Wydział: BiNoŻ

Kierunek: Biotechnologia
semestr: IV

gr. dziekańska: 3

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

EZYMATYCZNA HYDROLIZA PEKTYN

Data wykonania ćwiczenia: 13.05.2010

Data oddania sprawozdania: 17.05.2010 Maja Szczepaniak Tomasz Styś Marcin Szustak

WSTĘP TEORETYCZNY

Pektyny jest to mieszanina węglowodanów występująca w ścianach komórkowych wielu roślin. Pektyny są generalnie polisacharydami i oligosacharydami o zmiennym składzie. Głównym monosacharydem wchodzącym w skład substancji pektynowych jest kwas D-galakturonowy połączony ze sobą wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, w różnym stopniu zestryfikowanych grupami metylowymi.

Wyróżniamy dwie frakcje pektyn, w zależności od stopnia estryfikacji:

• wysokometylowane (WM), w których zestryfikowanych jest >50% grup karboksylowych reszt kwasu galakturonowego;

• niskometylowane (NM), w których stopień estryfikacji jest mniejszy od 50%.

Pektyny dla ludzi, pod względem odżywczym są ciałami balastowymi. Pod względem żywieniowym stanowią jedną z frakcji rozpuszczalnego włókna pokarmowego (błonnika). Enzymy degradujące substancje pektynowe są wytwarzane przez rośliny i wiele drobnoustrojów. Należą do nich enzymy deestryfikujace i depolimeryzujące. W klasyfikacji enzymów depolimeryzujących uwzględniono mechanizm działania(hydrolityczny lub trans eliminacyjny), rodzaj degradowanego substratu oraz pozycje rozszczepianego wiązania glikozydowego łańcucha.

Wspólną cechą pektyn jest zdolność do tworzenia żeli w kwaśnych warunkach oraz przy dużym stężeniu sacharozy. Zdolność żelowania zależna jest od stopnia zmetylowania pektyn. Pektyny wysokometylowane żelują przy pH 3,0, stężeniu cukru 65% oraz zawartości pektyn 0,3 - 2%. Żele pektyn niskometylowanych powstają przy niższym stężeniu cukru (30-40%) oraz w szerszym zakresie pH (3-6). Jednak niezbędnym czynnikiem utworzenia trójwymiarowej siatki żelu jest obecność jonów wapnia, w stężeniu 0,01 - 0,1%. Zawartość pektyn wynosi wtedy 1,5 - 3,0%. Z tego względu są one wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako środek zagęszczający. Pektyny między innymi odpowiedzialne są za zestalanie się dżemów i powideł.
Pektyny składają się z trzech głównych rodzajów węglowodanów:

• homogalakturonan - polisacharyd zbudowany z merów kwasu galakturonowego

• ramnogalakturonan I - polisacharyd złożony z dimerów (ramnoza + kwas galakturonowy)

• ramnogalakturonan II - rozgałęziony polisacharyd.

źródło:

• wykłady z Biochemii prof. Dr hab. Marianny Turkiewicz

• http://www.zgapa.pl/zgapedia/Pektyny.html

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

2.1. Oznaczenie ogólnej aktywności pektynolitycznej:

Sposób wykonania pomiaru: Pomiar polega na zbadaniu spadku lepkości roztworu pektyny w specjalnym urządzeniu – wiskozymetrze. Pomiar wiskozymetryczny polega na zbadaniu szybkości przepływu cieczy o określonej objętości przez rurkę o niewielkiej średnicy poprzez czas jej przepłynięcia w stosunku do czasu przepłynięcia przez ten sam układ wody destylowanej. Do zbadania spadku lepkości potrzebujemy znać wartość czasu w jakim przepływa woda destylowana, czas przepływu mieszaniny która nie uległa reakcji ( Próba 1), czas przepływu próby poddanej dzianiu enzymu (próba 2) oraz graniczną lepkość niewykonywana na zajęciach polegająca na zbadaniu czasu po całkowitej hydrolizie pektyny.(wartość lepkości granicznej wynosi 1,1) Przygotowanie próby 1 polega na dodaniu do 20 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze o pH 3,8 i temperaturze 20ºC 0,2 ml wody destylowanej a następnie zamieszać. Próbę 2 otrzymujemy poprzez dodanie zamiast wody destylowanej 0,2 ml przygotowanego przez nas roztworu enzymu. Badanym przez nas enzymem był pektol w 350cio krotnym rozcieńczeniu. Próbę 2 następnie inkubowaliśmy przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Wyniki doświadczalne i obliczenia:

Tabela obrazująca czas przepływu cieczy:

tH2O [s]	ta [s]	t [s]
49	128	83,5

Na podstawie czasów obliczyliśmy lepkość:

$V_{a} = \frac{t_{a}}{t_{H2O}}$ lepkość początkowa

$$V_{a} = \frac{128}{49} = 2,612$$

$V = \frac{t}{t_{H2O}}$ lepkość roztworu poddana działaniu pektyny po 30 minutach

$$V = \frac{83,5}{49} = 1,704$$

Tabela lepkości roztworów:

Va	V	V0
2,612	1,704	1,1

Obliczenie procentowego spadku lepkości:

$A = \frac{V_{a} - V}{V_{a} - V_{0}} \bullet 100 = \frac{2,612 - 1,704}{2,612 - 1,1} \bullet 100\% = 60$%

$$PM = \frac{750}{\left( \frac{T}{A} - 0,0097*T \right)*CE}$$

T – czas inkubacji 1800 s

CE – rozcieńczenie enzymu wynoszące 1/350

$$PM = \frac{750}{\left( \frac{1800}{60} - 0,0097*1800 \right)*1/350} = 20933$$

Zestawienie wyników aktywności w tabeli:

	Ogólna aktywność pektynolityczna °PM
Rozcieńczenia	200
Pektopol
Pektynaza	11496

Wnioski: Pektyny jako związki o znacznej lepkości dość łatwo oznaczyć poprzez zastosowanie pomiaru z wiskozymetrem. Pektopol ma znacznie większą ogólna aktywność pektynolityczną w porównaniu do pektynazy. Pomimo prawie dwukrotnie mniejszego stężenia pektopolu ( rozc. 350 razy) w stosunku do pektynazy ( rozc. 200) spadek lepkości jest znacznie większy. Pektopol prawdopodobnie zawiera dużą ilość enzymów atakujących pektynę w pozycji Endo- przez co rozcina wewnętrzne wiązania glikozydowe przez co łańcuchy znacznie się skracają
i maleje lepkość roztworu. Liczba PM określa nam w ilu litrach 0,5% roztworu pektyny nastąpi spadek lepkości o 85% w ciągu 5 godzin w temperaturze 20°C, pod działaniem 1 kg preparatu pektyno litycznego.

2.2. Oznaczanie aktywności poligalakturonaz metodą kolorymetryczną:

Sposób wykonania pomiaru: Pomiar polega na zbadaniu pochłaniania światła przez kompleks utworzony w wyniku utlenienia kwasem DNS grup redukujących w produktach rozkładu pektyny przy długości fali λ = 530 nm Dzięki temu dowiemy się jak dużo cukrów redukujących powstanie w wyniku działania enzymu. Do przeprowadzenia badania potrzebna jest nam próba właściwa (E_w) oraz próba kontrolna (E_k) względem której zbadamy absorbancję. Przygotowanie próby właściwa polega na dodaniu do 0,5 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 0,5 ml roztworu enzymu ( rozcieńczenie 5000) i inkubowaniu próbki przez 10 minut w temperaturze 30°C. Następnie reakcje przerywamy poprzez dodanie 1ml DNS i umieszczamy we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Do ostudzonego produktu dodajemy 3 ml wody destylowanej i badamy absorbancję. W próbie kontrolnej do 0,5 ml pektyny dodajemy najpierw 1 ml DNS a dopiero później 0,5 ml roztworu enzymu. Następne czynności prowadzimy jak dla próby właściwej.

Wyniki doświadczalne i obliczenia:

Badaliśmy pektopol w rozcieńczeniu 5000 razy

E_w= 0,471

E_k= 0

E = E_w − E_k = 0, 471

Obliczenie zawartości cukrów redukujących wg krzywej wzorcowej:

0,1 – 212 [μg/ml]

0,471 – x [μg/ml]

x = $\frac{0,417*212}{0,1} = 998,5\ $[μg/ml]

Obliczenie aktywności enzymatycznej:

$$U\left( \text{PG} \right) = \frac{A*rozc*2}{t*212}\ \left\lbrack \frac{\text{μmol}}{ml*min} \right\rbrack$$

gdzie:

A - ilość uwolnionych cukrów redukujących [μg/ml]

rozc. - Rozcieńczenie enzymu [5000x]

t – czas reakcji [min]

212 – masa 1μmola kwasu D-galakturonowego

2 – przeliczenie na 1 ml enzymu

$$U = \frac{998,5*5000*2}{10*212} = 4710\left\lbrack \frac{\text{μmol}}{ml*min} \right\rbrack$$

Zestawienie wyników wszystkich grup

	Aktywność poligalakturonazy $\left\lbrack \frac{\mathbf{\text{μmol}}}{\mathbf{ml*min}} \right\rbrack$
Pektopol	4710 1150 2500 2720 3840 5390
Pektynaza	8960 4740

Wnioski: Badanie kolorymetryczne pozwala nam na zbadanie ilości uwolnionych w reakcji enzymatycznej cukrów redukujących. Uzyskane wyniki pokazują nam, iż pektynazę cechuje większa aktywność poligalakturonaz. (Jednakże mała ilość prób na preparacie pektynazy oraz duża rozbieżność w wynikach nie pozwala być pewnym). Szybsze tworzenie się cukrów redukujących świadczy o większej ilości egzopoligalakturonaz w pektynazie niż w pektopolu.

2.2.2. Oznaczanie aktywności pektynoesterazy:

Sposób wykonania pomiaru: Badanie ma na celu określenie aktywności pektynoesterazy poprzez określenie ilości zhydrolizowanych wiązań estrowych w pektynie miareczkowaniem 0,1M NaCl. Ponieważ pektyna jest zmetoksylowana w różnym stopniu dlatego musieliśmy wykonać również próbę ślepą aby określić początkową liczbę wolnych grup karboksylowych, którą następnie odejeliśmy od ilości grup uzyskanej po działaniu enzymu. Przygotowanie próby właściwej polega na umieszczeniu w zlewce o pojemności 200 ml, 50 ml roztworu pektyny w 0,1M NaCl ogrzanej do temperatury 30°C. Za pomocą 0,1M NaOH doprowadziliśmy pH roztworu do 4. Następnie dodajaliśmy 50ml wodnego roztworu preparatu pektyno litycznego podgrzanego do tej samej temperatury. Po wymieszaniu inkubowaliśmy w łaźni wodnej w 30°C przez 30 minut. Następnie za pomocą 0,1M roztworu NaOH doprowadziliśmy do pH 7,5 notując zużycie zasady. Próbę ślepą przygotowaliśmy w podobny sposób z tą różnicą że preparat pektyno lityczny należy najpierw inaktywować poprzez umieszczenie go we wrzącej łaźni wodnej na 25 minut.

Wyniki doświadczalne i obliczenia:

	Ilość NaOH [ml] do:	Sumaryczna ilość zużytej zasady
	miareczkowania do pH 4	miareczkowania do pH 7,5
Właściwa (V)	9,8	6,2
Kontrolna (V0)	9	3,2

$$U\left( \text{PE} \right) = \frac{\left( V - V_{0} \right)*100}{v*t}\ \left\lbrack \frac{\text{μmol}}{ml*min} \right\rbrack$$

gdzie:

V,V₀ – ilośc zasady potrzebnej do miareczkowania grup karboksylowych

100 – ilośc mikrorównoważników wiązań estrowych, odpowiadająca 1ml 0,1 M NaOH

t – czas hydrolizy [min]

v – ilośc preparatu pektyny [ml]

$$U\left( \text{PE} \right) = \frac{\left( 16 - 12,2 \right)*100}{0,5*30} = 25,33\ \left\lbrack \frac{\text{μmol}}{ml*min} \right\rbrack$$

Wnioski: Pektynoesterazy są kolejnymi enzymami działającymi na pektyny. Działają one na zmetoksylowaną grupę karboksylową w łańcuchu pektyny. Otrzymana aktywność oznacza nam ilość mikrorownoważników wiązań estrowych zostało zhydrolizowanych przez 1 ml preparatu enzymatycznego w ciągu 1 minuty.