Katarzyna Kornacka
Biotechnologia III rok
Zastosowanie enzymów do ilościowej analizy metabolitów.
Oznaczanie stężenia glukozy w materiale biologicznym.
Enzymy wykorzystujemy jako narzędzia w analizie związków. Metody analityczne wykorzystujące enzymy charakter zują się wysoką specyficznością, powtarzalnością, szybkością i ogromną czułością. W oznaczeniach z udziałem enzymów bardzo często reakcje sprzężone są z procesami fosforylacji lub defosforylacji orza utleniania lub redukcji NAD lub NADP.
Do oznaczania glukozy stosujemy enzym heksokinazę i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu.
glukoza + ATP → glukozo-6-fosforan + ADP
gliukozo-6-fosforan + NADP+ → 6-fosfoglukonian + NADPH+H+
Krzywa Kalibracji.
Stężenie glukozy [µg/0,6 ml] |
A540 | ∆A |
|---|---|---|
| 0 | 0,092 | - |
| 10 | 0,278 | 0,186 |
| 20 | 0,424 | 0,332 |
| 30 | 0,597 | 0,505 |
K=μg/próbę glukozy/ A
K1=10/0,186= 53,5
K2= 20/0,332= 60,24
K3= 30/0,505= 59,41
Kśred=(59,41+60.24+53,5)/3= 57,72
2. Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy krwi, komórkach wątroby i kiełkach.
Absorbancja próby zerowej: A0 = 0,092
| Surowica krwi | Komórki wątroby | Kiełki |
|---|---|---|
| t [min] | A | t [min] |
| 0 | 0,188 | 0 |
| 1 | 0,207 | 1 |
| 2 | 0,234 | 2 |
| 3 | 0,256 | - |
| 4 | 0,281 | - |
| 5 | 0,305 | - |
| 6 | 0,326 | - |
| 7 | 0,345 | - |
| 8 | 0,364 | - |
| 9 | 0,381 | - |
| 10 | 0,394 | - |
| 11 | 0,409 | - |
| 12 | 0,421 | - |
| 13 | 0,433 | - |
| 14 | 0,445 | - |
| 15 | 0,457 | - |
| 16 | 0,463 | - |
| 17 | 0,471 | - |
| 18 | 0,480 | - |
| 19 | 0,488 | - |
| 20 | 0,495 | - |
| 21 | 0,495 | - |
Rozcieńczenia preparatów
| Materiał | Rozcieńczenie |
|---|---|
| Surowica krwi | 40x |
| Komórki wątroby | 100x |
| Kiełki | 80x |
kiełki
A=0,795-0,092=0,703
C= A*K*80*10/6
C= (0,703*57,72*80*10)/6=5,4 mg/ml
z wykorzystaniem mmolowego współczynnika:
1μmol/ml- 6,22
x μmol /ml-0,703
x=0,113 μmol /ml
x=0,113*80*2,5= 22,60 μmol /ml
1 μmol glukozy= 180 μg
22,6 μmol glukozy= x μg
x= 4068 μg/ml
x= 4,06 g/ml
wątroba
A=0,103-0,092=0,011
C=(0,011*100*57,72*10)/6
C= 0,106 mg/ml
z wykorzystaniem mmolowego współczynnika:
1μmol/ml- 6,22
x μmol /ml-0,011
x=0,0017 μmol /ml
x=0,0017 *100*2,5= 0,425 μmol /ml
1 μmol glukozy= 180 μg
0,425 μmol glukozy= x μg
x= 76,5 μg/ml
x= 0,0765mg/ml
surowica
A=0,495- 0,092=0,403
C= (0,403*57,72*40*10)/6=1,55 mg/ml
z wykorzystaniem mmolowego współczynnika:
1μmol/ml- 6,22
x μmol /ml-0,403
x=0,0648 μmol /ml
x=0,0648*40*2,5= 6,48 μmol /ml
1 μmol glukozy= 180 μg
6,48 μmol glukozy= x μg
x= 1166 μg/ml
x= 1,166g/ml