Wykład I – 7.10.2011

Toksykologia – nauka o szkodliwym działaniu czynników pochodzenia przede wszystkim egzogennego np. fizycznych (promieniowanie jonizujące, UV) oraz chemicznych (aflatoksyny B, benzopiren) na organizmy żywe.

Cel:

• Ocena toksyczności danego czynnika

• Poznanie mechanizmów odpowiedzialnych za toksyczność

• Ocena zagrożenia (dawki, na poziomie komórkowym i organizmu, wyodrębnienie grupy ryzyka)

• Poszukiwanie mniej toksycznych związków (np. leków)

Stosowanie substancji toksycznych

• Medycyna (diagnostyka, farmaceutyki)

• Produkcja żywności (dodatki, konserwanty, barwniki)

• Rolnictwo (środki ochrony roślin)

• Przemysł chemiczny, farmaceutyczny, rafineryjny (rozpuszczalniki, i substraty do produkcji, linie produkcyjne leków)

• Życie codzienne (środki żywności, palenie papierosów, styl życia, odżywianie)

Ile mamy związków chemicznych?

CasRegistry:

• 31 milionów (marzec 2007);

• 55 milionów (wrzesień 2010);

• 60 milionów (wrzesień 2011)

• >73 miliony (aktualnie)

Baza Cas stara się gromadzić informacje o wszystkich znanych związkach chemicznych. Na CasRegistry rejestruje się średnio na dobę ok. 4.000 – 12.000 związków chem. CAS (Chemical Abstract service) np. 58-08-2 CAS Registry numer dla kofeiny

EINESC ok. 100.000 związków. (Europejski Wykaz Istniejących Substancji o Znaczeniu Komercyjnym)

Kryteria oceny danych toksykologicznych.

Aby ocenić dane toksykologiczne muszą być wzięte pod uwagę:

• Struktura chemicznego czynnika i ważne grupy funkcyjne

• Właściwości fizyczno – chemiczne (np. rozpuszczalność, trwałoś itp.)

• Bioaktywacja i detoksykacja (jak czynnik zachowuje się po wprowadzeniu do organizmu – czy pod wpływem enzymów organizmu żywego nie ulega przemianom do związków toksycznych lub czy nie dochodzi do zniesienia toksyczności przez detoksykację)

• Wpływ na organizm człowieka

Konsekwencje ekspozycji na czynniki o działaniu toksycznym:

Związek reaktywny metabolicznie	Efekt toksyczny
Bromobenzen	Nekroza wątroby
Chlorek winylu	Rak wątroby
Anilina	Methemoglobinemia
Chloroform	Nekroza wątroby/nerek
Benzo(a)piren	Nowotwory płuc

Czynniki karcinogenne w środowisku

Kategoria	Przykład	Karcynogenność
Przemysł	Chlorek winylu	+++
Występujące naturalnie	Aflatoksyna B1	+++
Cytostatyki	Melphalan	+++
Life style	Palenie papierosów	+++

Ocena ryzyka toksykologicznego:

Przed wprowadzeniem do produkcji, handlu lub przemysłu przygotowywane są profile toksykologiczne, określające:

• Genotoksyczność

• Karcynogenność

• Toksyczność reprodukcyjną

Grupy dużego narażenia na działanie szkodliwych substancji:

• Kobiety w ciąży

• Noworodki

• Dzieci

• Starcy

• YOPIL’s (Young, Old, Pregnant, Immuno-incompetent, LiverPatient)

Podział toksykologii

Dziedziny toksykologii	Badania
Toksykologia biochemiczna	Procesy na poziomie molekularnym i komórkowym po interakcji substancji toksycznych z żywym organizmem
Toksykologia komórek	Z wykorzystaniem hodowli komórkowych (początki to lata 50-te)
Toksykologia molekularna	Interakcje pomiędzy genomem…

Inny podział toksykologii:

Dziedziny toksykologii	Specyficzność narządowa
Kliniczna	neurotoksykologia
Zawodowa	Neurotoksykologia
Środowiskowa	Nerfotoksykologia
Żywności	Immunotoksykologia
Genetyczna (genotoksyczność – mutagenność)	Immunotoksykologia

Początki toksykologii:

Odkrycie mutagennego działania czynników:

Fizycznych – promieniowanie X (Henry Muller, 1927)

Chemicznych – gaz musztardowy (Auerbach and Robson 1941)

Początek toksykologii genetycznej – 1953 Watson i Crick

Zadania toksykologii genetycznej

• Wykrywanie związków genotoksycznych

• Ocena ich działania współzależność między mutagennością i karcynogennością

• Wykrywanie mutacji i zmian genetycznych oraz ich biologicznych konsekwencji

• Elektroporacja wyników doświadczalnych do człowieka

Toksykologia genetyczna opisuje procesy:

• Indukcji uszkodzeń DNA

• Naprawy uszkodzeń DNA

• indukcji zmian genetycznych i ich biologicznych konsekwencji.

Czynniki uszkadzające DNA

• Endogenne – reaktywne formy tlenu (ROS), powstające w procesach metabolicznych, błędy w replikacji

• Egzogenne – fizyczne i chemiczne

  • promieniowanie jonizujące (elektromagnetyczne X) Rentgena, bomby kobaltowe i cezowe

• Cząsteczkowe – przyspieszone neutrony, cząsteczki α oraz promieniowanie UV

  • Związki alkilujące, ROS, policykliczne węglowodory aromatyczne, związki sieciujące DNA

Czynniki i powodowane przez nie typy uszkodzeń.

Różne rezultaty działania czynników genotoksycznych

• Efekty toksyczne – letalne

• zahamowanie replikacji DNA

• zahamowanie transkrypcji

• śmierć komórki (nekroza, apoptoza)

• Efekty genetyczne - mutagenne

  • Powstają głównie podczas replikacji DNA

  • Mutacje genowe

  • Aberracje chromosomowe

  • Komórki rozrodcze choroby dziedziczne, niepłodność

  • Komórki somatyczne nowotwory

Genotyp człowieka:

Informacja genetyczna zapisana jest na 46 chromosomach

Ile genów? -> 21 tyś. Genów x2 (bo gen posiada dwa allele)

Ile par zasad? -> 3 biliony pz x2 (-||-)

35 000 genów u człowieka x 2 (dane ze starego wykładu)… ?

6 miliardów par zasad

Struktura DNA umożliwia wierne kopiowanie informacji genetycznej

Jak uszkodzenie DNA prowadzi do mutacji i niestabilności genomu

• Spontaniczna niestabilność chemiczna DNA

• Depurynacja, depirynidynacja

• Dezaminacja

• Procesy endogenne

  • Metylacja (S-adenozylometionina)

  • Oksydacja (reaktywne formy tlenu [Reactive Oxygen Species])

  • Wolne rodniki

• Czynniki egzogenne

  • Podwójne i pojedyncze pęknięcie DNA (DSB, SSB)

  • Małe modyfikacje zasad

  • Addukty DNA (bulky adducts)

Parowanie zasad w DNA

Formy ketonowe – prawidłowe parowanie

Formy enolowe lub iminowe (tautomeria zasad) – błędne parowanie

Depurynacja spontaniczna

10 000 depurynacja / 10¹⁰ bp (kom/dzień (G i A))

500 depirymidunacji / 10¹⁰ bp (kom/dzień (C i T))

Dezaminacja (proces spontaniczny) – gdy cytozyna poddana jest dezaminacji C-> U!

Człowiek posiada ok. 3% zmetylowanego DNA

Dezaminacja, np. z cytozyny na uracyl

Uszkodzenie oksydacyjne zasad – utrata/zmiana właściwości parowania zasad.

ROS:

• 8-okso-guanina (powoduje błędne parowanie zasad, zarówno z C jak i z A)

• 8-okso-adenina

• Glikol tyminy

• 5-hydroksyuracyl

Mechanizm powstawania mutacji punktowych: potrzebne 3 rundy replikacyjne (AT-GC)

Promieniowanie UV

Policykliczne węglowodory aromatyczne (6-4)PP bulky adducts CPD dimery pirymidynowe naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER – nucleotide excision repair)

Promieniowanie jonizujące

Czynniki przeciwnowotworowe (cis Pt, MMC) wiązania sieciujące, krzyżowe (cross-link), pęknięcia podwójnej nici naprawa rekombinacyjna (HR, EJ)

Błędy w replikacji

Złe parowanie zasad A-G mismatch, T-C mismatch, delecje, insercje mismatch repait (MMR)

Uszkodzenia DNA indukowane przez:

• UV

  • Dimery pirymidynowe cyklobutanu

  • 6-4 fotoprodukty

• Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA/PAH)

  • Pochodne benzo(a)pirenu (dym papierosowy)

  • Aflatoksyna B₁ (pożywienie – pleśnie np. połączenie G i aflatoksyny B₁)

Uszkodzenia alkilacyjne zasad

(Zanik właściwości parowania zasad) - Przyłączanie grup alkilacyjnych (np. CH₃)

• Np. alkilacja guaniny O-6 Ethylguanina jako produkt (GCAT)

• Alkilacja tyminy O-4 Ethyltymina jako produkt (TACG)

• Zmiana właściwości parowania zasad

Czynniki alkilujące – typy adduktów DNA

• Monofunkcyjne (monoaddukty DNA)

  • Siarczan metylu - DMS (Dimethylsulfate)

• Polifunkcyjne (tworzenie wiązań krzyżowych DNA)

  • Busulfan

Formowanie adduktów DNA przez dwufunkcyjny Iperyt azotowy (nitrogen mustard, mechlore thamine, MEC)

Powstają wiązania krzyżowe między deoksyrybozami:

deoksyryboza – CH₂ - CH₂ - N(CH₃) - CH₂- CH₂ – deoksyryboza

lub monoaddukt:

deoksyryboza – CH₂ - CH₂ - N(CH₃) - CH₂- CH₃

Wiązania międzyniciowe DNA (interstrand crosslinks) blokują transkrypcję i replikację.

Jest to jeden z mechanizmów działania leków przeciwnowotworowych, np. cis platyny.

Podwójne pęknięcie (DSBs)

Powstają w czasie replikacji (zatrzymanie się widełek replikacyjnych) oraz po naświetlaniu promieniowaniem jonizującym. Nieprawidłowe DSBs są letalne.

Czynniki mutagenne – mechanizm mutacji

Związki chemiczneGdzie mogą powstać mutacje:

• We wszystkich miejscach chromosomu (genu)

• Większość jest typu „silent”, to znaczy, że nie uszkadzają funkcji genu

• Mutacje zachodzące w genach mogą, ale nie muszą prowadzić do uszkodzenia funkcji danego genu.

Mutacje w genie mogą dotyczyć

1. Promotor: mogą wpływać na wydajność transkrypcji, na ekspresję

2. Ekson: uszkodzenie funkcji; mogą wpływać na strukturę białka

3. Miejsce splicingowe: mogą uszkodzić splicing (wpływ na pominięcie eksonu)

4. Intron: brak efektu.

Delecje, insercje i translokacje na poziomie chromosomu i genu.

Klasyfikacja zmian molekularnych w DNA

Mikrouszkodzenia:

Zmiana par zasad:

Typ dziki: Lys Gln Val

5’ AAG CAA GTT 3’

3’ TTC GTT CAA 5’

Nonsens Lys STOP Val

5’ AAG TAA GTT 3’ (skrócenie białka częściowe (utrata funkcji)

3’ TTC AAT CAA 5’

Mutacja nonsensowna skrócenie białka (częściowa utrata funkcji); kodon stop

Mutacje zmiany sensu zamiana aminokwasu (częściowa utrata funkcji)

Zmiana ramki odczytu skrócenie białka ([częściowa]utrata funkcji); często kodon stop

Makrouszkodzenia (wykrywane metodami cytogenetycznymi)

• Aberracje chromosomowe

  • Aberracje numeryczne

    • Nondysjunkcja aneuploidie

    • Toksyny wrzeciona podziałowego

    • Zaburzenia centrosomu

    • AP-site (są konsekwencją przerwania i ponownego połączenia DSB – złamania chromosomów)

  • Aberracje strukturalne

    • Typ chromatyda chromosom

    • stabilne – niestabilne aberracje

    • strukturalne aberracje chromosomowe (CA’s) są konsekwencją przerwania i ponownego połączenia DSB (złamania chromosomów) i pozwalają ocenić …….

Błędy w czasie segregacji chromosomów – aneuploidie:

• U człowieka – częstość występowania komórek aneuploidalnych w ciele – bardzo niska:

  • 1-2 % u ludzi (w wieku 20-25 lat)

  • 9% u kobiet (70-75 lat)

  • 7% u mężczyzn (70-75 lat)

• Np. Zespół Downa, Turnera (trisomie X)

• Większość zarodków aneuploidalnych jest eliminowana przez aborcje spontaniczne (częstość zwiększona z wiekiem)

• Utrata lub dodatkowy chromosom może prowadzić do rozwoju nowotworów, bo wiadomo, że wiele nowtworów rozwija się w wyniku monosomii lub trisomii pewnych chromosomów. Przykład: monosomia może prowadzić do utraty genów supresorowych, jak wykazano podczas retinoblastomy nowotworu Wilmsa, np. nowotwór piersi, gdzie odpowiedzialny jest BRCA1.

Poliploidia

(nie są wynikiem wyłącznego działania czynników toksycznych)

• Występuje normalnie w ludzkim szpiku kostnym (megakariocyty – mają zazwyczaj 8-16x liczby haploidalnej)

• Tetraploidy występują normalnie w regenerujących się komórkach wątroby i innych tkanek

• Nienormalny kariotyp

  • SV 40 transformowanych fibroblastach

  • Generalnie w nieśmiertelnych liniach komórkowych

Aberracje strukturalne

• Typu chromosomowego – zmiana w obydwu chromatydach

• Typu chromatydowego (indukowanego głównie przez mutageny chemiczne) – złamanie pojedynczej chromatydy lubz łamanie orazz ponowne połączenie pojedyńczej chromatydy

Rodzaj aberracji zależy od czynnika typu indukowanego uszkodzenia w DNA, momentu cyklu życiowego komórki w czasie ekspozycji

• Typ czynnika:

  • S niezależny (X-ray)

  • S zależny (UV, CH₃)

• Promieniowanie jonizujące:

  • G₁ chromosomowy typ

  • G₂ chromatydowy typ

  • S – obydwa typy

Skutki aberracji chromosomalnych (CA)

1. 1-2% noworodków CA

2. 50% spontanicznych aberracji CA

3. Większość komórek nowotworowych CA

4. Większość czynników genotoksycznych CA

5. Wiele wirusów jest przyczyną CA

6. Wiele chorób z zapadalnością na nowotwory wykazuje CA

Choroby dziedziczne z niestabilnością genomu

• Syndrom Bloom’a (BS)

• Xeroderma Pigmentosium (XP)

• Ataksja Teleangiektazja (AT)

• Nijmegen Breakage Syndrom (NBS)

• anemia Fanconi’ego (FA)

• Rozwój choroby nowotworowej