Izotachoforeza
Materiały do ćwiczeń
dr in\
. Janusz Curyło, mgr in\
. Tomasz Chmiel, mgr in\
. Tomasz Dymerski,
prof. dr hab. in\
. Waldemar Wardencki
Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska 2009
Izotachoforeza
Etymologia słowa izotachoforeza
słowo izotachoforeza pochodzi z języka greckiego:
iso = równy, tachos = szybkość, phoresis = migracja
Izotachoforeza zaliczana jest do analitycznych technik elektromigracyjnych, w których.
ruch analizowanych cząsteczek wywołany jest przyło\
onym zewnętrznym polem elektrycznym.
Szybkość poruszania się jonów w polu elektrycznym (elektromigracja) jest wprost proporcjonalna
do natÄ™\
enia tego pola.
Podstawowe ró\
nice pomiędzy elektroforezą kapilarną (CE) a izotachoforezą (ITP) tkwią
w sposobie realizacji rozdzielania substancji w polu elektrycznym. W CE stosowany jest jeden
elektrolit (BGE) wypełniający cały układ analityczny. Elektrolit ten zawiera poza jonami
dającymi sygnał linii podstawowej, substancje modyfikujące przepływ elektroosmotyczny jonów,
pH roztworu oraz stabilizator siły jonowej.
ITP wykorzystuje dwa ró\
ne układy buforowe. Próbkę umieszcza się pomiędzy
elektrolitem wiodącym (LE - leading electrolyte) o większej ruchliwości od jonów próbki i
terminującym (TE - terminating electrolyte) o mniejszej ruchliwości od jonów próbki.
Izotachoforezą nazywamy proces rozdzielania jonów (kationów lub anionów), które w
polu elektrycznym przy zastosowaniu odpowiedniego elektrolitu wiodącego i kończącego
formują się w strefy według ich zmniejszającej się ruchliwości i poruszają z jednakową
prędkością.
Zasada izotachoforezy
Podczas jednorazowej analizy techniką izotachoforezy mogą być rozdzielane tylko jony o
tym samym znaku (kationy lub aniony). Elektrolit podstawowy dobiera się w taki sposób aby
kation lub anion elektrolitu wiodącego (L) i terminującego(T) miał odpowiednio najwy\
szÄ… i
najni\
szÄ… ruchliwość (µ) w stosunku do analitów (oznaczanych jonów). Tak wiÄ™c wymogiem
rozdzielania metodÄ… izotachoforezy jest aby µL>µanality>µT.
W przypadku przeprowadzania izotachoforetycznego rozdzielania anionów postępuje się
następująco: przestrzeń anodową i kapilarę napełnia się elektrolitem wiodącym, którego anion
jest bardzo ruchliwy, kation zaÅ› posiada du\
ą pojemność buforową. Przestrzeń katodowa powinna
zawierać elektrolit, którego anion ma efektywną ruchliwość du\
o ni\
szą od ruchliwości
wszystkich składników analizowanej próbki. Elektrolit nazywa się elektrolitem zatrzymującym,
(terminującym), a jego jon terminatorem. Próbkę wprowadza się przez dozownik pomiędzy
elektrolit wiodący i elektrolit terminujący. Następnie do elektrod przykłada się odpowiednie
napięcie, w wyniku czego przepływa prąd. W układzie takim wprowadzone jony po niedługim
czasie układają się w szereg sąsiadujących ze sobą stref wg malejącej ruchliwości, po czym
całość wędruje z jednakową prędkością do odpowiedniej elektrody.
Przebieg procesu rozdzielania przedstawia rysunek rys. 1. Górna część rysunku (a)
przedstawia elektrolit wiodÄ…cy (L), wprowadzonÄ… próbkÄ™ (aniony A i B, dla których µA>µB) i
elektrolit terminujący (T). Na odciętej odło\
one jest poło\
enie wewnątrz kapilary, a na rzędnej 
stÄ™\
enia składników. Kolejne fragmenty rysunku obrazują stan rozdzielenia w następujących po
sobie przedziałach czasowych. Fragment (b) przedstawia strefę elektrolitu wiodącego
przesuwajÄ…cÄ… siÄ™ przez kapilarÄ™ w kierunku przestrzeni anodowej. StÄ™\
enie składnika B ustala się
na wartość, która zgodnie z prawem Kohlrauscha odpowiada stę\
eniu elektrolitu wiodÄ…cego.
µB + µQ
cA µ
A
= Å"
cB µ + µQ µQ , gdzie
A
µA, µB, µQ  odpowiednio ruchliwoÅ›ci jonów A-, B- i przeciwjonu Q+, cA, cB  odpowiednio
stÄ™\
enia jonów A-, B-.
Trzecia część rysunku (c) obrazuje dalszy stan rozdzielenia. Strefa  czystego składnika A
znacznie się zwiększa i dalej powstaje strefa czystego składnika B o stę\
eniu odpowiadajÄ…cym
poprzedzajÄ…cej strefie.
W ostatnim etapie rozdzielania (d) ustala się stan równowagi stę\
eń jonów w
poszczególnych strefach. W ten sposób ka\
dÄ… strefÄ™ wewnÄ…trz kapilary tworzy jeden rodzaj
jonów, a stę\
enia w strefach pozostają w równowadze zarówno ze strefą poprzedzającą jak i ze
strefÄ… elektrolitu wiodÄ…cego. StÄ™\
enie w strefie elektrolitu terminującego równie\
powinno być
stałe. W idealnych warunkach prowadzenia pomiaru (niezmienna średnica kapilary, stały poziom
elektrolitu wiodącego) długości poszczególnych stref są ju\
dalej niezmienne. Strefy po
osiągnięciu równowagi poruszają się ze stałą szybkością równą szybkości poruszania się strefy
wiodącej i stąd nazwa izotachoforeza, czyli elektroforeza przy stałym poruszaniu się stref.
Rys. 1. Hipotetyczny model rozdzielania dwóch jonów metodą izotachoforezy.
W praktyce opisany proces bywa zakłócany. Dochodzi bowiem do przesuwania się stref, z
dość zdawałoby się błahych powodów, np. zmian pH wskutek reakcji elektrodowych czy
membranowych, zmian temperatury, przenikania CO2 przez teflonowe ścianki kapilary,
elektroosmozy czy wskutek powstawania strumienia hydrodynamicznego.
Ze względu na to, \
e wszystkie strefy posiadają ró\
ne efektywne ruchliwości jonów, w
ka\
dej z nich wytwarza się własny gradient potencjału. Dzieję się tak, poniewa\
zjawisko
izotachoforezy opiera się na najbardziej podstawowym prawie mówiącym o przepływie ładunków
przez dany ośrodek, a mianowicie na prawie Ohma.
U
R = , gdzie:
I
R  opór elektryczny ośrodka przewodzącego [&!], U  napięcie elektryczne (ró\
nica
potencjałów) [V], I  natę\
enie przepływu ładunków [A]
Proces izotachoforezy prowadzony jest przy stałym natę\
eniu ładunków elektrycznych, a ka\
da
poruszająca się z jednakową prędkością strefa posiada charakterystyczny dla niej opór
przenoszenia danych jonów, wynikający np. z ró\
nej budowy przestrzennej. Ustala się wówczas
jednakowa szybkość poruszania się stref zgodnie z zale\
nością:
½ = µ Å" E
, gdzie:
îÅ‚ Å‚Å‚
cm cm2
îÅ‚ Å‚Å‚
½  szybkość poruszania siÄ™ strefy , µ  efektywna ruchliwość jonów w strefie ,
ïÅ‚V Å" s śł
ïÅ‚ śł
s
ðÅ‚ ûÅ‚
ðÅ‚ ûÅ‚
V
îÅ‚ Å‚Å‚
E  natÄ™\
ęnie pola elektrycznego w strefie
ïÅ‚cmśł
ðÅ‚ ûÅ‚
Rys.2. Model rozdzielania anionów (A, B, C,) metodą izotachoforezy, temperatura (T), natę\
enie
pola elektrycznego (E) i opór w poszczególnych strefach (R), Q  przeciwjon.
Gradient potencjału w ka\
dej pojedynczej strefie jest stały, ale wzrasta od jednej strefy do
drugiej. Przyrost gradientu potencjału wynika ze zmniejszających się ruchliwości jonów w
kolejnych strefach, zmniejszania siÄ™ przewodnictwa tych stref (wzrostu oporu) oraz ze zmiany
stÄ™\
enia danego jonu w rozpatrywanej strefie (rys. 2). Granice wytworzonych stref sÄ… niezwykle
ostre, a to z powodu efektu samokorygowania się układu izotachoforetycznego (rys. 3). Je\
eli
wolniejszy jon A przeniknÄ…Å‚by do szybszej strefy L (tzn. o wy\
szej ruchliwości jonów) musiałby
się w niej poruszać wolniej, gdy\
w strefie tej spadek potencjału jest ni\
szy ni\
w strefie A, więc
ruchliwość jonu A musiałaby być wy\
sza ni\
jest faktycznie  i w tej sytuacji jon A
automatycznie wraca do swojej strefy. Z drugiej strony, je\
eli jon L dostałby się drogą dyfuzji do
następującej po niej strefy A, byłby on przeniesiony do strefy L na skutek wy\
szego gradientu
potencjału, jaki panuje w strefie A.
Rys. 3. Efekt samokorygowania się układu izotachoforetycznego.
Gdy w procesie analizy utrzymywany jest stały prąd, w wyniku istnienia ró\
nych
gradientów potencjału poszczególnych stref, wytwarzają się w nich ró\
ne temperatury. Strefy
posiadające jony o wysokich ruchliwościach wytwarzają mniejsze ilości ciepła ni\
strefy o
ruchliwościach ni\
szych. Poniewa\
następujące po sobie strefy porządkują się z ich
zmniejszającymi się ruchliwościami, temperatura następujących po sobie stref wzrasta od jednej
do drugiej strefy (rys. 2).
Detekcja
W technice izotachoforetycznej stosować mo\
na zarówno detekcję bezkontaktową i
kontaktowÄ….
Gdy do kapilary przyło\
ymy termoelement z odpowiednio cienkich drutów, ich zmiany
sygnałów będą charakteryzowały poszczególne strefy. Zró\
niczkowanie tych sygnałów pozwala
określić granice stref. Wysokość fali (h) podaje informację o rodzaju jonów, a długość strefy (L)
mówi o ilości jonu zawartej w próbce (rys. 5). Jest to tzw. bezkontaktowy sposób detekcji.
Detekcja taka jest uniwersalna, ale mało selektywna. Czułość detekcji mo\
na zwiększyć
wydłu\
ajÄ…c strefy przez zwÄ™\
enie kapilary. Termodetektory wykrywają z powodzeniem ilości
zwiÄ…zków siÄ™gajÄ…ce rzÄ™du kilku µg w próbce. Innym rodzajem detekcji bezkontaktowej
stosowanym w izotachoforezie, jest detekcja optyczna oparta na pomiarze absorpcji światła w
poszczególnych strefach. Detektory optyczne wykazują du\
o lepszą zdolność wykrywania
krótkich stref a tak\
e majÄ… zadawalajÄ…ce parametry dynamiczne. Detektory UV nie sÄ…
uniwersalne, gdy\
mogą być stosowane jedynie wtedy, dana substancja wykazuje absorpcję
światła w zakresie UV. W izotachoforezie analitycznej, układ detekcyjny powinien wykrywać
mo\
liwie jak najkrótsze strefy rozdzielanych jonów, tzn. powinien posiadać wysoką czułość i
zdolność rozdzielczą. Ponadto powinien wykrywać kolejne składniki na podstawie jakiejś
uniwersalnej właściwości stref. Układ detekcyjny powinien być zdolny do rozró\
niania stref,
nawet gdy zachodzi tylko nieznaczna ró\
nica danej właściwości. Powinien równie\
wytwarzać
szybką i prawidłową odpowiedz
zarówno co do jakości, jak i co do ilości poszczególnych jonów.
Te warunki spełniają detektory kontaktowe. Dostępne obecnie detektory kontaktowe posiadają
elektrody zanurzone wewnÄ…trz kapilary i tak\
e istniejÄ… w dwu typach. Typ pierwszy mierzy
przewodnictwo stref, drugi polega na bezpośrednim pomiarze gradientów elektrycznych w
poszczególnych strefach. Za pomocą detektora konduktometrycznego mo\
na wykryć 50 krotnie
mniejszą ilość substancji w porównaniu z detektorem termometrycznym. Równie\
rozpiętość
stÄ™\
eń składników w próbce mo\
e być znacznie większa, a uzyskany izotachoforegram
charakteryzuje siÄ™ bardzo ostrymi i wyraz
nymi stopniami.
Rys. 4. Detektory stosowane w izotachoforezie.
Inny typ detekcji kontaktowej wykorzystuje bezpośredni pomiar gradientu elektrycznego w
strefach. Detekcja przeprowadzana jest bezpośrednio w kapilarze, poprzez pomiar spadku
napięcia pomiędzy dwiema niskooporowymi elektrodami, które są umieszczone w niewielkiej od
siebie odległości w kierunku, w którym zachodzi ruch stref. Dzięki temu, \
e mierzona wartość
prądu jest bardzo mała eliminowana jest całkowicie polaryzacja i depolaryzacja elektrod.
Parametry dynamiczne takiego detektora sÄ… zadawalajÄ…ce nawet przy szybkiej
wysokonapięciowej analizie izotachoforetycznej. Rysunek 4 przedstawia schematy detektorów
stosowanych w izotachoforezie.
Dobór parametrów pracy
W procesie analizy izotachoforetycznej jony mo\
na rozdzielić wtedy, gdy efektywne
ruchliwości kolejnych składników ró\
nią się od siebie w wystarczający sposób. Efektywna
ruchliwość jonów zale\
y od stopnia dysocjacji i wartości pK, a dodatkowo od temperatury i
wartości pH, jakie wytwarzają się w poszczególnych strefach podczas przebiegu procesu. Na
efektywną ruchliwość jonów wpływają, choć w znacznie mniejszym stopniu takie czynniki jak
solwatacja, efekt relaksacji, promień i ładunek jonów, stała dielektryczna oraz lepkość u\
ytych
rozpuszczalników. Rozdzielanie jonów mo\
na przeprowadzić ró\
nymi sposobami.:
- na zasadzie ró\
nic w absolutnych ruchliwościach jonowych, wartość pH układu dobiera
się tak, aby wszystkie jony były całkowicie zdysocjowane.
- wykorzystując ró\
nice w wartościach pK składników, wartość pH układu dobiera się w
taki sposób, aby większość jonów nie była całkowicie zdysocjowana, a tym samym
powiększa się ró\
nice w wartościach efektywnych ruchliwości jonów.
- stosując zmianę rozpuszczalnika, zwykle z wody na metanol. Sposób ten bywa stosowany,
je\
eli rozdzielane jony posiadają prawie jednakowe ruchliwości jonowe i niewiele
ró\
niące się od siebie wartości pK
- wykorzystujÄ…c mo\
liwość tworzenia przez rozdzielane jony związków kompleksowych z
jonami elektrolitu wiodÄ…cego.
Na właściwy przebieg separacji izotachoforetycznej decydujący wpływ ma wielkość pH, w
układzie. Dobór odpowiedniego pH jest jednak rzeczą trudną. Wartość pH stref w du\
ym stopniu
zale\
y od wartości pK jonów buforowych oraz jonów próbki. Przy rozdzielaniu silnych kwasów
pH jest prawie równe pK1, jednak dla słabych kwasów następują du\
e przesunięcia spowodowane
liczÄ…cymi siÄ™ ju\
wartościami innych stałych dysocjacji. Kiedy pH strefy jest ni\
sze od pH strefy
poprzedzającej, efektywna ruchliwość jonów, które pozostaną w tyle, wzrośnie i z biegiem czasu
strefy wydłu\
ają się i powstają strefy mieszane. Wartość pH układu mo\
e być tak dobrana, \
e
jony w danej strefie będą posiadały ruchliwość wy\
szÄ… ni\
ruchliwość efektywna jonu wiodącego.
Trudno jest zachować warunki izotachoforetyczne przy niskich wartościach pH w przypadku
rozdzielania kationów i wysokich, w przypadku rozdzielania anionów. Spowodowane jest to tym,
\
e pH przy rozdziałach anionów wzrasta, podczas przebiegu procesu, a zmniejsza się przy
rozdziałach kationów. Efekty te dotyczą głównie substancji słabo zdysocjowanych.
Utrzymywanie stałego pH jest szczególnie wa\
ne przy separacji słabych kwasów i zasad.
W procesie analizy po wprowadzeniu próbki oraz rozdzieleniu jonów otrzymuje się szereg
stref, z których ka\
da powinna zawierać jeden rodzaj jonów. Wyró\
nia siÄ™ jednak dwa rodzaje
granic rozdzielenia: granicę pomiędzy jonem wiodącym oraz strefą z jonami M+, w której
występują dodatkowo jony H+ (próbka została wprowadzona do elektrolitu wiodącego) i drugi typ
granicy między rozdzielanymi jonami M1+-M2+, M2+-M3+, itd.
W tej sytuacji pierwszy, najruchliwszy kation próbki tworzy strefę mieszaną z jonami H+,
które są w strefie elektrolitu wiodącego i kationu M+ - i warunek izotachoforezy przestaje
obowiązywać. Prędkość tej strefy zmniejsza się, wysokość stopni równie\
, a to z powodu
obecności jonów H+. Je\
eli stÄ™\
enie jonów H+ jest małe, to oczywiście efekt jest niewielki.
Mo\
liwe jest te\
istnienie dwu stref mieszanych w pobli\
u siebie, obu składających się z
kationów próbki oraz z jonów wodorowych. Wtedy decydujący wpływ na prawidłowe
rozdzielanie izotachoforetyczne ma wartość pH poszczególnych stref. Je\
eli pH drugiego kationu
jest niskie, jony wodorowe będą przechodziły do poprzedzających je stref i powstawać będą
strefy mieszane.
Generalnie, nie zaleca się pracy metodą izotachoforezy w układach elektrolitów
niebuforowanych, gdy\
konieczne jest wtedy regularne odnawianie roztworów elektrodowych, a
oprócz tego istnieje ciągłe zagro\
enie występowania stref mieszanych.
Układy stosowane w procesie rozdzielania kationów:
Jon wiodÄ…cy Przeciwjon pH Jon zatrzymujÄ…cy
0,01 M HNO3  1,9 0,01 M TRIS
0,01 M HCl  2,0 0,01 M LiCl
0,01 M k. sulfonowy HCl 2,4 0,01 M LiCl
0,002 M H6L  2,4 0,004 kreatynina
0,02 KOH k. octowy 4,1 0,005 k. octowy
0,01 M KOH k. askorbinowy 4,1 0,01 M LiCl
0,01 M KOH k. fumarowy 4,3 0,01 M Li2SO4
0,005  0,01 M CH3COOK k. octowy 4,0  5,5 0,01 M TRIS lub ²-alanina
0,005  0,01 M KOH k. kakodylowy 6,3  7,0 0,01 M kreatynina z dodatkiem 0,005 M HCl do pH 5
0,01 M KOH dijodotyrozyna 7,4 0,01 M TRIS
0,0075 H2SO4  8,0 0,005 BTP z dodatkiem 0,01 M k. kapronowego
0,01 KOH H3BO3 8,3 0,01 cytrynian litu
0,005 M Ba(OH)2 glutamina 9,25 0,02 M trietylenodiamina
0,005 M Ba(OH)2 0,015 M walina 9,9 0,02 M TRIS z dodatkiem HCl do pH 8,3
Układy stosowane w procesie rozdzielania anionów:
Jon wiodÄ…cy Przeciwjon pH Jon zatrzymujÄ…cy
0,005 M HCl 0,001 M NaCl 2,25 0,005 M k. bursztynowy lub 0,01 M k. mrówkowy
0,007 M HCl gliceryno-glicyna 2,9 0,005 M k. kapronowy
0,01 HCl ²- alanina 2,9 0,005 M propionian sodu
0,008 HCl 0,0035 M ²- alanina 3,55 0,005 M k. cytrynowy
0,01 HCl 0,01 M ²- alanina 3,6 0,003 M BTP + 0,05 % HPMC
0,005  0,01 M HCl ²- alanina 3,0  4,2 0,01 M k. kapronowy
0,002 M HCl 0,005 M EACA 4,25 0,002 M kwas winowy
K. µ-aminokapronowy lub
0,01 M HCl 4,5  4,7 0,01 M MES z dodatkiem TRIS do pH 7
histydyna
0,01 M HCl BTP 6,0 0,005 M k. kapronowy z dodatkiem TRIS do pH 8
0,01 M HCl histydyna 6,0 0,005 M MES + histydyna
0,01 M HCl 0,0056 M BTP 6,1 0,005 M MES lub 0,005 M k.kapronowy
0,01 M k. kakodylowy lub k. kapronowy lub
0,01 M HCl histydyna 5,7  7,0
k. fenylooctowy lub MES
0,005 M glicyna z dodatkiem TRIS do pH 8,5 i
0,005 M k. glutaminowy TRIS 7,2
Ba(OH)2 do pH 9,2
0,01 M HCl imidazol 7,4 0,005 k. askorbinowy
0,005 M gliceryno-glicyna TRIS 8,4 0,01 M glicyna, Ba(OH)2, pH 9
0,01 M HCl TRIS 8,5 0,01 M EPPS z TRIS, pH 8,5
0,005  0,01 M HCl ammediol 8,4  9,6 0,005  0,010 M glicyna lub fenol lub ²- alanina
EACA  kwas µ-aminokapronowy
BTP  bis-tris-propan
TRIS  kwas N-tris(hydroksymetylo)-metylo-2-aminoetylosulfonowy
MES  kwas 2-N(morpholino)-etylosulfonowy
HPMC  hydroksypropylometyloceluloza
EPPS  kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-propanosulfonowy
Analiza jakościowa i ilościowa
Wynikiem analizy izotachoforetycznej jest wykres przedstawiający zmiany wartości
sygnału detektora w czasie  izotachoforegram. Rysunek 5 przedstawia przykładowy
izotachoforegram mieszaniny kationów uzyskany przy pomocy detektora konduktometrycznego.
Aby dokonać analizy jakościowej nieznanej próbki na podstawie uzyskanego
izotachoforegramu nale\
y zidentyfikować poszczególne strefy odpowiadające szukanym
analitom. Na podstawie wysokości (h) stref w stosunku do linii podstawowej (RSH  relative step
height, RSH = h/H) i przez porównanie z wzorcami analitów mo\
liwe jest przeprowadzenie
analizy jakościowej.
W oparciu o długość (L) zidentyfikowanych stref i na podstawie wcześniej sporządzonych
krzywych kalibracyjnych mo\
emy dokonać analizy ilościowej badanych związków w próbce.
Ogólnie mówiąc wartość sygnału detektora dla danej strefy (wysokość strefy  h) jest
informacją jakościową, a długość strefy (L) jest informacją ilościową.
Rys. 5. Przykładowy izotachoforegram mieszaniny kationów, uzyskany za pomocą detektora
konduktometrycznego.
Zalety izotachoforezy:
mo\
liwość jednoczesnego oznaczania wielu jonów (o tym samym znaku)
jednoczesne oznaczanie jonów na ró\
nych poziomach stÄ™\
eń
mo\
liwość oznaczenia składników śladowych w zło\
onych matrycach dzięki
zastosowaniu dwóch kolumn  preseparacyjnej i analitycznej,
proste i szybkie przygotowanie próbek (z reguły wystarcza sączenie; w przypadku
próbek takich jak woda pitna nie ma konieczności przygotowania)
krótki czas analizy (od kilku do kilkunastu minut)
ogólnie dostępne odczynniki
stosunkowy niski koszt aparatury (strzykawki, ogólnie dostępny sprzęt laboratoryjny 
kolby, zlewki, pipety, itp.; koszt samego urzÄ…dzenia jest ok. 5 razy ni\
szy ni\

chromatografu jonowego)
mo\
liwość stosowanie uniwersalnego detektora (konduktometrycznego)
wysoka powtarzalność i dokładność wyników analizy
niska granica wykrywalności i oznaczalności  standardowo poni\
ej ppm, a przy
zastosowaniu odpowiednich metod wzbogacania próbek (np. sorpcja metali cię\
kich
zawartych w wodzie) rzędu ppb,
podczas procesu separacji jonów z rozcieńczonych próbek dochodzi do ich wzbogacenia
technika przyjazna środowisku  analizuje się głównie próbki wodne (dopuszczalny jest
dodatek metanolu lub etanolu, np. w przypadku próbek alkoholi)
Ograniczenia izotachoforezy:
trudności przy doborze składu elektrolitów (np. dodatku antykonwekcyjnego, buforu)
brak mo\
liwości stosowania rozpuszczalników organicznych  ograniczenie
zastosowania izotachoforezy np. do próbek olejów, tłuszczów itp.
w przypadku oznaczania wybranych związków organicznych (np. aldehydów)
konieczna jest derywatyzacja analitów
konieczność stosowania roztworów wzorcowych
mo\
liwość oznaczania wyłącznie substancji jonowych
Zastosowanie izotachoforezy w ró\
nych dziedzinach \
ycia
Ò! PrzemysÅ‚ spo\
ywczy:
1. Soki i syropy owocowe: jednoczesne oznaczanie kwasu sorbowego i cytrynowego,
oznaczanie kwasów: benzoesowego, askorbinowego i dehydroaskorbinowego, aniony
nieorganiczne, np. PO43-, związki pierścieniowe i sacharyna, oznaczanie kationów K+, Na+,
Ca2+ i Mg2+ w sokach pomarańczowych.
2. Wino: równocześnie oznaczanie kwasów (malonowego, winowego, bursztynowego,
cytrynowego, mlekowego, octowego) oraz jonów siarczanowych.
3. Piwo: oznaczanie zawartości dodatków np. konserwantów, oznaczanie kwasu askorbinowego
i dehydroaskorbinowego.
4. Herbata i kawa: oznaczanie zawartości kwasów
5. Mleko i produkty mleczarskie: kontrola procesu fermentacji (oznaczanie zawartości kwasu
mlekowego, octowego, masłowego), oznaczanie zawartość NO3-.
6. Cukier i melasa: badanie zawartości kwasów po procesie utleniania cukru, oznaczanie
pozostałości kwasów (głównie lotnych kwasów tłuszczowych) w melasach.
7. Mięso, zupy, ryby, majonezy: oznaczanie EDTA w sałatkach, majonezach, margarynach,
oznaczanie zawartości kwasu glutaminowego i innych dodatków (np. 5-monofosforanu
guanozyny) w mięsach i zupach, zawartość histaminy w rybach i konserwach rybnych
(informacja o czasie przechowywania).
8. Warzywa i owoce: oznaczanie zawartości kwasów, np.: szczawiowego, octowego,
malonowego, cytrynowego, a tak\
e jonów nieorganicznych takich jak: NO3-, oznaczanie
zawartości kwasu fitowego w zbo\
ach i roślinach strączkowych, oznaczanie toksyn (np. ą-
solaniny) w ziemniakach.
9. Oznaczanie zawartości amin biogenicznych (histaminy, kadaweryny, putrescyny, tyraminy)
w wybranych produktach spo\
ywczych np. serach, rybach, kapuście, winach.
Ò! Rolnictwo:
1. Nawozy: jednoczesne oznaczenie zawartości SO42-, NO3- i PO43-, równoczesne oznaczenie
ró\
nych postaci fosforu np. P2O74-, PO43-.
2. Kiszonki: oznaczanie związków wpływających na jakość produktów  głównie kwas
mlekowy, octowy, propionowy, masłowy.
3. Pasza: określanie czystości lizyny, oznaczanie zawartości substancji pomocniczych
biofaktorów (B1, B6, lizyna oraz inne).
4. Mleko i inne produkty nabiałowe: związki jonotwórcze o zawartości powy\
ej 1 ml/l, kontrola
procesu fermentacji (oznaczanie kwasu mlekowego, octowego, masłowego, cytrynowego,
fosforowego), kontrola poziomu NO3-.
5. Herbicydy anionowe i kationowe: oznaczanie ich zawartości w środkach ochrony roślin
(testowanie czystości), kontrola ich stę\
enia w wodzach, glebach, mleku i ekstraktach z
materiału roślinnego.
6. Materiał roślinny: jednoczesne oznaczenie zawartości SO42-, NO2-, NO3- i PO43-.
7. Materiał weterynaryjny: oznaczanie kwasu mlekowego, octowego, itp. w celu potwierdzenia
prawidłowości działania metabolizmu, analiza związków jonotwórczych we krwi, moczu,
wyciągu mięśniowym.
Ò! Medycyna:
1. Analiza kwasów i zasad organicznych oraz aminokwasów w moczu: kwas tioacetylooctowy
po inhalacji chlorkiem winylu, kwas hipurowy i jego pochodne po inhalacji
rozpuszczalnikami organicznymi, kwas szczawiowy.
2. Analiza kwasów i zasad organicznych oraz aminokwasów we krwi: kwas mrówkowy w
przypadkach kwasicy, kwas sialowy jako niespecyficzny objaw choroby nowotworowej, a
tak\
e inne kwasy: ketoglutarowy, szczawiooctowy, hydroksymasłowy.
3. Oznaczanie zawartości metabolitów leków we krwi, moczu lub innych płynach ustrojowych
przy stÄ™\
eniach rzędu 1-10 ppm bez konieczności wstępnego przygotowania próbki.
4. Analiza kwasów i zasad organicznych oraz aminokwasów w płynach ustrojowych: GABA
(kwas ł-aminomasłowy) w płynie mózgowo-rdzeniowym.
Ò! Analiza wód:
1. Oznaczanie anionów nieorganicznych w wodach powierzchniowych (Cl-, SO42-, NO3-, NO2-,
F-, PO43-)
2. Analiza kwaśnych deszczy: równoczesne oznaczanie SO42- i NO3- w wodzie deszczowej.
3. Oznaczanie kationów metali alkalicznych i kationów metali ziem alkalicznych w próbkach
wody (pitnej, mineralnej, deszczowej).
4. Oznaczanie metali ciÄ™\
kich w wodach: Mn2+, Cd2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Pb2+, Cu2+, Al3+
(stÄ™\
enie tych metali w wodach jest zazwyczaj niskie  nale\
y je wydzielić przy u\
yciu
sorbentów chelatujących).
5. Oznaczanie zawartości chromianów w wodzie: zastosowanie detekcji fotometrycznej
pozwala osiągnąć wysoką selektywność.
6. Charakterystyka składników próchnicy: mo\
liwość określania zawartości kwasów
huminowych i fulwonowych w wodzie bez konieczności stosowania sorbentów.
7. Oznaczanie kwasów organicznych zawartych w wodzie w nagłych wypadkach, np. katastrofy
ekologiczne (przeniknięcie substancji do zasobów wody pitnej).
8. Oznaczanie zawartości kwasów tłuszczowych, amin, fenoli i pestycydów.
Zastosowanie izotachoforezy ze względu na rodzaj oznaczanych związków
Analiza organiczna:
Oznaczanie kwasów tłuszczowych i ich pochodnych
Oznaczanie kwasów aromatycznych
Oznaczanie fenoli i ich pochodnych
Oznaczanie nitrofenoli
Oznaczanie aldehydów
Oznaczanie amionokwasów
Oznaczanie kationów organicznych np. kation amonowy, triazynowy
Oznaczanie herbicydów anionowych i kationowych
Analiza nieorganiczna:
- - - - 3-
Oznaczanie anionów: Cl , NO2 , NO3 , SO42-, F , PO4 , P2O74-
3+ 3+ + + + 2+ 2+
Oznaczanie kationów: Fe , Al , K , Na , Li , Ba , Sr , Rb+, Cs+, Mn2+, Cd2+,
2+ 2+
Co2+, Ni2+, Zn2+, Pb2+, Cu2+, Ca , Mg
Aparatura
1. Zbiornik elektrolitu zatrzymujÄ…cego (TE)
2. Blok nastrzykowy, A, B, C pozycje
robocze pętli dozowniczej, w pozycji C
mo\
liwy jest nastrzyk mikrostrzykawkÄ…
3. Kolumna wstępnego rozdzielania
(160 mm × 800 µm Å›r. wew.)
4. Detektor koduktometryczny
5. Blok rozgałęziający
6. Blok zatrzymujÄ…cy
7. Membrana półprzepuszczalna
8. Zbiornik elektrolitu wiodÄ…cego (LE)
9. Kolumna analityczna (160 mm × 300 µm
śr. wew.)
10. Detektor konduktometryczny
11. Detektor UV
12. Zbiornik elektrolitu wiodÄ…cego (LE)
13. Membrana półprzepuszczalna
LE/CE  zasobniki z elektrolitem wiodÄ…cym
dla kolumny wstępnego rozdzielania i
analitycznej.
Rys. 6. Schemat izotachoforegrafu model ItaChrom EA 101.
Obsługa aparatu
Przygotowanie aparatu do pracy:
1. Zmontować układ analityczny wg schematu na rys. 6
2. Podłączyć przewody wysokiego napięcia
3. Podłączyć detektory konduktometryczne
4. Połączyć światłowodami detektor spektrofotometryczny z celką pomiarową
5. Sprawdzić poprawność połączeń
6. Przepłukać układ wodą dejonizowaną
7. Ustawić zawór nastrzykowy w pozycję A
8. Napełnić elektrolitem wiodącym zbiornik CE 2 i kolumnę analityczną
9. Napełnić elektrolitem wiodącym zbiornik CE 1, blok buforujący i kolumnę wstępnego
rozdzielania
10. Napełnić zbiornik elektrolitu zatrzymującego
11. Usunąć z układu pęcherzyki powietrza
12. Włączyć aparat
13. Uruchomić program komputerowy sterujący aparatem
14. Wprowadzić odpowiednią metodę analityczną.
Po wykonaniu wy\
ej wymienionych czynności aparat jest gotowy do pracy
Przeprowadzanie analiz:
1. Sprawdzić poprawność przygotowania aparatu do pracy
2. Analizowaną próbkę umieścić w strzykawce
3. Wsunąć strzykawkę do dozownika, gdy zawór dozujący znajduję się w pozycji A
4. Przekręcić zawór w pozycję C
5. Zamknąć przezroczystą pokrywę aparatu
6. Uruchomić analizę w programie komputerowym
7. Do zakończenia analizy nie otwierać drzwiczek aparatu
8. Po zakończeniu analizy przekręcić zawór dozujący w pozycję B na 1s i dalej w pozycję A
9. Przepłukać i napełnić kolumny elektrolitem wiodącym zaczynając od kolumny
analitycznej (dolnej)
Aparat jest gotowy do kolejnej analizy.
Ćwiczenia
Izotachoforetyczne oznaczanie anionów w wodach pitnych i powierzchniowych
Opis wykonania ćwiczenia:
1. Zapoznać się z budową i zasadą działania aparatu do izotachoforezy
2. Przygotować aparat do analizy uwzględniając uwagi prowadzącego zajęcia
3. Wykonać pomiary dla roztworów wzorcowych poszczególnych anionów
4. Zanalizować uzyskane izotachoforegramy pod kątem jakościowym
5. Przygotować roztwory kalibracyjne
6. Wykonać pomiary dla roztworów kalibracyjnych
7. Zanalizować uzyskane izotachoforegramy pod kątem ilościowym i jakościowym.
8. Sporządzić krzywe wzorcowe
9. Wykonać analizę próbek rzeczywistych
10. Określić zawartość poszczególnych jonów w próbkach rzeczywistych, wyciągnąć wnioski
z uzyskanych izotachoforegramów
11. Sporządzić raport z wykonania ćwiczenia
Nie obsługiwać aparatu bez zgody i nadzoru prowadzącego zajęcia.
Wpływ warunków prowadzenia izotachoforezy na proces rozdzielania jonów
Opis wykonania ćwiczenia:
1. Zapoznać się z budową i zasadą działania aparatu do izotachoforezy
2. Przygotować aparat do analizy uwzględniając uwagi prowadzącego zajęcia
3. Wykonać analizę roztworu wzorcowego stosując trzy ró\
ne natÄ™\
enia prÄ…du
4. Wykonać analizę roztworu wzorcowego stosując kolumnę innej długości
5. Wykonać analizę roztworu wzorcowego stosując elektrolit wiodący w trzech ró\
nych
stÄ™\
eniach
6. Porównać uzyskane izotachoforegramy i wyciągnąć wnioski
7. Sporządzić raport z wykonania ćwiczenia
Literatura
1. S.-G. Hjalmarsson, A. Baldesten, A critical review of capillary isotachophoresis, Anal.
Chem., July 1981, 261 352
2. I. Miedziak, A. Waksmundzki, Izotachoforeza, aparatura, zasada pomiaru i zastosowanie,
Wiad. Chem., 2 (368) 1978, 71-92.
3. STN 75 747430, Kvalita vody. Izotachoforeticke stanovenie chloridov, dusicanov,
siranov, dusitanov, fluoridov a fosforecanov vo vodach
4. STN 75 7431, Kvalita vody. Izotachoforetickie stanovenie amoniaku, sodika, draslika,
vaonika a horicika vo vodach
5. Noty aplikacyjne Villa Labeco
6. M. Hutta, D. Kaniansky, E. Śimunićova, V. Zelenska, V. Madajova, A. Śiśkova, Solid
phase extraction for sample preparation i trace analysis of ionogenic compounds by
capillary isotachophoresis, J. Radioanal. and Nuclear Chemistry, 163 (1992) 1, 87-98
7. F. M. Everaerts, J. l. Beckers, T. P. E. M. Verheggen, Isotahophoresis. Theory,
Instrumentation and Applications, J. Chrom. Library, Vol.6, 1976
8. P. Boćek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, Analytical Isotachophoresis, VCH 1988
9. P. Blatnż, F. Kvasni%0ńka, Application of capillary isotachophoresis and capillary zone
electrophoresis to the determination of inorganic ions in food and feed samples, J. Chrom.,
834 (1999) 419-431
10. F. Kvasni%0Å„ka, Application of isotachophoresis in food analysis, Electrophor., 21, (2000),
2780-2787
11. Strona internetowa: http://www.labsoft.com.pl/