Przedmiot: Nowoczesne Metody Analizy Żywności – temat VI

Zakres realizowanej tematyki:

Teoretyczne i praktyczne zapoznanie z zasadą działania sprzętu do analizy HPLC (wysokosprawnej chromatografii cieczowej), omówienie znaczenia poszczególnych modułów urządzenia i ich udziału w analizie żywności. Zasady chromatograficznego rozdziału karotenoidów. Ekstrakcja, oznaczenie jakościowe (identyfikacja) oraz ilościowe barwników karotenoidowych w wybranych warzywach i owocach z produkcji ekologicznej i konwencjonalnej.

Prowadzący ćwiczenia: dr inż. Ewelina Hallmann

1. Podstawa teoretyczna ćwiczeń – chromatografia cieczowa

Chromatografia cieczowa, LC (ang. Liquid Chromatography) lub jej bardzie nowocześniejsza wersja Wysokosprawna Chromatografia Cieczowa HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography) – to zaawansowana metoda analityczna (oznaczanie ilościowe i jakościowe związków) lub preparatywna (przygotowywanie i oczyszczanie wzorców) stosowana w chemii. W chromatografii tej eluentem (nośnikiem) jest ciecz (zwykle jakiś rozpuszczalnik organiczny). Istotą każdej analizy chromatograficznej w systemie cieczowym jest rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny przez stałe lub żelowe złoża, podobnie jak w procesie sączenia. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami tworzącymi mieszaninę i złożem, jedne z nich przechodzą przez złoże szybciej, a inne wolniej.

Istnieje bardzo wiele rodzajów chromatografii cieczowej, które można podzielić na trzy ogólne rodzaje:

chromatografia cienkowarstwowa (TLC) z ang. Thin Lyer Chromatography - w której złoże (zwykle żel krzemionkowy) jest nałożone na płytkę szklaną lub plastikową w postaci cienkiej, sprasowanej formy. Rozdział następuje poprzez powolne wnikanie roztworu w złoże w specjalnej komorze na zasadzie podchodzenia (przenikania cieczy nośnika) w złoże płytki szklanej. Identyfikacja związków odbywa się na podstawie rozwiniętego chromatogramu (plam, znaczników) w porównaniu do znanego wzorca (standardu).

Zależnie od rodzaju mieszaniny którą chcemy rozdzielić, poszczególne związki chemiczne - składniki rozdzielanej mieszaniny przesuwają się na różną odległość na płytce (lub na różną wysokość) w zależności od usytuowania płytki (pokonaną drogę określamy mianem współczynnika Rf z ang. response factor). Ważną cechą TLC jest znajomość współczynnika Rf, co znacznie ułatwia identyfikację poszczególnych związków. Natomiast równomierność rozmieszczenia plam substancji można charakteryzować ilościowo tzw. funkcjami CRF (chromatographic response functions). W przypadku, gdy rozdzielone związki z mieszaniny nie są zabarwione, ich obecność można stwierdzić używając, zależnie od ich właściwości, światła UV (wkładamy płytki do specjalnej komory i podświetlamy lampą UV),. Można też zastosować roztwory wywołujące (identyfikujące). Płytka z rozdzielanymi substancjami jest zanurzana w takich roztworach lub używamy takiego roztworu jako spryskiwacza na identyfikowanej powierzchni. Identyfikatory wywołują barwny, charakterystyczny dla związku kompleks i na podstawie barwy i usytuowania plamy można zidentyfikować badany związek chemiczny. Chromatografię TLC stosuje się głównie do jakościowej identyfikacji związków chemicznych, chociaż istnieją możliwości również ilościowego oznaczenia rozdzielonych związków.

chromatografia kolumnowa (Column Chromatography). Jest to jedna z metod chromatograficznych. Polega na rozdzieleniu mieszaniny poprzez wprowadzenie jej na stałą fazę stacjonarną (adsorbent) zazwyczaj złoże jest w postaci krzemionki lub glinokrzemionki umieszczonych w cylindrycznej kolumnie o określonej długości (wysokości) i rozdzieleniu jej na składniki przy użyciu ciekłej fazy ruchomej (eluentu, czy fazy ruchomej), wprowadzanej z odpowiedniego zbiornika lub dolewanej bezpośrednio na kolumnę. Przepływ eluentu może być grawitacyjny (gdy pozwalamy swobodnie przenikać cieczy w dół kolumny i wymywać z niej cząstki rozdzielanej mieszaniny) lub wymuszony przez zastosowanie pompy próżniowej Składniki mieszaniny przemieszczają się ku dołowi kolumny z szybkością zależną od siły oddziaływań ich cząsteczek z adsorbentem. Siła tych oddziaływań zależy od budowy cząsteczek, dlatego poszczególne składniki mieszaniny przemieszczają się z różną szybkością. Dzięki temu rozdzielone składniki można kolejno odbierać na dole kolumny. Odparowanie rozpuszczalnika z odpowiednich porcji wycieku (frakcji) pozwala na uzyskanie czystych składników mieszaniny. Metoda chromatografii kolumnowej ma zastosowanie w jakościowym i ilościowym oznaczaniu związków chemicznych. W zależności od wielkości kolumn i ilości rozdzielanego materiału chromatografia kolumnowa może być wykonywana w skali analitycznej, laboratoryjnej (półpreparatywnej, preparatywnej) i przemysłowej.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa, HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography) – odmiana chromatografii cieczowej, technika analityczna a także preparatywna, stosowana do oczyszczania, badania czystości oraz identyfikacji związków chemicznych. Jest to bardzo nowoczesny rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Oznacza to, że analizowana próbka jest rozpuszczana w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku (ekstraknancie), zależnym od właściwości substancji i zastosowanego układu (czasem jako ekstraknant stosuje się fazę ruchomą) i w formie roztworu o znanym stężeniu i objętości jest kierowana na kolumnę, która wypełniona jest specjalnym złożem porowatym lub żelowym. Rolę cieczy nośnej (fazy ruchomej lub mobilnej) pełni odpowiednio dobrana mieszanina (tzw. eluent). Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. W zależności od zastosowanego układu można wyróżnić kilka mechanizmów retencji, np. te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe powinowactwo do złoża) a słabiej z fazą ruchomą, przepływają wolniej przez kolumnę, zaś związki chemiczne, które oddziałują słabiej ze złożem a silniej z fazą ruchomą przepływają szybciej. W pewnych specyficznych układach HPLC mechanizmy retencji są jednak bardziej złożone.

HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atm. Wysokie ciśnienie w układzie HPLC wynika z budowy pomp HPLC (wąskie przekroje kapilar), uziarnienia wypełnienia kolumn (kilka mikrometrów) i przepływu fazy ruchomej stosowanego w aplikacji(od ułamków ml/min do nawet kilkudziesięciu ml/min w przypadku chromatografii preparatywnej). Drobne uziarnienia złoża fazy stacjonarnej skutkuje korzystniejszymi parametrami sprawności i rozdzielczości układu HPLC dzięki czemu uzyskujemy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eluenta i mniejszej ilości analizowanej próbki niż w klasycznej chromatografii kolumnowej. Zdolności rozdzielcze współczesnych aparatów i kolumn HPLC są niekiedy porównywalne do zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej.

W HPLC duże znaczenie dla rozdziału ma polarność faz. Początkowo stosowano normalny układ faz (NP), w którym faza stacjonarna jest znacznie bardziej polarna niż faza ruchoma (Np. układ: żel krzemionkowy – heksan). Obecnie najczęściej stosuje się odwrócony układ faz (RP – układ faz odwróconych), w którym faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, np. układ: żel krzemionkowy z chemicznie modyfikowaną powierzchnią (grupy oktadecylosilanowe, oktylosilanowe, diole, podstawniki modyfikowane i inne, bardziej złożone) – mieszanina metanolu, acetonitrylu, wody, specjalnie dobranych buforów itp. Podział zależy od wiązania się hydrofobowych cząsteczek substancji rozpuszczonej z fazy ruchomej do unieruchomionych, hydrofobowych ligandów związanych z fazą stacjonarną. Siła i charakter oddziaływania między cząsteczkami próbki i fazą stacjonarną zależy zarówno od oddziaływań hydrofobowych jak i oddziaływań polarnych. Substancje rozpuszczone są wymywane w kolejności rosnącej molekularnej hydrofobowości. Układy RP mają bardziej trwałe wypełnienia, cechują się niższym kosztem fazy ruchomej a przede wszystkim cechują się inną selektywnością niż układy NP co wykorzystuje się w analizie próbek o dużej rozpiętości polarności komponentów.

2. Podstawa teoretyczna ćwiczeń – barwniki fotosyntetyczne

Karotenoidy

Są to związki organiczne (pochodne izoprenu), węglowodory nienasycone o długich 40-sto węglowych łańcuchach. W naturze mają zdolność do absorbowania światła widzialnego o długości fali 440-480 nm, dlatego mają barwę od żółtej, przez pomarańczową do czerwonej. U roślin zlokalizowane są w chromoplastach oraz w chloroplastach, gdzie pełnia odmienne funkcje. Karotenoidy dzielimy na karoteny o barwie pomarańczowej i czerwonej oraz ksantofile o barwie żółtej.

Znaczenie karotenoidów dla człowieka:

• Wpływają na obniżenie poziomu cholesterolu we krwi, a co za tym idzie korzystnie działa na serce.

• Pomagają w zwiększeniu odporności naszego organizmu, chroniąc nas w ten sposób przed chorobami, dotyczy to zwłaszcza beta-karotenu, który stymuluje zwiększenie liczby limfocytów, będących składnikami naszego układu immunologicznego.

• Wykazują działanie przeciwnowotworowe. Głównie dzięki temu, iż działają jako "zmiatacze wolnych rodników" są więc świetnymi antyutleniaczemi.

• Betakakaroten ma szczególnie duże znaczenie w zapobieganiu pewnym postaciom raka skóry, pojawiającym się pod wpływem promieniowania UV lub substancji chemicznych.

Znaczenie karotenoidów dla roślin:

• Związki te pełnią pomocniczą rolę w procesie fotosyntezy, ponieważ absorbują pewne zakresy promieniowania świetlnego (niebieska, fioletowa) aby następnie przekazywać energię stanu wzbudzonego na cząsteczkę chlorofilu.

• Pełnią również funkcję ochronną przed procesami fotooksydacji, na które narażone są głównie nienasycone kwasy tłuszczowe lipidów chloroplastowych. W liściach, ich barwa jest maskowana przez zieloną barwę barwników chlorofilowych, uwidocznia się to jesienią, kiedy chlorofile są degradowane przez enzymy: chlorofilazę, decheletazę i oksygenazę

• Przykładem karotenoidu jest β-karoten. Karotenoidy nadają również barwę innym częściom rośliny, np. korzeniowi marchwi czy owocom moreli

• Ponadto spełniają ważną rolę ochronną przed uszkodzeniem fotosystemu spowodowanym nadmiarem docierającej energii świetlnej, pochłaniając ją i powodując jej dyspersję (czyli rozproszenie) albo też przekierowując na inne procesy fizjologiczne w komórce.

Warzywa i owoce jako źródło poszczególnych karotenoidów:

Karoteny

(Likopen): pomidor i jego przetwory (sos, sok, ketchup), arbuz, morele, czerwona pomarańcza, czerwony grapefruit

(beta-karoten): dynia, marchew, papryka czerwona i pomarańczowa, brzoskwinie, morele, warzywa liściowe (zielone): jarmuż, kapusty biała i włoska, pietruszka liściowa

Ksantofile

(luteina i zeksantyna): kukurydza (ziarno), szpinak, jarmuż, cukinia o żółtej skórce, marchew, papryka (żółta i pomarańczowa), pomidor (żółty i pomarańczowy), dynia zwyczajna

Chlorofile

Chlorofile – to zielone barwniki charakterystyczne dla roślin, niektórych alg i bakterii, które mają zdolność przeprowadzania procesu fotosyntezy (sinice). Zielone zabarwienie chlorofilu spowodowane jest wysoką absorpcją w czerwonej i niebieskiej części spektrum światła, a niską absorpcją w zielonej części spektrum światła (długość fali 500-600 nm). Chlorofil zlokalizowany jest w chloroplastach i dzięki temu rośliny (głównie liściom, ale też łodygi i niedojrzałe owoce mają zielone zabarwienie). Wyróżniamy następujące typy chlorofili chlorofil a (algi i rośliny wyższe), chlorofil b (rośliny wyższe, niektóre bakterie fotosyntezujące, glony), chlorofil c z podziałem na dwie podgrupy c1 oraz c2 (rośliny wyższe i niektóre glony), chlorofil d (glony i bakterie). Funkcją chlorofili w organizmach przeprowadzających fotosyntezę jest wychwytywanie kwantów światła i przekazywanie energii wzbudzenia do centrum reakcji fotoukładu skąd wybijane są elektrony, spożytkowane następnie w dalszych etapach fotosyntezy. Znaczna zawartość chlorofili w organizmach fotosyntetyzujących jest odpowiedzialna za ich zieloną barwę. Wyróżnia się wiele rodzajów chlorofili. Najbardziej rozpowszechnione w przyrodzie to chlorofil a i chlorofil b występujące u wszystkich roślin przeprowadzających fotosyntezę.

Znaczenie chlorofili dla człowieka

• Chlorofil nazywany jest „roślinną krwią” ponieważ jego cząsteczka ma budowę niemal identyczną z cząsteczką hemoglobiny. Jedyna różnica to występowanie w centralnej części hemoglobiny atomu żelaza, a w chlorofilu atomu magnezu.

• Zwalcza liczne bakterie patogenne i reguluje florę jelitową, co wpływa pozytywnie na działanie jelit

• Zapobiega wzrostowi kamieni w nerkach. Zawarty w cząstce chlorofilu magnez jest antagonistą wapnia i zapobiega powstawaniu szczawianu wapnia.

• Stabilizuje ciśnienie krwi i oddychanie oraz wzmacnia mięsień sercowy

• Spowalnia proces utleniania się komórek, wskutek czego zapobiega przedwczesnemu starzeniu, jak i arteriosklerozie

• Ze względu na zdolność stabilizacji wzbudzonych elektronów eliminuje wolne rodniki, które mogą uszkadzać komórki i chroni przed szkodliwym promieniowaniem UV

• Ma zdolność chelatowania eliminuje toksyny i metale ciężkie z organizmu

Warzywa i owoce jako źródło chlorofili:

Chlorofile

szpinak, szczaw, sałata, jarmuż, generalnie wszystkie warzywa o ciemnozielonych liściach.

Zagadnienia do przygotowania na kolokwium, z tematyki nr. VI

1. Czym jest chromatografia cieczowa

2. Zasada działania komory chromatograficznej TLC

3. Porównanie metod identyfikacji związków w chromatografii TLC i CC

4. Zastosowanie chromatografii HPLC w praktyce

5. Metody identyfikacji związków w chromatografii HPLC

6. Wady i zalety chromatografii kolumnowej (otwartej) i HPLC

7. Znaczenie karotenoidów dla roślin i człowieka

8. Znaczenie chlorofili dla roślin i człowieka

9. Budowa i działanie wybranych modułów urządzenia HPLC

Przedmiot: Nowoczesne Metody Analizy Żywności – temat VII

Zakres realizowanej tematyki:

Porównanie dwóch metod analizy barwników antocyjanowych. Zasady chromatograficznego rozdziału antocyjanów. Ekstrakcja, oznaczenie jakościowe (identyfikacja) oraz ilościowe barwników antocyjanowych w wybranych owocach z produkcji ekologicznej i konwencjonalnej.

Prowadzący ćwiczenia: dr inż. Ewelina Hallmann

Antocyjany

Związki antocyjanowe nalezą do podgrupy flawonoidów, a te z kolei do olbrzymiej grupy wtórnych metabolitów roślin – związków polifenolowych. Antocyjany odróżniają się jednak ogromnie od pozostałych podgrup flawonoidów, ze względu na swoją budowę, właściwości chemiczne, występowanie oraz znaczenie środowiskowe i zdrowotne.

Budowa chemiczna

Antocyjany swoją budową zbliżone są do innych związków flawonoidowych charakteryzujących się szkieletem węglowym C6–C3–C6. Ze względu na pochodzenie chemiczne antocyjany są pochodnymi kationu flawyliowego: 2-fenylobenzopiryliowego, który może występować w dwóch postaciach: w formie karboniowej lub bardziej rozpowszechnionej oksoniowej. Wydawać by się mogło, ze antocyjany mają bardzo skomplikowaną budowę chemiczną. Jednak nie jest to do końca prawda. Pomiędzy sobą różnią się ilością i rozmieszczeniem podstawników. Generalnie antocyjany składają się z dwóch części glikonowej (cukrowej), która jest bezbarwna oraz części antocyjanidyny, która jest barwna. Struktura antocyjanów może być bardzo złożona i zróżnicowana. Barwniki antocyjanowe. Dodatkowo w produktach naturalnych antocyjany występują najczęściej w postaci mono-, di- lub triglikozydów. Antocyjany to duża grupa barwników roślinnych zaliczanych do tzw. naturalnych. substancji nieodżywczych (NSN) pochodzenia roślinnego rozpuszczalnych w wodzie. Barwniki te charakteryzują się szerokim spektrum występowania. Stanowią grupę barwników niebieskich, fioletowych, czerwonych których barwa zależy od pH roztworu. Np. jeden z tych barwników - cyjanidyna w środowisku kwaśnym (pH < 7) jest czerwona, a w obojętnym lub zasadowym ma barwę niebieską. O złożoności budowy antocyjanów świadczy fakt, iż znanych jest kilkaset naturalnych barwników tej grupy. Jednak tylko niektóre z nich znajdują się w takich ilościach, że decydują o barwie. Struktura cząsteczek antocyjanów ma istotny wpływ na odcień, intensywność oraz stabilność barwy. Zwiększenie liczby grup hydroksylowych w pierścieniu B powoduje przesunięcie maksimum absorpcji w kierunku fal długich i zmianę barwy od pomarańczowej przez czerwoną do fioletowej, natomiast zastąpienie grup hydroksylowych metoksylowymi cofa tę tendencję. Podobne działanie wywołują także procesy kopigmentacji antocyjanów i tworzenie kompleksów z metalami. Związki mogące tworzyć kopigmenty z antocyjanami to m.in. flawonoidy, polifenole, alkaloidy lub aminy oraz same antocyjany. Wynikiem kopigmentacji jest zwiększenie intensywności barwy (efekt hiperchromowy) i przesunięcie maksimum absorpcji w kierunku fal długich (efekt batochromowy). Efekt ten zależy od struktury, stosunku stężeń barwnika i kopigmentu, pH, składu rozpuszczalnika oraz temperatury środowiska.

Występowanie

Barwniki te występują w kwiatach, owocach, liściach, łodygach, a rzadziej w korzeniach i drewnie. W komórkach znajdują się w wakuolach, w postaci granulek różnej wielkości umiejscowionych w chromoplastach lub bezpośrednio w wakuoli, natomiast ściany komórkowe i tkanki miąższu nie zawierają antocyjanów. W przemyśle spożywczym barwniki zastosowano stosunkowo niedawno. Niestety jako trwalsze, tańsze i o całej gamie barw wprowadzono do barwienia żywności również barwniki syntetyczne. W przyrodzie występuje kilkaset naturalnych barwników antocyjanowych i ponad 100 otrzymanych syntetycznie.

Antocyjany swoje nazwy zawdzięczają najczęściej kwiatom, w których płatkach zostały po raz pierwszy oznaczone. Dlatego mamy takich przedstawicieli antocyjanów jak: pelargonidyna, cyjanidyna, peonidyna, delfinidyna, petunidyna, malwidyna. Nomenklatura antocyjanów pochodzi od nazwy łacińskiej rośliny, z której dany związek został wydzielony, np.: cyjanina – kwiaty bławatka (Centaurea cyanus L.), delfinina – kwiaty ostróżek (Delphinum consolida L.), fragaryna – owoce poziomki (Fragaria vesca L.). W poszczególnych gatunkach owoców lub warzyw występuje od kilku do kilkunastu antocyjanów, które charakteryzują się zróżnicowaną barwą poprzez różne odcienie czerwieni i fioletu aż do barwy niebieskiej, co uwarunkowane jest ich budową. Barwniki antocyjanowe warunkują odcień i stabilność barwy produktu, np. w owocach truskawek dominującym barwnikiem jest 3-glukozyd pelargonidyny, a w winogronach 3-glukozyd malwidyny. Obecność szczególnie dużych ilości antocyjanów stwierdzono w tkankach roślin wysokogórskich, stąd została wysunięta hipoteza, że spełniają one rolę czynnika chroniącego tkanki przed nadmiarem promieniowania UV, dlatego owoce wyeksponowane w koronie drzewa na silne promieniowanie będą zawsze zawierały więcej antocyjanów w porównaniu z owocami zacienionymi. Drugim czynnikiem wywołującym wyższą syntezę antocyjanów w roślinach jest stres chłodu. Młode rośliny narażone na niskie temperatury intensywnie „fioletowieją”. Ich tkanki zawierają wysokie dawki antocyjanów. Trzeci i ostatni czynnik warunkujący wyższą zawartość antocyjanów w roślinach to niedobór fosforu.

Zastosowanie antocyjanów

Z uwagi na intensywną barwę znajdują one szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym jako barwniki. Właściwości lecznicze antocyjanów, które znane były od dawna w medycynie ludowej, obecnie coraz szerzej wykorzystywane są we współczesnym przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym. Nieodwracalne przemiany barwników antocyjanowych są spowodowane głównie procesami utleniania i polimeryzacji. Powoduje to zmiany czerwonej, naturalnej barwy owoców, na czerwonobrunatną z tendencją do brązowego, charakterystyczną dla produktów długo przechowywanych. Szybkość tych przemian zależy głównie od występowania w surowcu czynników inicjujących procesy utleniania oraz od temperatury i czasu jej działania. Można zapobiegać temu zjawisku przez dodawanie do produktów przeciwutleniaczy w postaci witaminy C, benzoesanu sodu lub potasu lub dwutlenku siarki). Winna czerwone poddane procesowi siarkowania zachowują intensywną rubinową barwę, podczas gdy wina nie poddane siarkowaniu po 2-3 tygodniach zmieniają barwę na brązową.

Znaczenie zdrowotne antocyjanów

• Łagodzą stany przemęczenia wzroku oraz zaburzenia mikrokrążenia siatkówkowego i naczyniowego;

• Zapobiegają pogarszaniu się ostrości widzenia, szczególnie po wielu godzinach spędzonych przy komputerze i telewizorze;

• Pomagają w szybszym przystosowaniu się wzroku do widzenia w ciemności lub świetle przyćmionym;

• Polepszają wydolność tętnic i żył kończyn dolnych;

• Mają właściwości przeciwutleniające, antyagregacyjne w stosunku do płytek krwi i aktywizują prostaglandyny.

Źródła antocyjanów

(owoce): porzeczka czarna, aronia, śliwki, czarne jagody, borówka amerykańska, winogrona, jabłka,

(warzywa): bakłażany, sałata fioletowa, brokuł oraz jarmuż o fioletowych liściach, cebula czerwona, fioletowa papryka, czerwona kapusta, ridacchio

Przedmiot: Nowoczesne Metody Analizy Żywności – temat VIII

Zakres realizowanej tematyki:

Porównanie dwóch metod analizy kwasów organicznych. Zasady chromatograficznego rozdziału kwasów organicznych. Ekstrakcja, oznaczenie jakościowe (identyfikacja) oraz ilościowe kwasów organicznych w wybranych warzywach z produkcji ekologicznej i konwencjonalnej.

Prowadzący ćwiczenia: dr inż. Ewelina Hallmann

Kwasy organiczne zwane inaczej karboksylowymi są to związki posiadające charakterystyczną grupę –COOH. Kwasy te są końcowym produktem utlenienia alkoholi I-rzędowych i aldehydów. Produkty roślinne, a przede wszystkim owoce, zawierają liczne hydroksykwasy, nadające im kwasowość i dobry smak jak również obniżające pH. Wśród tych hydroksykwasów można wyróżnić: kwas jabłkowy, kwas cytrynowy oraz kwas winowy. W roślinach jest znacznie mniejsza zawartość kwasu bursztynowego oraz szczawiowego, chociaż to oczywiście zależy od gatunku warzywa czy owocu. Są bowiem warzywa (szpinak, szczaw czy rabarbar) które zawierają znacznie więcej kwasu szczawiowego (stanowi on do 80% wszystkich kwasów organicznych w tych warzywach) w porównaniu z pomidorami, w których dominujący jest kwas cytrynowy, czy jabłkami, w których występuje głównie kwas jabłkowy i bursztynowy. W owocach hydroksykwasy występują w formie wolnej, przeciwnie do warzyw, w których kwasy organiczne są w postaci związanej. Wyjątek stanowią rabarbar oraz pomidory. Najczęściej hydroksykwasy tworzą sole z wapniem, potasem i sodem. Kwasy z owoców i warzyw chronią przed drobnoustrojami, równocześnie ułatwiają ich utrwalanie.

Największy procent kwasów zawierają owoce niedojrzałe. Ich kwasowość obniża się jednak, gdy ulegają procesowi dojrzewania lub są przechowywane. Kwasowość owoców dojrzałych waha się w przedziale między 0,2% do 3%. Znacznie mniejszą kwasowość posiadają owoce ziarnkowe, np. jabłka czy gruszki, w których wynosi od 0,2-0,8%, kwasowość owoców pestkowych znajduje się w przedziale od 0,8 do 1,5%, natomiast w owocach jagodowych kwasowość wynosi od 1% do 3%. Największą kwasowość mogą wykazywać cytryny, w których osiąga blisko 5%. Na całkowitą zawartość kwasów, występujących w kwaśnych jabłkach, przypada około 90% kwasu jabłkowego, pozostałe 10% to zawartość kwasu cytrynowego i innych kwasów. Śliwki, czereśnie i wiśnie posiadają zbliżoną do jabłek kompozycję kwasów. Owoce jagodowe mają w swoim składzie bardzo dużo kwasu cytrynowego, np. czarne porzeczki zawierają go ok. 25 mg/kg, czerwone porzeczki średnio 19,5 mg/kg a truskawki od 6,6 do 8,7 mg/kg.

Porównywalnie z owocami, warzywa także zawierają duże ilości kwasu jabłkowego i cytrynowego. Zazwyczaj kwas jabłkowy i cytrynowy tworzą sole potasowe, odpowiednio jabłczan i cytrynian potasowy. Warzywa wykazują znacznie niższą kwasowość w porównaniu z owocami, wyjątek stanowi rabarbar – jego kwasowość osiąga nawet 1,4% (kwas szczawiowy). Inne warzywa, m.in. pomidory, kapusta, marchew, wykazują kwasowość niemal dziesięć razy mniejszą od rabarbaru. Oprócz tego w warzywach znajdują się w małych ilościach inne kwasy: kwas bursztynowy, fumarowy, chinowy, izocytrynowy i szczawiowy. Warzywa bardzo rzadko zawierają kwasy: malonowy, akonitowy czy szikimowy, jeśli już to śladowe ich ilości.

Kwas jabłkowy

Kwas jabłkowy występuje powszechnie w owocach i warzywach, ale największe jego ilości można znaleźć w owocach ziarnowych, szczególnie jabłkach i pigwach. Stanowi on od 70% do 100% puli wszystkich kwasów organicznych, oczywiście jego zawartość jest różna w zależności od odmiany, czasu zbioru, zabiegów agrotechnicznych oraz czasu i warunków przechowywania owoców. W owocach pestkowych (wiśnie, śliwki) kwasu jabłkowego jest mniej (70%), w winogronach (60%), natomiast w gruszkach tylko 33%, zaś w borówkach, agreście i porzeczkach kwas jabłkowy w ogóle nie występuje.

Kwas cytrynowy

W owocach południowych (cytryny, pomarańcze, grapefruity, limonki, ananasy) kwas cytrynowy stanowi 90%-100% puli kwasów organicznych. Druga grupa owoców bogatych w kwas cytrynowy to owoce jagodowe: maliny, jagody, borówki, porzeczki oraz agrest. Wśród warzyw to owoce psiankowatych (pomidor i papryka oraz bakłażan) zawierają głównie kwas cytrynowy. Natomiast w innych warzywach kwas ten oznaczono w np. buraku cukrowym. Na skalę przemysłową kwas cytrynowy wytwarza się z cukru, w wyniku działania pleśni (Aspergillus niger) w środowisku tlenowym. Po zaszczepieniu grzybni na pożywce zawierającej cukier, po 48 h rozpoczyna się produkcja kwasu cytrynowego, która w sprzyjających warunkach (temp. 30-32oC) trwa aż do wyczerpania się zasobów węgla w pożywce czyli 5-7 dni.

Kwas winowy

Najlepszym źródłem kwasu winowego są owoce winogron, w których na całkowitą kwasowość przypada aż 40% kwasu winowego. W owocach krajowych, takich jak borówka, agrest czy porzeczka zawartość kwasu winowego wynosi 2%, pozostała pulę stanowią kwasy: cytrynowy i benzoesowy. W innych owocach kwas winowy nie występuje lub można go odnaleźć w śladowych ilościach np. w buraku ćwikłowym. Sól potasowa kwasu winowego (E336) jest stosowana jako emulgator, dodatek do proszków do pieczenia oraz regulator kwasowości. Ma właściwości przeciwutleniające. Oficjalnie środek nieszkodliwy, jednak dopuszczalne dzienne spożycie winianu potasu nie powinno przekraczać 30 mg na 1kg masy ciała.

Kwas bursztynowy

Owoce ziarnkowe (jabłka), owoce jagodowe (borówka, jagoda leśna) oraz owoce pestkowe (wiśnie) zawierają bardzo niewielkie ilości kwasu bursztynowego (5%). W warzywach występowanie kwasu bursztynowego stwierdzono tylko w buraku ćwikłowym i liściowym (2%). Kwas bursztynowy rozpuszcza się w wodzie, etanolu i eterze, i nie ulega utlenianiu. Kwas bursztynowy oraz jego sole są wykorzystywane jako dodatek do żywności konwencjonalnej jako wzmacniacz smakowy (E363) oraz jako regulator kwasowości.

Kwas szczawiowy

Występuje w bardzo dużych ilościach w warzywach z rodziny komosowatych (Chenopodiaceae) czyli w szczawiu, szpinaku i rabarbarze oraz buraku ćwikłowym i liściowym. Natomiast w innych warzywach i owocach występuje w niewielkich ilościach (0,01-0,06%). Kwas szczawiowy ogranicza wchłanianie wapnia w organizmie. Tworzy nierozpuszczalne sole (szczawiany), które krystalizują się w postaci (początkowo) drobnych kryształów, ale z czasem łączą się w większe agregaty prowadząc do kamicy szczawianowej. Kwas szczawiowy jest niewskazany dla osób chorych na reumatyzm, wątrobę i dolegliwości przewodu pokarmowego. Może doprowadzić m.in. do zapalenia i bólu stawów, a spożywany w nadmiarze przez dzieci - nawet do zahamowania wzrostu.

Kwas mrówkowy

Jest kwasem lotnym a podczas destylacji z parą wodną przechodzi bardzo łatwo do destylatu. Źródłem kwasu mrówkowego jest miód pszczeli (2,85 mg/100 g produktu), maliny zawierają go w śladowych ilościach (0,3 mg/100 g śm). Kwas mrówkowy jest produktem ubocznym w niektórych procesach fermentacji. Ma właściwości antyseptyczne i grzybobójcze (E236). Ze względu na swoje antygrzybiczne właściwości jest stosowany jako konserwant soków owocowych (do 0,15%), chleba tostowego (0,05%), ogórków kwaszonych na skalę przemysłową (0,1%) oraz ryb wędzonych. Nadmiar spożycia kwasu mrówkowego i jego soli wywołuje silne podrażnienie śluzówki żołądka.

Kwas octowy

Kwas octowy występuje w świeżych owocach i warzywach w postaci niezwiązanej ale, w bardzo małych ilościach. W owocach i sokach owocowych kwas octowy powstaje bardzo łatwo na skutek działania bakterii octowych (Acetobacter aceti). W owocach i warzywach wolny kwas octowy bardzo szybko tworzy z alkoholami estry. Związki te są odpowiedzialne za wytworzenie substancji lotnych (zapachowych) charakterystycznych dla owoców. Kwas octowy znalazł szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym do utrwalania żywności (marynaty, pikle). Sole kwasu octowego są stosowane jako regulatory kwasowości i konserwanty: octan sodu (E262), octan potasu (E261), octan wapnia (E263) oraz wzmacniacze smaku i zapachu: octan cynku (E650).

Kwas mlekowy

Jedyne owoce, które zawierają kwas mlekowy to wiśnie (10%) całkowitej puli kwasów organicznych oraz jabłka (1%). W produktach spożywczych kwas mlekowy pojawia się w wyniku fermentacji mlekowej (patrz 7.2.). Ze względu na to, że kwas mlekowy jest dużo mniej toksyczny od kwasu octowego, warzywa poddane procesowi fermentacji mlekowej są zdrowsze od warzyw marynowanych w zalewie octowej. Sole kwasu mlekowego są wykorzystywane w przemyśle spożywczym, jako konserwanty: mleczan potasu (E326), mleczan sodu (E3250 oraz mleczan magnezu (E324) oraz jako emulgatory stearyoilomleczan sodu (E481) i stearyoilomleczan wapnia (E482).

Kwas benzoesowy

Pewna ilość wolnego kwasu benzoesowego występuje w owocach jagody leśnej, natomiast duże jego ilości mają borówka wysoka (0,1-0,2%), żurawina wielkoowocowa (0,02-0,06%) oraz aronia czarnoowocowa (0,04-0,08%). Kwas benzoesowy i jego sole: potasowa (E212), sodowa (E211), wapniowa (E211) stosuje się głównie do konserwowania kandyzowanych lub lukrowane owoców i warzyw, napojów bezalkoholowych, dżemów i galaretek niskocukrowych i niskokalorycznych, marynat, koncentratu pomidorowego, przypraw, produktów mięsnych poddanych obróbce cieplnej, wypieków, oliwek i produktów na bazie oliwek, buraków ćwikłowych gotowanych, suszonych produktów mięsnych, pasztetów, ryb i owoców morza, paluszków krabowych, zup i bulionów w płynie, sosów. Metoda dodawania kwasów organicznych, przede wszystkim octowego oraz mlekowego, jest jedną z metod utrwalających owoce i warzywa. Poprzez zakwaszanie dodatkiem kwasów organicznych otrzymuje się marynaty. Dawka umożliwiająca pełną konserwację w przypadku kwasu octowego jest wysoka i skutkuje bardzo kwaśnym smakiem wyrobów, dlatego w przetwórstwie oprócz dodawania kwasu (w mniejszej dawce), wykorzystuje się łagodną pasteryzację uprzednio ukwaszonego produktu. Taką praktykę stosuje się do produkcji ogórków konserwowych.

Wśród rodzajów kwasowości można wyróżnić:

• kwasowość miareczkową (potencjalną, ogólną)

• kwasowość lotną (kwasy lotne z parą wodna)

• kwasowość czynną (pH, rzeczywistą, aktualną)

• kwasowość związaną ( kwasy związane w solach i estrach)

• kwasowość całkowitą ( sumę kwasowości miareczkowej i związanej)

Zwykle, w produktach owocowo – warzywnych oznaczana jest kwasowość miareczkowa, lotna i czynna.

Zagadnienia do przygotowania na kolokwium, z tematyki nr. VII i VIII

1. Czym są antocyjany- systematyka i budowa związków

2. Występowanie antocyjanów w przyrodzie i ich znaczenie zdrowotne

3. Porównanie metod identyfikacji związków antocyjanowych metodą spektrofotometryczną i HPLC

4. Kwasy organiczne, budowa chemiczna i znaczenie gospodarcze

5. Porównanie metod identyfikacji kwasów organicznych metodą potencjometryczną i HPLC