© Borgis - Postępy Fitoterapii 2/2007, s. 66-70

*Anna Kędzia

Ocena działania przeciwbakteryjnego olejku goździkowego ( Oleum Caryophylli)

Evaluation of antibacterial activity of clove oil (oleum caryophylli)

Katedra Mikrobiologii i Zakład Mikrobiologii Jamy Ustnej Akademii Medycznej w Gdańsku
Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. Anna Kędzia

Summary
The sensitivity to clove oil (Avicenna-Oil) 68 strains of anaerobic bacteria isolated from patients with infections of oral cavity was determined by means of plate dilution technique in Brucella agar supplemented with 5% defibrynated sheep blood, menadione and hemin. Inoculum containing 10⁶ CFU per spot was seeded with Steers replicator upon the surface of agar with oil and the plate without oil (strains growth control). Incubation the plates was performed in anaerobic conditions in anaerobic jar for 48 h in 37°C. The MIC was defined as the lowest concentration of the clove oil inhibiting the growth of anaerobes. The results of investigations indicated, the most sensitive to oil from Gram-negative rods were the strains from the genera of Fusobacterium. MIC for 50% of these strains were to the concentrations within the ranges from ≤0.06 do 0.5 mg/ml. The strains from the genera of Porphyromonas were the lowest sensitive to oil. The growth of the strains were inhibited by concentrations within the ranges of 0.5-≥2.0 mg/ml. The oil was very active against the Gram-positive anaerobic bacteria. The concentrations in ranges ≤0.06-0.5 mg/ml inhibited the growth of 62% the cocci and 57% the rods.

Key words: anaerobic bacteria, infection of oral cavity, susceptibility, clove oil.

Polecane książki z księgarni medycznej BORGIS:

Interdyscyplinarność procesu wczesnej interwencji wobec dziecka i jego rodziny	Prastara terapia jajem oraz konchowanie uszu	Promocja zdrowia dziś i perspektywy jej rozwoju w Europie

Ludzie interesowali się roślinnymi substancjami zapachowymi od zamierzchłych czasów. Potwierdzają to wykopaliska prowadzone na terenach państw starożytnych (Grecji, Rzymu, Egiptu, Indii i Chin). Hipokrates (460-377 p.n.e.), Dioskurides (I w n.e.), Galen (131-201) Avicenna (980-1037) w swoich dziełach opisali działanie takich roślin oraz zastosowanie w lecznictwie. Goździki od wielu wieków były stosowane jako przyprawa korzenna.

Olejek goździkowy uzyskiwany jest z pąków kwiatowych wiecznie zielonego drzewa goździkowego Eugenia caryophyllata Thunenberg (Myrtaceae) (1). Eugenia (słowo pochodzenia łacińskiego) i caryophyllus (słowo pochodzenia greckiego) oznaczają liście orzecha, a pąki drzewa wyglądem przypominają orzechy. Natomiast nazwa clove (od łacińskiego słowa clavus, oznaczającego gwóźdź) odnosi się do kształtu pąków. Roślina może osiągać powyżej 15 metrów wysokości. Rośnie na Sumatrze, Madagaskarze, Zanzibarze, Wyspach Mauritius i na Seszelach. Najlepsze goździki pochodzą z Tanzanii. Goździki jako przyprawa były znane w Chinach jeszcze przed 266 r. p.n.e. W 1970 r. we Francji rozpowszechniła się uprawa drzewa na wyspie Mauritius i Reunion. Drzewo to pochodzi z Filipin i obecnie uprawiane jest w wielu krajach zlokalizowanych w strefie podzwrotnikowej. Olejek goździkowy otrzymywany jest z pąków kwiatowych na drodze destylacji z parą wodną. Głównym składnikiem olejku jest eugenol (ok. 95%) i jego izomer izoeugenol. Zawiera też izomeryczne węglowodory seskwiterpenowe, tj. α-kariofilen (o budowie monocyklicznej) i β-kariofilen (o strukturze dicyklicznej), aldehyd i kwas benzoesowy oraz terpeny (α- i β-pinen, limonen) (2). Olejek goździkowy może być też pozyskiwany przez destylację szypułek i liści rośliny, jednak jest on wtedy gorszej jakości (1).

Olejek goździkowy charakteryzuje się działaniem antyseptycznym i przeciwbólowym. Znalazł zastosowanie w leczeniu reumatyzmu, artretyzmu, zakażeń górnych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego. W terapii często wykorzystywany jest jako środek przeciwbakteryjny w stanach zapalnych błony śluzowej jamy ustnej, gardła, nosa, przy przeziębieniach i katarze (w formie inhalacji i aerozoloterapii). Olejek goździkowy wchodzi w skład następujących preparatów: Amol, Aromatol, Argol, Olbas, Soma i Salviasept. Ponadto olejek goździkowy i otrzymywany z niego eugenol jest stosowany w stomatologii, głównie jako środek odkażający i przeciwbólowy (miejscowo znieczulający). Eugenol jest skladnikiem past mumifikacyjnych i past używanych do wypełnień kanałów korzeniowych zębów (preparaty Caryosan i Endomethazone). Eugenol w połączeniu z tlenkiem cynku tworzy pastę używaną do pośredniego przykrycia miazgi i opatrunku stosowanego w leczeniu endodontycznym. Olejek goździkowy jest też dodawany do maści rozgrzewających oraz do niektórych leków w celu poprawienia zapachu. Ma również zastosowanie w przemyśle spożywczym i kosmetycznym.

Przeprowadzone przez różnych autorów badania wykazały, że olejek goździkowy działa przeciwbakteryjnie (2, 4-13). Doświadczenia nad przeciwdrobnoustrojową aktywnością olejków eterycznych były prowadzone w Instytucie Pasteura już w XIX wieku (14). Chamberland w 1887 r. badał wpływ wyciągu z oregano, cynamonu i goździków na laseczki z gatunku Bacillus anthracis (14). Udowodnione zostało działanie ekstraktów z goździków wobec różnych patogennych bakterii, w tym Campylobacter jejuni, Salmonella enteritidis, Escherichia coli oraz Staphylococcus aureus (4, 7, 16, 17). Badania Ogunwande i wsp. (8) wykazaly, że olejek uzyskany z goździków działa silniej na ziarniaki z gatunku Staphylococcus aureus, a olejek otrzymany z liści jest bardziej aktywny wobec laseczek z gatunku Bacillis cereus. W doświadczeniach przeprowadzonych przez Enzo i wsp. (9) olejek goździkowy hamował wzrost metycylinoopornych szczepów z gatunku Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus aureus.Wyniki badań różnych autorów wskazują, że dużą wrażliwością na olejek goździkowy charakteryzują się zarówno bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne (18, 19). Są też takie dane, które tego zjawiska nie potwierdzają (20, 23).

Wykazano ponadto, że olejek goździkowy i eugenol są wysoce aktywne wobec grzybów drożdżopodobnych i pleśniowych. Olejek wykazuje też aktywność wobec dermatofitów (3). W porównawczych badaniach działania przeciwgrzybiczego olejków eterycznych stwierdzono, że olejek goździkowy wykazuje 8 razy silniejsze działanie w porównaniu z fenolem, a olejek lawendowy jest tylko 1,6 razy silniejszy. Według Coxa i wsp. (23) głównym miejscem działania olejku jest ściana komórkowa. Założenie to potwierdzają obserwacje komórek grzybów w mikroskopie elektronowym, które wcześniej poddano działaniu olejku (6). Hussein i wsp. (15) opisali działanie olejku przeciw wirusom zapalenia wątroby typu C, a Kurokawa i wsp. (17) aktywność eugeniny otrzymanej z wyciągu goździków wobec wirusów Herpes (HSV-1).

Niektóre badania wskazują też na korzystne antyoksydacyjne właściwości głównego składnika olejku goździkowego – eugenolu (24, 25). Opisano też antykarcinogenne działanie olejku goździkowego (26). Badania dotyczyły ludzkich komórek lini PC-3 i Hep G 2 (8, 27).

Kolejni autorzy – Yang i wsp. (28) oraz Trongtokit i wsp. (29), wykazali insektobójcze działanie olejku goździkowego.

Przeprowadzone wcześniej badania wskazały na znaczną aktywność olejku goździkowego wobec różnych bakterii, szczególnie tlenowych. Sporadycznie publikacje dotyczą bakterii rosnących w warunkach beztlenowych, które często uczestniczą w zakażeniach.

Celem badań była ocena działania olejku goździkowego na bakterie beztlenowe wyizolowane z zakażeń występujących w obrębie jamy ustnej.

Materiał i metody

Materiały pobrano od pacjentów z różnymi zakażeniami w obrębie jamy ustnej. Materiały posiewano na powierzchni podłoża wzbogaconego i kilku podłoży wybiórczych dla beztlenowców (30, 31). Inkubację podłoży prowadzono przez 10 dni w 37°C w anaerostatach zawierających 10% CO₂, 10% H₂ i 80% N₂, katalizator palladowy i wskaźnik beztlenowości. Bakterie beztlenowe identyfikowano zgodnie z obowiązującymi zasadami (30, 32), z uwzględnieniem zmian taksonomicznych (33-35). Zbadano cechy morfologiczne, fizjologiczne i biochemiczne bakterii, obejmujące testy API 20A (bioMerieux), wytwarzanie z glukozy kwasów tłuszczowych (od C₁ do C₆), kwasu mlekowego i bursztynowego oraz zdolność kolonii do naturalnej fluorescencji w promieniach UV.

Ocenie wrażliwości poddano 74 szczepy bakterii należących do rodzajów: Prevotella (16 szczepów), Porphyromonas (4), Bacteroides (8), Fusobacterium (10), Veillonella (2), Micromonas (8), Finegoldia (3), Ruminococcus (4), Anaerococcus (4), Peptostreptococcus (2), Propionibacterium (4), Actinomyces (3 szczepy) oraz 6 szczepów wzorcowych, w tym Bacteroides fragilis ATCC 25285, Bacteroides ovatus ATCC 8483, Bacteroides vulgatus ATCC 8482, Fusobacterium nucleatum ATCC 25585, Propionibacterium acnes 11827 i Peptostreptococcus anaerobius ATCC 27337. Badania wrażliwości (MIC) bakterii beztlenowych na olejek goździkowy (Avicenna-Oil, Wrocław) przeprowadzono metodą seryjnych rozcieńczeń w agarze Brucella z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej, menadionu i heminy. Olejek goździkowy rozpuszczano w DMSO (Serva), otrzymując stężenie 100 mg/ml. Dalszych rozcieńczeń dokonywano w jałowej wodzie destylowanej. Do badań użyto stężeń wynoszących: 2,0, 1,0, 0,5, 0,25, 0,12 i 0,06 mg/ml. Inoculum zawierające 10⁶ CFU na kroplę, nanoszono na powierzchnię podłoża aparatem Steersa. Podłoże bez olejku stanowiło kontrolę wzrostu szczepów. Inkubację podłoży prowadzono w warunkach beztlenowych w anaerostatach w temp. 37°C przez 48 godzin. Za MIC uznano najmniejsze stężenie olejku goździkowego, które hamowało wzrost bakterii beztlenowych.

Wyniki i omówienie

Uzyskane wyniki wrażliwości Gram-ujemnych bakterii beztlenowych na olejek goździkowy zebrano w tabeli 1, a wyniki Gram-dodatnich bakterii w tabeli 2.

Tabela 1. Wrażliwość Gram-ujemnych bakterii beztlenowych na olejek goździkowy.

Drobnoustroje	Liczba szczepów	Najmniejsze stężenie hamujące (MIC w mg/ml)
		≥2,0
Prevotella orali	3	1
Prevotella intermedia	5	1
Prevotella denticola	2
Prevotella bivia	6	2
Porphyromonas asaccharolytica	2	1
Porphyromonas gingivalis	2	1
Tannerella forsythensis	4	2
Bacteroides fragilis	4	1
Fusobacterium nucleatum	8	2
Fusobacterium necrophorum	2
Gram-ujemne pałeczki (łącznie)	38	11
Veillonella parvula	2
Gram-ujemne bakterie (ogółem)	40	11

Tabela 2. Wrażliwość Gram-dodatnich bakterii beztlenowych na olejek goździkowy.

Drobnoustroje	Liczba szczepów	Najmniejsze stężenie hamujące (MIC w mg/ml)
		≥2,0
Finegoldia magna	3
Micromonas miros	8	1
Ruminococcus productus	4	2
Anaerococcus prevotii	4
Peptostreptococcus anaerobius	2
Gram-dodatnie ziarniaki ogółem	21	3
Actinomyces israelii	3
Propionibacterium acnes	4	1
Gram-dodatnie pałeczki (ogółem)	7	1
Gram-dodatnie bakterie (ogółem)	28	4

Wśród Gram-ujemnych pałeczek największą wrażliwością na olejek charakteryzowały się szczepy z rodzaju Fusobacterium (tab. 1). Połowa tych szczepów wykazała wrażliwość w niskich stężeniach, w zakresie ≤0,06-0,5 mg/ml. Także 50% ziarniaków z rodzaju Veillonella wykazało wrażliwość w tak niskich stężeniach. Niższą aktywność wykazał oceniany olejek goździkowy wobec szczepów z rodzaju Prevotella i Bacteroides. W stężeniach wynoszących ≤0,06-0,5 mg/ml wrażliwość wykazało 38% szczepów. Natomiast tylko 25% szczepów z rodzaju Porphyromonas było wrażliwych na wymienione wyżej stężenia olejku goździkowego.

Oceniane Gram-dodatnie bakterie beztlenowe wykazały dużą wrażliwość na olejek (tab. 2). Wzrost 62% szczepów ziarniaków był hamowany w zakresie niskich stężeń (MIC ≤0,06-0,5 mg/ml). Najbardziej skutecznie olejek działał na szczepy z gatunku Peptostreptococcus anaerobius (100% szczepów wrażliwych w stężeniu 0,06 mg/ml lub niższym). Dużą wrażliwość wykazały też szczepy z gatunku Anaerococcus prevotii, Finegoldia magna i Micromonas micros. Stężenia wynoszące ≤0,06-0,5 mg/ml hamowały odpowiednio wzrost 75% i 63% szczepów.

Wysoką wrażliwością charakteryzowały się także szczepy Gram-dodatnich pałeczek z gatunku Propionibacterium acnes.Połowa wymienionych pałeczek była wrażliwa na niskie stężenia olejku goździkowego w zakresie ≤0,06-0,5 mg/ml.

Z badań innych autorów wynika, że bakterie Gram-dodatnie, zarówno tlenowe i beztlenowe, wykazują znaczną wrażliwość na różne olejki, w tym olejek goździkowy (MIC w zakresie stężeń 0,2-1,4 mg/ml) (5). Saeki i wsp. (36) badając działanie różnych substancji roślinnych na bakterie jamy ustnej rosnące w warunkach tlenowych, tj. Streptococcus sp., Actinobacillus sp., Capnocytophaga sp., Eikenella sp. oraz bakterie beztlenowe z rodzaju Actinomyces, Bacteroides, Fusobacterium i Propionibacterium wykazali działanie hamujące wzrost bakterii przez olejek goździkowy. Natomiast szczepy z rodzaju Bifidobacterium, wyizolowane z ubytków próchnicowych, oceniane przez Crocianiego i wsp. (37) były wrażliwe na olejek w zakresie stężeń od 0,6-1,4 mg/ml. Jeszcze bardziej na olejek goździkowy były wrażliwe szczepy laseczek z gatunku Clostridium botulinum (MIC = 0,1 mg/ml) (38).

Podsumowując wyniki należy zaznaczyć, że Gram-dodatnie drobnoustroje beztlenowe były bardziej wrażliwe na olejek niż bakterie Gram-ujemne (MIC w zakresie ≤0,06-0,5 mg/ml), odpowiednio dla 47 i 40% szczepów.

Wnioski

1. Spośród Gram-ujemnych bakterii największą wrażliwość na olejek goździkowy wykazały szczepy z rodzaju Fusobacterium, a najniższą szczepy z rodzaju Porphyromonas.

2. Gram-dodatnie bakterie beztlenowe charakteryzowały się wysoką wrażliwością na olejek goździkowy.

3. Bakterie Gram-dodatnie okazały się bardziej wrażliwe na olejek goździkowy niż bakterie Gram-ujemne.

Polecane książki z księgarni medycznej BORGIS:

Właściwe i smaczne żywienie korzystne dla wątroby i dróg żółciowych	Druga twarz tlenu	Encyklopedia zdrowia dla całej rodziny

Piśmiennictwo

1. Brud W.S., Konopacka I.: Pachnąca apteka. Wyd. Pagina. Warszawa 1998. 2. Chaieb K., Hajlaoni H., Zantar T. i wsp.: The chemical composition and biological activity of clove essential oil, Eugenia caryophyllata ( Syzigium aromaticum L. Myrtaceae): A short review. Phytother. Res. 2007, 21, 501. 3. Lutomski J., Alkiewicz J.: Leki roślinne w profilaktyce i terapii. PZWL 1993. 4. Friedman M., Henika P.R., Mandrell R.E.: Bactericidal activities of plant essential oils and some of their isolated constituents against Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica. J. Food Prot. 2002, 65, 1545. 5. Kalemba D., Kunicka A.: Antibacterial and antifungal properties of essential oils. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 813. 6. Chami F., Chami N., Bennis S. i wsp.: Oregano and clove essential oils induce surface alternation of Saccharomyces cerevisiae. Phytother. Res. 2005, 19, 405. 7. Feres M., Figueiredo L.C., Barreto I.M. i wsp.: In vitro antimicrobial activity of plant extracts and propolis in saliva samples of healthy and periodontally involved subjects. J. Int. Acad. Periodontol. 2005, 7, 90. 8. Ogunwande I.A., Olawore N.O., Ekundayo O. i wsp.: Studies on the essential oils composition, antibacterial and cytotoxicity of Eugenia uniflora L. Int. J. Aromather. 2005, 15, 147. 9. Enzo A.P., Susan J.S.: Antibacterial activity of Australian plant extracts against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant enterococci (VRE). J. Basic Microbiol. 2002, 42, 444. 10. Boonchird C., Flegel T.W.: In vitro antifungal activity of eugenol and vanillin against Candida albicans and Cryptococcus neoformans. Can. J. Microbiol. 1982, 28, 1235. 11. Harris R.: Progress with superficial mycoses using essential oils. Int. J. Aromather. 2002, 12, 83. 12. Velluti C., Sanchis V., Ramos A.J. i wsp.: Impact of essential oil on growth rate, zearalenone and oleoxynivalenol production by Fusarium graminearum under different temperature and water activity condition in maize grain. J. Appl. Microbiol. 2004, 96, 716. 13. Pawar V.C., Thaker V.S.: In vitro efficacy of 75 essential oils against Aspergillus niger. Mycoses 2006, 49, 316. 14. Inouye S.: Laboratory evaluation of gaseous essential oils (part 1). Int. J. Aromather. 2003, 13, 2/3, 95. 15. Hussein G., Miyashiro H., Nakamura N. i wsp.: Inhibitory effects of Sudanese medical plant extracts on hepatitis C virus (HCV) protease. Phytother. Res. 2000, 14, 510. 16. Burt S.A., Reinders R.D.: Antibacterial activity of selected plant essential oils against Escherichia coli 0157:H7. Lett. Appl. Microbiol. 2003, 36, 162. 17. Kurokawa M., Hozumi T., Basnet P. i wsp.: Purification and characterization of eugeniin as an anti-herpesvirus compound from Geum japonicum and Syzygium aramaticum. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998, 284, 728. 18. Larhsini M., Oumoulid L., Lazarek H.B. i wsp.: Antibacterial activity of some Maroccan medicinal plants. Phytother. Res. 2001, 15, 250. 19. Perez C., Agnese A.M., Cabrera J.L.: The essential oil of Senecio graveolens ( Compositae): chemical composition and antimicrobial activity tests. J. Ethnopharmacol. 1999, 66, 91. 20. Bagamboula C.F., Uyttendaele M., Debevere J.: Inhibitory effect of thyme and basil essential oils, carvacrol, thymol, estragol, linalool and p-cymene towards Shigella sonnei and S. flexneri. Food Microbiol. 2004, 21, 33. 21. Zaika L.L.: Species and herbs: their antimicrobial activity and its determination. J. Food Nutr. 1988, 9, 97. 22. Smith-Palmer A., Steward J., Fyte L.: Antimicrobial properties of plant essential oils and essences against five important food-borne pathogens. Lett. Appl. Microbiol. 1998, 26, 118. 23. Cox S.D., Mann C.M., Markham J.L.: Interactions between compounds of the essential oil of Melaleuca alternifolia.J. Appl. Microbiol. 2001, 91, 492. 24. Ogata M., Hoshi M., Urano S., Endo T.: Antioxidant activity of eugenol and related monomeric and dimeric compounds. Chem. Pharm. Bull. 2000, 48, 1467. 25. Gulcin I., Gungor I., Beydemir S.S., i wsp.: Comparison of antioxidant activity of clove ( Eugenia caryophyllata Thumb.) buds and lavender ( Lavandula stoechas L.). Food Chem. 2004, 87, 393. 26. Zheng G.Q., Kenney P.M., Lam L.K.T.: Sesquiterpenes from clove ( Eugenia caryophyllata). J. Nat. Prid. 1992, 55, 999. 27. Yoo C.B., Han K.T., Cho K.S. i wsp.: Eugenol isolated from the essential oil of Eugenia caryophyllata induces a reactive oxygen species-mediated apoptosis in HL-60 human promyelocytic leukemia cells. Cancer Lett. 2005, 225, 41. 28. Yang Y.C., Lee S.H., Lee W.I. i wsp.: Ovicidal and adulticidal effects of Eugenia caryophyllata bud and leaf oil compounds on Pediculus capitis. J. Agricult. Food Chem. 2003, 51, 4884. 29. Trongtohit Y., Rongsiyam Y., Komalamisra N., Apiwathnasorn C.: Comparative repellency of 38 essential oils against mosquito bites. Phytother. Res. 2005, 19, 303. 30. Holdeman L.V., Cato E.P., Moore W.E.C.: Anaerobe Laboratory Manual. V.P.I. Blacksburg 4^th ed. Baltimore M.D., Virginia 1977. 31. Kałowski M., Kędzia A.: Nieprzetrwalnikujące drobnoustroje beztlenowe. W: Diagnostyka mikrobiologiczna w medycynie. (red. W. Kędzia). PZWL, Warszawa 1990. 32. Holt J.G.: Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Williams and Wilkins ed. 9^th ed. Baltimore M.D. 1993. 33. Forbes B.A., Sahm D.F., Weissfeld A.S.: Bailey and Scott&acutes Diagnostic Microbiology. 12^th ed. Mosby Elsevier. St. Louis 2007. 34. Murdoch D.A., Shah H.N.: Reclassification of Peptostreptococcus magnus (Prevot 1933), Holdeman and Moore 1972 as Finegoldia magna comb. nov. and Peptococcus micros (Prevot 1933) Smith 1957 as Micromonas micros comb. nov. Anaerobe 1999, 5, 555. 35. Olsen I., Shah H.N.: Review and outcome of the Meetings held Manchester U.K., June 2000, by the Intarnational Committee on the Systematic of Prokaryotes Subcommittee on the Taxonomy of Gram-negative Anaerobe Rods. Anaerobe 2001, 7, 329. 36. Saeki Y., Ito Y., Shibata M. i wsp.: Antimicrobial action of natural substances on oral bacteria. Bull Tokyo Dent. Coll. 1989, 30, 129. 37. Grociani F., Biavati B., Alessandrini A., Zani G.: Growth inhibition of essential oils and other antimicrobial agents towards Bifidobacterium from dental caries. 27^th Int. Symp. on Essential Oils. 1996, Vienna, 40. 38. Ismail A.A., Pierson M.D.: Effect of sodium nitrite and origanum oil on growth and toxin production Clostridium botulinum in TYG broth and ground pork. J. Food Prot. 1990, 53, 958.

Adres do korespondencji:
*Anna Kędzia
Zakład Mikrobiologii Jamy Ustnej Akademii Medycznej w Gdańsku
ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdańsk
tel. [phone]
e-mail: [e-mail]

Postępy Fitoterapii 2/2007