Wykład II – 22.10.2011

Chemiczne mutageny – aktywacja metaboliczna promutagenów

Ksenobiotyki substancje obce dla organizmów żywych, (gr. Ksenos – obcy, bioticos – dotyczący życia)

Metabolizm ksenobiotyków – procesy określające los substancji w organizmie;

Czynniki wpływające na rozlokowanie ksenobiotyków w organizmie.

Metabolizm ksenobiotyków

• Proces zmieniający charakter substancji z hydrofobowej na hydrofilową w celu ułatwienia eliminacji z organizmu

Biotransformacja – podział

• Faza I (modyfikacja, przyłączanie grup funkcyjnych)

• Faza II (sprzęganie)

  • Bioaktywacja niektórych związków (powstający metabolit jest bardziej toksyczny niż oryginalny związek)

Biotransformacja:

• Proces, w którym substancje obce (ksenobiotyki) ulegają w organizmach przemianom chemicznym metabolity o różnej aktywności

  • Detoksykacje – w wyniku biotransformacji produkt o słabszym działaniu toksycznym; biologicznie nieczynne)

  • Bioaktywacje – biotransformacja substancji biologicznie nieczynnej, wykazującej słabe działanie toksyczne powstanie silnie toksycznego metabolitu (aktywacja metaboliczna)

    • Bezpośrednio mogą reagować z DNA (bezpośrednie mutageny)

    • Wymagające aktywacji metabolicznej

• Główne drogi eliminacji:

  • Odchody (żółć, mocz)

  • Wydychane powietrze

Chemiczne mutageny:

• Bezpośrednio mogą reagować z DNA (bezpośrednie mutageny)

• Wymagające aktywacji metabolicznej (protomutageny)

Klasa mutagenów	Przykład związku	mechanizm
Naturalne	Aflatoksyna B1	Aktywacja
Policykliczne aromatyczne węglowodory	Benzapiren Benzoantracen
Aromatyczne aminy	Fenylenodiamina 2-naftyloamina
Nitrozoaminy	DNM (dimetylonitrozoamina) NNK (4-metylonitrozoamina)
Nitrozomoczniki	ENU (etylonitromocznik) – bezpośredni mutagen MNU (metylonitrozomocznik)	Bezpośredni mutagen (bardzo niewiele bezpośrednich mutagenów)

Bioaktywacja – aktywacja metaboliczna

• Faza I – Modyfikacja polarne metabolity

  • Oksydacja

  • Hydroliza – polarne metabolity

  • Redukcja

• Faza II – sprzęganie (do nich sprzęgane są toksyny, powstają hydrofilowe metabolity)

  • Glutation

  • Kwas glukaronowy

  • Aminokwasy

  • Grupy metylowe

  • Grupy acetylowe

  • Grupy sulfonowe

Faza I: MODYFIKACJA

• Oksydacja (najważniejsza)

  • Cytochrom P450 (cała grupa złożona z izoenzymów), oksygenaza flawonowa, dehydrogenazy (alkoholowa, aldehydowa), oksydazy i inne

• Redukcja

  • Reduktazy (reduktaza NADPH – cytochrom P450)

• Hydroliza

  • Peptydazy, esterazy, hydrolazy (enzymy w siateczce śródplazmatycznej i cytozolu)

Faza I - reakcje:

N – oksydacja
S – oksydacja
redukcja karbonylu
hydroliza estrów

desulfuracja

dehydrogenacja

Faza I: CYTOCHROM P450 (przede wszystkim zaangażowany)

• Wewnątrztkankowa lokalizacja

  • Membranowe związanie

  • Gładkie retikulum endoplazmatyczne

• Obecność Cytochromu P450 w organizmach:

  • Większość organów; wątroba – najwięcej

  • Nerki, skóra, płuca, jelita – znacznie mniej niż w wątrobie.

Faza I: cytochrom P450 – monooksygenoza

• Hemoproteina; gr. prostetyczna; żelazoporfiryna IX

Reakcja: RH + O₂ + NADPH + H⁺ ROH + H₂O + NADP⁺

1 atom tlenu włączony do substratu (R), 1 atom tlenu redukowany do wody (monooksygenazy) + NADPH jako kofaktor.

Ścisły związek z reduktazą NADPH-cytochrom P450 donor 1 lub 2 elektronów

+ fosfolipidy – system monooksygenazy cytochromu P450

• Alternatywny 2 elektronowy : NADPH/NADH reduktaza NADPH/NADH – cyt b₅

Cykl katalityczny cytochromu P450
1. Przyłączenie substratu do enzymu
2. Donacja elektronu
3. Dodanie tlenu i przebudowa
4. Donacja kolejnego elektronu z wydzieleniem wody

Liczba znanych cyt. P450 6000 (2000 ssaki, ludzie ok. 60, bakterie >20)
nazwa: CYP, np. CYP3A4, CYP3A7 (265 rodzin, 18 u ssaków)

• CYP1A1

  • Nadrodzina

  • Rodzina ( > 40 % homologi )

  • Podrodzina (55% homologi )

  • Indywidualny enzym

Szeroka specyficzność substratowa (duża zaleta cytochromów)

• Metabolizm ksenobiotyków

• Udział w biosyntezie i przemianach endogennych substratów np. steroidów, prostaglandyn, tromboksanów, pochodnych kwasów tłuszczowych

Najważniejsze ludzkie cytochromy P450

CYP	Lokalizacja	Substraty
1A1	Płuco, serce, przewód pokarmowy	PAH, benzo(α)piren
1A2	Wątroba	Aminy aromatyczne, PAM
1B1	Skóra, mózg, serce, łożysko, wątroba, nerki	PAH
2A6	Wątroba	Kumaryna, steroidy,
2B6	Wątroba, serce	Nikotyna
2C9/10	Wątroba	Bulbutamid, heksobarbital
2D6	Wątroba, mózg, serce	Β-blokery, leki antydepresyjne
2E1	Wątroba, płuca, mózg, serce, szpik	Nitrozoaminy, acetaminoten ?, EtOH
3A4	Wątroba, nerki, przewód pokarmowy, płuca, mózg	Blokery kanałów Ca, cyklosporyna, acetaminoten ?, steroidy
4A9/11	Nerki	Kwasy tłuszczowe

Cytochrom 3A4 – odpowiedzialny za 52% metabolizmu wszystkich leków
Cytochrom 3D6 – odpowiedzialny za 30% metabolizmu wszystkich leków

Faza I: Metaboliczna aktywacja dimetylonitrozaminu (DMN)

Faza II – Sprzęganie

• Enzymatyczna kataliza

• Enzymy (transferazy) – kofaktor

  • Enzymy: transferaza glutationowa, acetylotransferaza, metylotransferazy, sulfotransferaza, UDP – glukuronozylotransferaza i inne.

  • Kofaktory: UDPGA (UDPGA (glukurotransferazy, kwas 5­-urydynodifosfoglukuronowy), PAPS (5’-fosfosiarczan 3’ fosfoadenozyny, sulfotransferaza), acetylo-CoA (acetylotransferaza; aktywny octan), GSH (glutation, 3’-transferaza glutationowa)

• Reakcja sprzęgania

2 etapy:
I – aktywacja endogennego związku (przez ATP, UTP - kofaktory)
II – przeniesienie na akceptor (R)

Sprzęganie z kwasem α-urydynodifosforoglukuronowy (UDPGA)

R + UDPGA ROC₆H₉O₆ (glukuronid)

UDPGA - kwas 5’-urydynodifosfoglukuronowy

Przemieszczenie grupy glukuronylowej na ksenobiotyk jest katalizowane przez enzym UDP-glukuronozylotransferazę (UGT).

Ze względu na powszechną dostępność glukozy w tkankach sprzęganie z kwasem glukuronowym jest najczęstszą reakcją II fazy.

Połączenia z kwasem glukuronowym dają różne grupy związków chemicznych:

• alkohole, fenole tworzą połączenia typu eterowego

• kwasy karboksylowe – połączenia estrowe

• związki z grupą sulfhydronylową (tiofenole, disiarczek tetrametylotiuramu) tworzą S-glukuronidy

• aminy alifatyczne i aromatyczne, sulfonamidy, karbaminiany, heterocykliczne związki azotowe – tworzą N-glukuronidy

• Niektóre ksenobiotyki (fenylobutazon, sulfinpyrozol) – tworzą C-glukuronidy

Sprzęganie z aktywnym siarczanem (PAPS) (5-fosfosiarczan – 3’fosfoadenozyny):

PAPS jest kofaktorem w reakcji sprzęgania z kwasem siarkowym. Tworzy się on w wyniku reakcji siarczanów z ATP. Źródłem siarczanów są aminokwasy siarkowe, głównie cysteina. Ze względu na ograniczoną pulę wolnej cysteiny w organizmie zwierząt alkohole i fenole przeprowadzane są w większym stopniu w połączenia z kwasem glukuronowym niż siarkowym.

Reagują z nim: alkohole, fenole, alifatyczne aminy
Sprzęganie ksenobiotyków z kwasem siarkowym (VI) katalizują enzymy z nadrodziny sulfotransferaz.

R + PAPS RSO3 + 5’fosforan-3’fosfoadenozyny

Produkty sprzęgania ksenobiotyków z PAPS wydalane są zazwyczaj z moczem, rzadko z żółcią.

AcetyloCoA
Reagują z nim aminy aromatyczne, niektóre alifatyczne, sulfonamidy
Reakcja z użyciem acetylotransferazy
R + AcetyloCoA Acetylo-R + CoA

GSH (glutation – γ-glutamylo-cysteino-glicyna)
Reagują z nim węglowodory aromatyczne i alifatyczne, nitroalkany
Reakcja z użyciem S-transferaz glutationowych
R+GSH R-SO kwasy merkapturowe (acetylowe pochodne cysteiny)

Faza III Biotransferacji

• Dalszy metabolizm związków powstałych w fazie II, np. konjugatów glutationu do kwasów merkapturowych

• Produkty II fazy ulegają aktywacji metabolicznej np. do wolnych rodników (karboniowego, episulfoniowego)

Czynniki wpływające na przebieg biotransformacji

• Czynniki zewnętrzne:

  • Dieta

  • Używki

  • Leki

  • Ekspozycja na zanieczyszczenia środowiska

  • Ekspozycja na koserwaty żywności, pestycydy

• Czynniki wewnętrzne

  • Różnice narządowe

  • Wiek

  • Płeć

  • Uwarunkowanie gatunkowe

  • Uwarunkowanie genetyczne: polimorfizm genetyczny

• Czynniki wewnętrzne:

  • różnice narządowe

    • Uszkodzenie związane z mechanizmem i drogą absorpcji

- anatomiczna pozycja i funkcja narządu (jelita, wątroba, nerki)

• Biochemiczna charakterystyka i spektrum metaboliczne

• Podobieństwo do endogennych substancji

• . . .

• wiek

  • płody, noworodki, starzy ludzie – bardziej wrażliwe na leki niż dorośli

  • człowiek i zwierzęta - zazwyczaj wydajnośc metaboliczna wzrasta wraz z wiekiem (płody, noworodki – 20-50% aktywności osób dorosłych)

  • sprzęganie: mała spraność z kwasem glutationowym – zatrucie lekami, glicyna, glutation↓ = acetylacja

  • . . .

• płeć

  • zależność gatunkowa

    • najbardziej zaznaczona wśród gryzoni

    • myszy zazwyczaj odwrotnie niż szczury

    • u ludzi także

  • zaleznośc od substancji (szczury)

    • hydroksylacja aniliny – ♀=♂

    • hydroksybarbital – (czas snu: ♀ dłuższa niż ♂, metabolizm większości ziązków ♂>♀ – ok. 3x)

  • związek metabolizmu z hormonami

    • kastracja szczurów ♂ – ↓ metabolizm heksobarbitalu,

    • ↑ metabolizm po suplementacji hormonami

Reakcje II fazy – różnice gatunkowe - brak sprzęgania: (trudność w określeniu toksyczności w przypadku nowych związków):

• Kot z kwasem glukuronowym

• Świnia z kwasem siarkowym

• Świnka morska z glutationem (brak kwasów merkapturowych)

• Pies – brak acetylacji

Polimorfizm genetyczny – faza I

Metabolizm popafenonu (lek przeciwarytmiczny) – CYP2D6

• Wolna hydroksylacja (3 rodzaje fenotypów)

• Szybka hydroksylacja ( WT allele; mutacje nie mają wpływu na aktywność) zróżnicowanie dawek

Populacja kaukaska – 7% defektywnych genów
Populacja azjatycka – 50% defektywnych genów

Polimorfizm genetyczny – faza II
Różnice etniczne – N-aceetylotransferaza
Eskimosi –acetylacja szybka – 95-100%

Drogi prowadzące do uszkodzeń DNA i biologiczne wyniki uszkodzenia
Isoniazyd ( chemioterapie) – spadek uszkodzenia wątroby (wolna acetylacja)
Aromatyczne aminy – wzrost mutagenezy, karcenogenezy (szybka acetylacja)

Produkty rozkładu termicznego żywności – (rak odbytu, żołądka)

Podstawy genetyczne i metaboliczne mechanizmów odpowiedzialnych za nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące

Drogi prowadzące do uszkodzeń DNA - biologiczne wyniki uszkodzenia

Czynnik genotoksyczny ─(bezpośredni promutagen)─> interakcje z DNA ─> powstanie adduktów DNA, uszkodzenie ─(naprawa DNA) ─> ekspresja uszkodzenia DNA ─> biologiczne rezultaty ─> bezpośrednia toksyczność ─> efekty

NOWA PREZENTACJA

Podstawy mechanizmów odpowiedzialnych za nadwrażliwość komórek na czynniki genotoksyczne, molekularne podłoże chorób genetycznych związanych z niesprawnymi systemami naprawy DNA

Podstawy wrażliwości na promieniowanie jonizujące

Promieniowanie - zjawisko wysyłania przez substancję energii w postaci czastek bądź fal elektromagnetycznych.

Podział promieniowania

• Jonizujące (wywołuje jonizację ośrodka, przez które przechodzi); źródło: przemiany jądrowe, zachodzące w jądrze atomowym, wyzwalającym energię)

  • Korpuskolarne (odmiana jonizującego) – np. α, β

• Niejonizujące (promieniowanie radiowe, mikrofalowe)

Jednostki

• Natężenia

  • Ci (kiur) – historyczne

  • Bq (Bekerel) – 1 Bq (= 1 rozpad promieniotwórczy w ciągu 1 sekundy); 1 Ci = 3,7 x 10¹⁰ Bq

• Dawki pochłoniętej energii

  • Gy (Grey) – ilość pochłoniętej energii podzielona przez kg żywej materii; 1 Gy-100 Rad

• Jednostki dawki równoważnej (biologiczne skutki napromieniowania)

  • Sv (sivert) – 1Gy = 1 Sv – X, γ, β; 1mSv = 0,001 Sv
    Człowiek: 3-4 Sv to dawka letalna LD_50/30 (gdzie LD50 to populacja, a 30 to ilość dni)
    Promieniowanie jonizujące LD_50/30: 2,4 mSv to roczna dawka

Źródła promieniowania jonizującego

• Naturalne - występujące w warunkach naturalnych (glebach, żywności, roślinach oraz promieniowanie kosmiczne)

  • 40,6% - radon

  • 3% tryton

  • 8,2% - źródła wewnętrzne

  • 8,4% - promieniowanie kosmiczne

  • 13,8% - gamma

• Sztuczne – izotopy promieniotwórcze, niewystępujące w przyrodzie, urządzenia jądrowe, opary rentgenowskie

  • 25,4% - zastosowanie medyczne

  • 0,2% - awaria czarnobylska

  • 0,4% - inne

Biologiczne skutki promieniowania

• Somatyczne – występują bezpośrednio po napromieniowaniu całego ciała. Późniejsze skutki to białaczka, nowotwory kości, zaćma, bezpłodność

  • WCZESNE

    • Choroba popromienna

      • Ostra

      • Przewlekła

    • Miejscowe uszkodzenia skóry

  • ODLEGŁE

    • Zmętnienie soczewek i zaćma

    • Aberracje chromosomowe w komórkach somatycznych

    • Nowotwory złośliwe

    • Niepłodność

    • Zahamowanie metabolizmu komórkowego

• Genetyczne

  • Mutacje genowe

    • Dominujące

    • Recesywne

  • Aberracje chromosomowe w komórkach rozrodczych

• Genetyczne – związane z mutacjami w obrębie materiału genetycznego. Duże dawki są najczęściej dawkami letalnymi. W wyniku promieniowania może wystąpić:

  • Uszkodzenie DNA

  • Zniszczenie lipoproteinowych składników błon komórkowych

  • Zaburzenie syntezy białek

  • Zmiana aktywności enzymatycznej

  • Zaburzenie gospodarki elektrolitycznej

Mechanizmy uszkodzeń DNA pod wpływem IR