2.2 Oznaczanie aktywności poligalakturonaz metodą kolorymetryczną

Wykonanie:

• Próba właściwa (E_w): do 0,5 ml 0,5 % roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodać 0,5 ml preparatu enzymatycznego odpowiednio rozcieńczonego 5000x i inkubować w czasie 10 minut w temperaturze 30°C. reakcję enzymatyczną przerwać przez dodanie 1 ml roztworu DNS (kwasu 3,5 – dinitrosalicylowego). Następnie mieszaninę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodać 3 ml wody destylowanej, wymieszać i odczytać absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm wobec próby kontrolnej (próba ślepa nie jest wykonywana ponieważ jej absorbancja jest równoważna absorbancji próby kontrolnej).

• Próba kontrolna (E_k): 0,5 ml 0,5 % roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodać 1 ml roztworu DNS (kwasu 3,5 – dinitrosalicylowego) i 0,5 ml preparatu enzymatycznego odpowiednio rozcieńczonego 5000x. Inkubować w czasie 10 minut w temperaturze 30°C. Następnie mieszaninę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodać 3 ml wody destylowanej, wymieszać i odczytać absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm wobec próby kontrolnej.

Absorbancja A₅₃₀ próby właściwej wynosi 0,195. Absorbancja A₅₃₀ próby kontrolnej wynosi 0. Absorbancja A₅₃₀ próby kontrolnej jest równoważna absorbancji A₅₃₀ próby ślepej (dlatego próba ślepa nie jest wykonywana).

Aktywność poligalakturonazy (PG) oznacza się na podstawie ilości grup aldehydowych uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy wiązania α-1,4-glikozydowego w kwasie poligalakturonowym lub w niskozmetoksylowanej pektynie.

Aktywność poligalakturonazy wyliczam ze wzoru:

$$U\left( \text{PG} \right) = \ \frac{x \bullet R \bullet 2}{212 \bullet t}\ \left\lbrack \frac{\text{μmol}}{min \bullet ml} \right\rbrack$$

Gdzie:

x – odczyt z krzywej wzorcowej $\left\lbrack \frac{\text{μg}}{probe} \right\rbrack$

R – rozcieńczenie enzymu

t – czas reakcji enzymatycznej [min]

212 – masa 1 μmola kwasu D-galakturonowego

2 – przeliczenie na 1 ml enzymu

$$0,1 - 220\ \frac{\text{μg}}{\text{ml}}$$

0, 195 − x

$$x = \ \frac{0,195\ \bullet 220\ \frac{\text{μg}}{\text{ml}}}{0,1} = 429\ \frac{\text{μg}}{\text{ml}}$$

Zależność $0,1\ - \text{\ \ }220\ \frac{\text{μg}}{\text{ml}}$ wynika z krzywej wzorcowej. Krzywą wzorcową w tym przypadku nazywamy przedstawioną graficznie zależność absorbancji A₅₃₀ od znanego stężenia substancji wzorcowej (kwas galakturonowy [μg/ml]). Wykonanie takiego wykresu umożliwia bezpośrednie odczytywanie szukanych stężeń na podstawie zmierzonych wartości absorbancji oznaczanych prób.

$$U\left( \text{PG} \right) = \ \frac{429\ \frac{\text{μg}}{\text{ml}} \bullet 5000 \bullet 2}{212 \bullet 10\ min}\ \left\lbrack \frac{\text{μmol}}{min \bullet ml} \right\rbrack$$

$$U\left( \text{PG} \right) = \ 2023,58\ \left\lbrack \frac{\text{μmol}}{min \bullet ml} \right\rbrack = 2023,58\ \left\lbrack \frac{J}{\text{ml}} \right\rbrack$$

Aktywność enzymu określa się jako ilościowy przyrost produktów w odniesieniu do czasu reakcji katalizowanej przez ten enzym. Za jednostkę poligalakturonaz przyjmuję się taką ilość enzymu, która w ciągu 1 minuty w temperaturze 30°C uwalnia z substratu grupy redukujące w ilości równoważnej 1 μmolowi kwasu D-galakturonowego.

Uzyskana aktywność pokazuje nam, że w ciągu jednej minuty jeden ml enzymu rozłożył ok. 2024 μmoli pektyny.