Katarzyna Załęska

ENZYMY O KINETYCE ALLOSTERYCZNEJ
Oznaczanie aktywności dehydrogenazy izocytrynianowej.

Enzymy allosteryczne są zbudowane zwykle z kilku podjednostek i nie podlegają zasadom kinetyki Michaelisa-Menten. Krzywa zależności szybkości reakcji od stężęnia substratu ma kształt sigmoidalny. Jest to związane z tym i ż związanie substratu w jednym miejscu aktywnym może zmienić właściwości drugiego miejsca aktywnego cząsteczki enzymu i tym samym zwiększa jego powinowactwo do substratu.

Dehydrogenaza izocytrynianowa drożdży jest enzymem allosterycznym. Katalizuje oksydatywną dekarboksylację L-izocytrynianu do α-ketoglutaranu. Koenzymem dehydrogenazy w tej rekacji jest NAD+. Aktywność tego enzymu jest regulowana z udziałem kilku efektorów takich jak NAD+, ADP, Mg2+.

L-izoctrynian +Nad+ α-ketoglutaran + NADPH +H⁺+CO₂

Miarą aktywności enzymu jest przyrost zredukowanego NAD+ z maksimum absorpcji ʎ=340 nm. Enzym do doświadczenia pochodził z drożdży piekarniczych.

Przebieg doświadczenia
Drożdże piekarnicze zostały roztarte z celitem, a następnie dodano dwuwęglanu sodowego. Całość utarto na jednolitą masę. Homogenat poddano sonifikacji, a następnie całość zwirowano. Do dalszych doświadczeń używano supernatantu.
Substrat przygotowano w 7 stężeniach. Do kuwety spektrofotometrycznej wlewano mieszaninę zawierającą MgCl₂,bufor Tris-HCl i NAD⁺, odpowiednie stężenie substratu, a reakcję zapoczątkowano dodaniem enzymu, po czym dokonywano pomiaru absorbancji przez 4 min (dla każdego z przygotowanych stężeń substratu).
W uzyskanym preparacie oznaczono również zawartość białka metodą Bradford.

Wyniki
Tabela1
Wyniki absorbancji dla poszczególnych stężeń substratu.

A^1cm340nm
0,6mM
0,178
0,389
0,516
0,607
0,663

Z molowego współczynnika absorpcji:
1M - 6220A
1mM - 6,22A

1µmol/ml - 6,22A
x - 0,33A
x=0,053 1µmol/ml

Enzym rozcieńcza się 16,25x
x*16,25=0,0531 µmol/ml*16,25=0,86 µmol/4min/ml=0,215 µmol/min/ml

Aktywność enzymu dla pozostałych stężeń substratu obliczano w analogiczny sposób.
Aktywność dehydrogenazy izocytrynianowej

[S] [mM]	tink [min]	∆A	v [µmol/min/ml]
0,05	4	0,083	0,215
0,1		0,088	0,229
0,2		0,099	0,257
0,3		0,094	0,244
0,4		0,099	0,257
0,5		0,119	0,310
0,6		0,121	0,315

Obliczanie stężenia białka w próbie

Nr. Próby	A^1cm595nm
1	0,196
2	0,192

Aśr=0,194

C=A_śr^1cm_595nm*k*50*10=3589µg/ml=3,589 mg/ml

$$Akt.\ wlasciwa = \frac{0,215\ umol/min/ml}{3,589\ mg/ml} = 0.06jednostek\ enzymu\ na\ mg\ bialka\backslash n$$

[S] [mM]	v [µmol/min/ml]	c [mg/ml]	v/c [U/mg]
0,05	0,215	3,589	0,06
0,1	0,229		0,063
0,2	0,257		0,071
0,3	0,244		0,068
0,4	0,257		0,072
0,5	0,310		0,086
0,6	0,315		0,088

Tabela do wykresu nr.1

[S] [mM]	v [µmol/min/ml]
0,05	0,215
0,1	0,229
0,2	0,257
0,3	0,244
0,4	0,257
0,5	0,310
0,6	0,315

Wykres nr.1
Wykres zależności szybkości reakcji v od stężenia substratu [S]

Tabela nr.2

[1/S] [mM]	1/v [µmol/min/ml]
20	4,65
10	4,37
5	3,89
3,33	4,09
2,5	3,89
2	3,23
1,66	3,17

Wykres zależności 1/v od 1/S

Tabela nr.3

v [µmol/min/ml]	log [S]	log v/(Vmax-v)
0,215	-1,3	0,33
0,229	-1	0,43
0,257	-0,69	0,65
0,244	-0,52	0,54
0,257	-0,39	0,65
0,310	-0,3	1,79
0,315	-0,22	2,49

Wykres zależności log v/(V_max-v) od log [S]

Wsp. Hilla=1,9391/1,28=1,51

K=0,011749mM

Log[S]₅₀=-1,28

[S]₅₀=0,052481mM

Wnioski
Uzyskane wartości pomiarów absorbancji i obliczona szybkość reakcji odbiegają od wartości przewidywanych, co może wynikać z błędu pomiarowego. Współczynnik Hilla wyznaczony na podstawie wykresu zależności log v/(V_max-v) od log [S] jest równy 1,5 o wskazuje na to że dehydrogenaza izocytrynianowa jest enzymem allosterycznym.