemiczna analiza instrumentalna

SPEKTOMETRIA MAS

Istota spektrometrii mas polega na otrzymaniu z obojętnych cząsteczek analizowanej próbki

naładowanych cząstek i rozdzieleniu ich według stosunku ich masy do ładunku (m/z).

Schemat spektrometru mas przedstawiony został na Rys. 3.

Analizowaną próbkę wprowadza się do komory jonizacyjnej,

gdzie następuje jonizacja i fragmentacja analizowanych cząsteczek.

Jonizacja polega na oderwaniu od cząsteczki lub atomu jednego lub

kilku elektronów i utworzeniu jonu dodatniego. Jonizacji może

towarzyszyć proces rozpadu tego kationu na różne części

naładowane dodatnio lub obojętnie (fragmentacja). Jonizację

substancji

gazowych

prowadzi

się

najczęściej:

strumieniem

elektronów

emitowanych

przez

rozżarzoną

katodę,

polem

elektrycznym, stosuję się także jonizację chemiczną lub wyładowanie

iskrowe w próżni.

Rozdzielenie powstałych jonów według wartości stosunku m/z

następuje w analizatorach zwanych separatorami mas. Do najczęściej

stosowanych należą: pułapka jonowa, kwadrupol, analizator czasu

przelotu. Rozdzielone jony trafiają następnie do detektora, gdzie są

Rys. 3. Schemat spektrometru mas

rejestrowane. W spektrometrii mas jako detektory stosuje się

najczęściej powielacze elektronów.

Wykres wartości natężeń sygnałów odpowiadających kolejnym

wartościom m/z stanowi widmo masowe substancji, które jest charakterystyczne dla każdego związku.

W widmach masowych na osi x podaje się stosunek masy jonu m do ładunku z, na osi y – natężenie

danego piku m/z.

Spektrometria mas znalazła zastosowanie do określania wyznaczaniu masy molowej i wzoru

sumarycznego oznaczanych związków, do identyfikacji nieznanych substancji oraz do określania

struktury badanych związków organicznych.

Połączenie chromatografii gazowej ze spektrometrią masową (GC-MS) jest najczęściej

spotykanym połączeniem. Obie te metody analityczne bardzo dobrze nadają się do współpracy. Na

podstawie otrzymanego w wyniku rozdzielenia chromatograficznego i widma masowego można

zidentyfikować poszczególne substancje. We współczesnych przyrządach GC-MS prawie wyłącznie

stosuje się kolumny kapilarne. W spektrometrze masowym zachodzi jonizacja cząsteczek rozdzielonych

wcześniej chromatograficznie substancji i ich rozpad na charakterystyczne fragmenty. Charakteryzują

się one właściwym dla nich stosunkiem masy do ładunku (m/z) i są rozdzielane w polu magnetycznym.

Na podstawie chromatografu otrzymanego w wyniku rozdzielenia i widma masowego można

zidentyfikować poszczególne substancje. Najczęściej wykonuje się to przez porównanie widma

masowego zebranego dla analizowanego piku z widmami masowymi znajdującymi się w pamięci

5

Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych metodą GC-MS Chemiczna analiza instrumentalna

komputera. Szybkość rejestracji widm masowych jest tak duża, że podczas rejestracji jednego piku

zwykłym detektorem można zarejestrować wiele widm masowych i stwierdzić np. koelucję dwóch lub

więcej analitów. Wykrywalność i czułość spektrometru masowego jest porównywalna z odpowiednimi

wielkościami dla detektora FID.

ANALIZA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA

Analiza jakościowa

Analiza jakościowa polega na porównaniu położenia piku na chromatogramie, czyli czasu retencji

rozdzielanych na kolumnie substancji z czasem retencji substancji wzorcowych. Czas retencji jest

wielkością stałą dla określonej substancji w danych warunkach chromatografowania (wypełnienie i

rodzaj kolumny, rodzaj i przepływ gazu nośnego oraz program temperaturowy). Wiele substancji może

mieć taki sam czas retencji, identyfikacje należy więc wykonywać na kilku różnych kolumnach,

modyfikując również program temperaturowy. Składniki chromatografowanej mieszaniny można

identyfikować innymi metodami analizy chemicznej lub fizykochemicznej (np. przy pomocy spektrometrii

mas, spektrometrii IR, spektrometrii UV–Vis).

Analiza ilościowa

Analiza jakościowa i ilościowa złożonych mieszanin jest wykonywana w jednym procesie.

O ilości substancji w mieszaninie można wnioskować na podstawie wysokości odpowiadającego jej

piku, gdyż wysokość i powierzchnia piku są proporcjonalne do ilości oznaczanego składnika. Wysokość

piku wykorzystuje się do oznaczeń ilościowych tylko, gdy pik jest symetryczny i wąski. Przy

wykorzystaniu tego parametru piku należy pamiętać, że jest on wrażliwy na czas trwania dozowania

próbki i na małe nawet zmiany prędkości gazu nośnego. Z punktu widzenia otrzymania powtarzalnych

wyników analizy korzystniejsze jest mierzenie powierzchni piku. Istota chromatograficznej analizy

ilościowej polega na porównaniu wielkości piku oznaczanego składnika z wielkością piku odpowiadającą

znanej ilości tego składnika w postaci substancji wzorcowej. Znając trzy wielkości oblicza się czwartą,

szukaną wielkość, tzn. masę lub stężenie oznaczanej substancji w próbce. Analizę ilościową

przeprowadza się metodą wzorca zewnętrznego (kalibracja bezwzględna), wzorca wewnętrznego,

dodatku substancji oznaczanej (wzorca) lub normalizacji wewnętrznej.

PARAMETRY WPŁYWAJĄCE NA ROZDZIAŁ SUBSTANCJI NA KOLUMNIE

CHROMATOGRAFICZNEJ

Znajomość składu próbki pozwala na wybór odpowiedniego detektora oraz kolumny (typu i

wypełnienia). Na rozdział substancji może również wpływać kontrola zmian temperatury w trakcie

procesu chromatografowania, co pozwala na poprawę oraz przyspieszenie tego procesu. Zaletą

chromatografii z programowaniem temperatury jest możliwość rozdziału mieszaniny o szerokim zakresie

6

Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych metodą GC-MS Chemiczna analiza instrumentalna

temperatury wrzenia poszczególnych składników, niezależność detekcji od temperatury wrzenia,

niezależność dokładności oznaczeń od czasu retencji.

Zbyt wysoka temperatura kolumny powoduje zbyt szybkie pojawienie się pików oraz ich

niecałkowite rozdzielenie. Natomiast zbyt niska temperatura pracy kolumny powoduje wydłużenie czasu

analizy, wyżej wrzące substancje pojawiają się w postaci rozmytych, płaskich pików.

W

typowych

aparatach

istnieje

możliwość

zaprogramowania sekwencji kilku liniowych odcinków

narostu temperatury, z zadawanym współczynnikiem

szybkości zmian. Postępując w ten sposób, można

dobrać niską początkową temperaturę, odpowiednią do

rozdzielenia niskowrzących składników, a końcową

temperaturę - dostatecznie wysoką, aby można było

wyeluować wszystkie składniki próbki w racjonalnym

czasie. Zalety pracy z programowaną temperaturą

kolumny pokazano na Rys. 4.

Rys. 4. Chromatograf mieszaniny wykonany: a) w warunkach izotermicznych (temp. 60°C); b) w warunkach

programowania temperatury

ZWIĄZKI ZAPACHOWE W śYWNOŚCI – terpeny

Terpeny są składnikiem większości roślinnych substancji zapachowych: owoców cytrusowych, ziół,

przypraw, wchodzą w skład tzw. olejków eterycznych. Pomarańcze, grejpfruty, mandarynki, cytryny

zawierają powyżej 3% olejków eterycznych.

Terpeny składają się z jednostek izoprenowych, najczęściej spotykane są monoterpeny i

seskwiterpeny o 10 lub 15 atomach węgla. Ich tlenowe pochodne (aldehydy, ketony, estry i kwasy)

również obdarzone są silnym zapachem. Izomery stereochemiczne terpenów mogą mieć różne zapachy,

np. karwon.

O

O

limonen

α-pinen

β-pinen

kamfen

zapach cytrusów

zapach leśny

zapach sosnowy zapach kamfory (+)-karwon

(–)-karwon

p-cymen

zapach kminku zapach mięty zapach tymianku

Terpeny zawarte w olejkach eterycznych otrzymuje się najczęściej poprzez wytłaczanie, ekstrakcję

odpowiednim rozpuszczalnikiem organicznym lub destylację z parą wodną. Olejki eteryczne wytwarzane

z owoców cytrusowych zawierają głównie D-limonen, aldehydy, estry, alkohole i seskwiterpeny. Olejki

stosowane są jako środki aromatyzujące w przemyśle spożywczym (np. aromaty do ciast).

7

Analiza składu olejków eterycznych i aromatów spożywczych metodą GC-MS Chemiczna analiza instrumentalna

ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA:

• Zasada rozdziału chromatograficznego, podstawowe pojęcia i wielkości w chromatografii

• Budowa i zasada działania chromatografu gazowego; sposoby dozowania, podział kolumn i

detektorów; przykłady

• Analiza jakościowa i ilościowa w GC

• Spektrometria mas (MS) – podstawy teoretyczne, elementy składowe spektrometru i ich rola

• Przykłady zastosowań chromatografii gazowej oraz spektrometrii mas w analizie żywności

• Substancje zapachowe w żywności.

WYKONANIE ĆWICZENIA:

1.

Sporządzić roztwór wzorcowy mieszaniny terpenów o stężeniu podanym przez prowadzącą

ćwiczenie.

2.

Wykonać analizę chromatograficzną roztworu wzorcowego.

3.

Sporządzić roztwory rozcieńczone: olejku cytrynowego, pomarańczowego, aromatu cytrynowego

oraz pomarańczowego w heksanie. Proporcje zostaną podane przez prowadzącą ćwiczenie.

4.

Na tarce zetrzeć skórki z cytryny i pomarańczy. Zalać odpowiednią ilością heksanu, wytrząsać.

5.

Wykonać analizy chromatograficzne sporządzonych ekstraktów próbek w trybie full scan oraz SIM.

LITERATURA POMOCNICZA:

1. Szczepaniak W.: Metody instrumentalne w analizie chemicznej. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa 2007.

2. Grabowska J.: Substancje zapachowe w żywności. [w:] Chemia żywności. Praca zbiorowa pod red.

Z. Sikorskiego, WNT, Warszawa 2007.

Inne materiały dotyczące chromatografii gazowej, spektrometrii mas oraz związków zapachowych w

żywności

8