Inżynieria genetyczna (technologia genowa) – jest terminem wprowadzonym do określania nowoczesnych metod biologii molekularnej i genetyki, umożliwiających manipulacje genetyczne poza komórką, czyli rekombinowanie DNA In vitro. Zasadniczym kierunkiem jej obecnego praktycznego wykorzystania jest biotechnologia środków leczniczych, takich jak: hormony, białka odpornościowe, szczepionki nowych generacji. Duże usługi oddaje inżynieria genetyczna w badaniach molekularnych w zakresie immunologii i onkologii.

Główne techniki eksperymentalne w inżynierii genetycznej:

- enzymy restrykcyjne - umożliwiają rozcinanie DNA w specyficznych miejscach za pomocą restrykcyjnych endonukleaz,

- klonowanie DNA - daje możliwość uzyskania specyficznych sekwencji DNA w dużych ilościach i niezmienionej formie,

- hybrydyzacja kwasów nukleinowych - umożliwia wykrycie z dużą dokładnością specyficznych sekwencji DNA i RNA,

- sekwencjonowanie DNA - umożliwia szybkie określenie sekwencji nukleotydów w najważniejszych genach,

- PCR - opracowanie łańcuchowej reakcji polimeryzacji DNA.

Klon – grupa organizmów lub komórek potomnych o identycznych cechach dziedzicznych (genetycznych), wyprowadzona z organizmu lub komórki macierzystej w wyniku rozmnażania bezpłciowego (u rośliny – wegetatywnego) lub partenogenezy (dzieworództwa).

Transgeneza to modyfikacja materiału genetycznego polegająca na: wycięciu, dołączeniu, zmianie fragmentu DNA.

Enzymy restrykcyjne – Trawią obydwie nic dwuniciowego DNA w obrębie sekwencji rozpoznawanej (zwykle symetrycznej). Hydrolizują szkielet cukrowo-fosforanowy pozostawiając grupę fosforanową na 5’ końcu cząsteczki, a grupę OH na jej końcu 3’. Generują tępe końce lub kohezyjne końce (z wystającym na końcu 3’ lub 5’ jednoniciowym „ogonem”).

System restrykcji-modyfikacji występuje u wielu gatunków bakterii i stanowi mechanizm obronny skierowany przeciwko wprowadzeniu obcego DNA do komórki. Składa się on z 2 elementów: pierwszym jest endonukleaza restrykcyjna, która rozpoznaje krótką, symetryczną sekwencję DNA i przecina (hydrolizuje) szkielet każdej z nici DNA w specyficznym miejscu w obrębie tej sekwencji. Obcy DNA jest zatem degradowany do relatywnie krótkich fragmentów. Drugim elementem systemu jest metylaza, która dodaje grupę metylową do zasady (cytozyny lub adeniny) w obrębie tej samej sekwencji komórkowego DNA. Ta modyfikacja sprawia, że DNA gospodarza staje się odporny na degradację przez endonukleazę.

Typy enzymów restrykcyjnych:

Typ I - wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawierające aktywności metylazy i restryktazy. Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, w bliżej nieokreślonym miejscu. Z tego powodu nie mają większego zastosowania praktycznego.

Typ II - przecinają DNA w zdefiniowanym miejscu, w obszarze rozpoznawanej sekwencji lub w jej pobliżu. Składają się z pojedynczych polipeptydów. Rozpoznają sekwencje symetryczne.

Typ IIs - zbliżone do typu II, przecinają z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która jest asymetryczna.

Typ III - duże kompleksy, które wymagają dwóch sekwencji rozpoznawanych w pobliżu siebie. Bez znaczenia praktycznego.

Typ IV - zbliżone do typu II. Zawierają aktywność metylazy i restryktazy w tym samym polipeptydzie. Przecinają DNA w zdefiniowanym obszarze poza sekwencją rozpoznawania. Aktywności metylazy i restryktazy nie mogą działać równocześnie. Enzym "przełącza" się w zależności od substratu.

Nazwy enzymów z reguły są tworzone od pierwszej litery nazwy rodzajowej i dwóch pierwszych liter nazwy gatunkowej, pisanymi kursywą. Po nich może wystąpić kilka liter lub cyfr arabskich oznaczających szczep bakterii. Nazwa zakończona jest rzymską cyfrą oznaczającą, jako który kolejny enzym został on wyizolowany z danego szczepu.

W inżynierii genetycznej wykorzystywane są głownie enzymy restrykcyjne klasy II czyli takie, które tną dwuniciowy DNA w obrębie lub w określonym miejscu w pobliżu rozpoznawanej sekwencji nukleotydowej. Rozpoznawane sekwencje są palindromowe i obejmują zwykle 4 lub 6 nukleotydów, ale znane są enzymy, które rozpoznają sekwencje 5,7 lub 8 nukleotydów. Dany rodzaj enzymu przecina DNA zawsze w ten sam sposób.

Izoschizomery – to enzymy restrykcyjne rozpoznawające tą samą sekwencję DNA. Np. enzym Sphl, rozpoznający i tnący sekwencję 5’-CGTACˇG-3’. Z kolei enzymy, które rozpoznają tę samą sekwencję, ale tną ją w różnych miejscach, zwane są neoschizomerami. Neoschizomety są specyficznym podtypem izoschizomerów.

Enzymy restrykcyjne pozostawiają dwa rodzaje końców w rozciętej cząsteczce DNA:

• tępe końce - obie nici rozcięte są naprzeciwko siebie - nukleotydy znajdujące się na końcach są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnej nici;

• lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony występujące na obu końcach przeciętej niesymetrycznie cząsteczki, są one komplementarne do końców utworzonych w innych cząsteczkach DNA w wyniku zadziałania tych samych restryktaz, bez względu na źródło DNA, co umożliwia ligowanie DNA pochodzących nawet od bardzo różniących się gatunków (tworzenie cząsteczek chimerycznych).

Zastosowanie enzymów restrykcyjnych:

- sporządzenie fizycznych map genomowych,

- izolacja i identyfikacja genów, sekwencjonowanie DNA,

- Porównanie DNA z różnych organizmów,

- Rekombinowanie i klonowanie określonych genomów lub fragmentów genomów,

- Diagnostyka chorób genetycznych,

- Diagnostyka niektórych chorób nowotworowych,

- Diagnostyka chorób infekcyjnych,

- W transpalntologii do ustalania zgodności tkankowej,

- W medycynie sądowej do ustalania pokrewieństwa.

Mapowanie restrykcyjne – W wyniku trawienia zrekombinowanej cząsteczki DNA jednym lub kombinacją kilku enzymów restrykcyjnych możliwe jest opracowanie jej schematu (mapy restrykcyjnej) z określeniem miejsca rozcięcia DNA oraz wielkości powstałych fragmentów.

Inne enzymy mające zastosowanie w technikach inżynierii genetycznej:

- Fosfataza alkaliczna – usuwa reszty fosforanowe z końców 5’ jednoniciowego i dwuniciowego DNA oraz RNA

- Ligaza DNA – katalizuje zależną od ATP reakcję łączenia szkierów cukrowo-fosforanowych dwuniciowego DNA mających grupę fosforową na końcu 5’, a grupę OH na końcu 3’ nici. Wymaga, by końce DNA pasowały do siebie, np. tępy koniec koniecznie z tępym końcem lub dwa końce kohezyjne.

- Polimeraza DNA I – syntetyzuje nić DNA komplementarną do matrycy w kierunku od 5’ do 3’ poczynając od odcinka starterowego, mającego wolną grupę OH na końcu 3’. Fragment Klenowa jest pochodną polimerazy DNA I, którą pozbawiono aktywności egzonukleazy 5’->3’.

- Egzonukleaza III – Egzonukleazy trawią liniowy DNA od jego końców. Egzonukleaza III trawi dwuniciowy DNA tylko od końca 3’.

- Nukleaza fasoli Mung – trawi jednoniciowe kwasy nukleinowe, pozostawiając nietknięte regiony dwuniciowe.

- Nukleaza S1 – Podobnie jak nukleaza fasoli Mung. Jednakże enzym trawi także jedną nić dwuniciowego DNA w miejscu naprzeciwko pęknięcia komplementarnej nici.

- Enzymy restrykcyjne – Trawią obydwie nic dwuniciowego DNA w obrębie sekwencji rozpoznawanej (zwykle symetrycznej). Hydrolizują szkielet cukrowo-fosforanowy pozostawiając grupę fosforanową na 5’ końcu cząsteczki, a grupę OH na jej końcu 3’. Generują tępe końce lub kohezyjne końce (z wystającym na końcu 3’ lub 5’ jednoniciowym „ogonem”).

- Odwrotna transkryptaza – Polimeraza DNA zależy od RNA. Syntetyzuje DNA komplementarny do matrycy RNA w kierunku 5’->3’ poczynając od startera z wolną grupą 3’-OH. Wymaga tri fosforanów deoksyrybounukleozydów.

- RNaza A – Nukleaza, która trawi RNA nie trawiąc DNA.

- RNaza H – Nukleaza, która trawi nić RNA hybrydowej cząsteczki RNA-DNA.

- Polimerazy RNA T3,T7 i SP6 – Specyficzne polimerazy RNA kodowane przez odpowiednie bakteriofagi. Każdy z enzymów rozpoznaję tylko sekwencję promotorową charakterystyczną dla faga, z którego on sam pochodzi. Enzymów tych można używać do transkrypcji odcinków DNA położonych poniżej sekwencji danego promotora.

- Polimeraza DNA Taq – Polimeraz Dna pochodząca z termofilnej bakterii. Optymalna temperatura działania tej polimerazy to 72˚C, ponadto jest ona dostatecznie stabilna w 90˚C. Używana do PCR.

- Terminalna transferaza – Dodaje kilka nukleotydów do końca 3’ liniowego, jedno lub dwuniciowego DNA lub RNA. Jeśli do reakcji dodany będzie GTP, do końca kwasy nukleinowego zostanie dobudowany ogon oligoG.

Ligacja DNA – Ligaza DNA faga T4 naprawia pęknięcia w rdzeniu cykrowo-fosforowym dwuniciowego DNA i może kowalencyjnie łączyć hybrydyzowane końce, co stanowi odwrócenie trawienia restrykcyjnego. W ten sposób można tworzyć nowe cząsteczki DNA.

Wektor genetyczny - wykorzystywana powszechnie w inżynierii genetycznej, niewielka cząsteczka DNA (taka jak plazmid czy DNA wirusów), służąca wprowadzeniu żądanej sekwencji DNA do komórki. Stosując odpowiednie wektory można spowodować wydajną ekspresję genów w nich zawartych (wektory ekspresyjne) lub integrację sekwencji przenoszonej na wektorze do genomu biorcy (np. wektory retrowirusowe), jak również przeprowadzić klonowanie genu (wektor klonujący). Takie wektory służą do wprowadzania obcego DNA do komórek i utrzymywania go w kolejnych podziałach komórkowych. Istnieją także wektory bifunkcjonalne (wahadłowe), które mogą egzystować w co najmniej dwóch odmiennych organizmach (np: w drożdżach i bakteriach).

Najczęściej stosowanymi wektorami są plazmidy, czyli koliste cząsteczki DNA zawierające elementy niezbędne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza.

Podział wektorów: wektory plazmidowe, wektory fagowe, kosmidy, wektory ekspresyjne, wektory wahadłowe, wektory sekrecyjne, sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC), sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) i sztuczny ludzki chromosom (HAC). Opracowano także specjalne wektory przystosowane do organizmów eukariotycznych takie jak Yip (integracyjny plazmid drożdżowy, będący w istocie plazmidem bakteryjnym zawierającym geny drożdży) lub YRp (ten wektor może powielać się w komórce drożdży, ponieważ zawiera chromosomowy DNA z miejscem ori).

Cechy dobrego wektora:

- pojemność

- zdolność inkorporacji do genomu komórki docelowej

- usunięte wszystkie geny wirulencji.

- sekwencje odpowiedzialne za inicjacje replikacji

- Jedno ( tylko jedno) miejsce rozpoznawania i cięte przez enzym restrykcyjny,

- Geny markerowe pozwalające na selekcje komórek stransformatowanych ( te, które przyjęły wektor) i zrekombinowanych

Gen markerowy - tzw. gen wyznacznikowy. Jest to każdy gen, którego funkcja oraz położenie w chromosomie są znane. Gen markerowy można rozumieć również jako wyznacznik genetyczny czyli dowolną genetycznie kontrolowaną cechę fenotypową, wykorzystywaną do celów analizy genetycznej albo też dowolną różnicę genetyczną wykorzystywaną dla ujawnienia wypadków rekombinacji. Ułatwia rozpoznanie nowego zrekombinowanego genotypu na podstawie sposobu, w jakim ujawnia się zewnętrznie.

Marker selekcyjny będzie chronił komórkę przed działaniem szkodliwego czynnika, który normalnie zabiłby lub zablokował jej wzrost. Stąd też po zastosowaniu substancji selekcyjnej na hodowlę, wzrost podejmą tylko te komórki, które posiadają gen markerowy, a tym samym pożądany fragment DNA. Najczęściej stosowanymi związkami selekcyjnymi są antybiotyki ( zwłaszcza w przypadku bakterii i roślin). Tego typu zabiegi są również stosowane do oceny czy organizmy potomne nie utraciły interesującego badacza genu. Aby się o tym przekonać wystarczy spryskać je roztworem antybiotyku. Przeżyją tylko te z zachowanym genem.

Gen reporterowy: W przeciwieństwie do markerów selekcyjnych, geny reporterowe nie powodują odporności komórek transformowanych przeciwko szkodliwym związkom chemicznym niszczącym komórki nieodporne. Mogą jednak działać na podobnej zasadzie co markery różnicujące, częstymi są także przypadki w których pewne geny ( np. gfp , lacZ) można by zaliczyć do obu grup. Gen reporterowy jest łączony z sekwencją która ma być badana np. potencjalne miejsca promotorowe, otwarte ramki odczytu . Koduje on białko, które może być wykryte bezpośrednio( np. emisja światła), lub jego aktywność jest rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego produktu ( np. zmiana koloru) Należy pamiętać o tym, że dany gen może zostać zastosowany w badaniach, jedynie gdy określona komórka/kolonia nie posiada genów kodujacych białko homologiczne do tego użytego jako reporter.

Oporność na antybiotyki – jest to cecha części szczepów bakteryjnych, która umożliwia im przeciwstawianie się wpływowi antybiotyku. W zależności od pochodzenia, dzieli się ją na pierwotną (naturalna struktura bakterii uniemożliwiająca działanie leku) lub nabytą – na skutek nabycia genów oporności od innych bakterii lub spontanicznych mutacji. Częsta oporność wśród bakterii wiąże się z nieracjonalną antybiotykoterapią oraz zbyt dużym zużyciem tych leków w przemyśle spożywczym.

Występowanie oporności na dany antybiotyk nie jest jednoznaczne z możliwością przeżycia drobnoustroju w obecności tego antybiotyku. Oporność może się objawiać również niewielkim wzrostem wytrzymałości mikroorganizmu, tak, że do jego zabicia wystarczy zwiększenie stężenia leku, a nie będzie konieczna jego zamiana.

Co to jest biblioteka genomowa i biblioteka cDNA – różnice:

Biblioteka genomowa: to kolekcja klonów (zazwyczaj bakterii), która jako całość zawiera co najmniej jedną kopię każdej sekwencji DNA obecnej w genomie organizmu, którego bibliotekę genomową utworzono.

Powstaje przez pocięcie całego genomu danego organizmu enzymami restrykcyjnymi, a następnie połączenie powstałych w ten sposób fragmentów DNA z wektorami (np. plazmidami lub kosmidami), tak że każdy wektor zawiera jeden, losowo wybrany fragment. Wektory te następnie wprowadza się do komórek bakteryjnych (np. bakterii Escherichia coli) – każda bakteria pobiera jeden wektor, a więc zawiera jeden fragment oryginalnego genomu. Taka bakteria, namnażając się, tworzy klon bakteryjny zawierający ten fragment. Tylko niektóre klony zawierają geny, część zawiera tylko fragmenty genów, większość sekwencje niekodujące. Fragmenty DNA niesione przez dwa klony mogą nakładać się na siebie, gdyż powstały przez losowe cięcie wielu kopii oryginalnego genomu. Biblioteka genomowa powinna być odpowiednio duża, aby prawdopodobieństwo, że każdy fragment oryginalnego genomu jest w niej obecny, wynosiło co najmniej 99%.

W zależności od zastosowanego systemu wektorowego banki genów mogą być różnej wielkości. Na wielkość banku wpływa pojemność klonująca systemu wektorowego. Bank jest tym większy im bardziej skomplikowany jest organizm. Jest on konstruowany w sposób dość przypadkowy.

Wzór Clarka–Carbona wykorzystywany do określenia liczby koniecznych (wymaganych) rekombinantów (klonów):

gdzie:

N – liczba wymaganych klonów

P – prawdopodobieństwo z jakim jesteśmy w stanie znaleźć w danym banku dany gen

L – długość klonowanego fragmentu

x – wielkość szukanego genu

M – wielkość genomu

Biblioteka cDNA (komplementarny DNA) – fragmenty cDNA umieszczonego w komórach bakteryjnych, np. E. coli. cDNA jest odwzorowaniem mRNA. W komórkach eukariotycznych występują introny które nie występują u prokariotów. Dlatego, aby móc wprowadzić DNA eurariotyczne do bakterii należy usunąć introny. mRNA jest to już sekwancja kodująca, która nie zawiera zbędnych informacji. Należy stworzyć DNA komplamentarny do mRNA. Następnie mRNA zostaje odseparowany i nie bierze już udziału w dalszych krokach. Zostaje poddany procesowi degradacji przez RNase H. Przy pomocy primerów syntetyzowana jest druga nić komplementarna do pierwszej. To jest cDNA. Następnie cDNA jest unieszczone w bakterii, gdzie jest powielane.

Hybrydyzacja kolonijna (łysinkowa): Metody przeszukiwania biblioteki:

Hybrydyzacja DNA

Przeszukiwanie biblioteki metodą hybrydyzacji DNA rozpoczyna się od transferu koloni albo łysinek (będących de facto samą biblioteką) na filtr, najczęściej nitrocelulozowy, na którym w rezultacie otrzymujemy dokładne odwzorowanie układy z płytki hodowlanej. Komórki (lub wirusy) przeniesione na filtr poddaje się lizie, uwolniony DNA denaturuje, deproteinizuje i nieodwracalnie wiąże do matrycy. Następnym krokiem jest dodanie znakowanej radioizotopowo próby (sondy), która hybrydyzuje z komplementarnym fragmentem DNA. Próby, które nie zostały związane są odmywane z filtra, a filtr poddaje się autoradiografii, która uwidacznia kolonie niosące poszukiwany fragment DNA, na podstawie ich umiejscowienia na nitrocelulozie można zlokalizować je także na pierwotnej szalce, a z niej wyizolować odpowiedni klon. W teorii metoda ta wygląda mało skomplikowanie, jednak prawidłowe jej przeprowadzenie wymaga długiego czasu i dokładności, a sukces końcowy w dużej mierze uwarunkowany jest szczęśliwą ręką eksperymentatora. Problem stanowi tutaj postępowanie z samymi błonami nitrocelulozowymi. Procedura wymaga ich przenoszenia pomiędzy naczyniami, zmian odczynników etc. tymczasem już najmniejszy pęcherz powietrza może przyczynić się do przeoczenia poszukiwanej kolonii.

Analiza immunologiczna

W swoich pierwszych etapach postępowanie wygląda analogicznie do metody poprzedniej. Mianowicie kolonie przenosimy na filtr i lizujemy bakterie, ale tym razem unieruchamiane na matrycy jest nie DNA, ale białka. W dalszej kolejności matrycę inkubuje się w obecności przeciwciała pierwszorzędowego, specyficznym wobec białka kodowanego przez poszukiwany gen. Nadmiar przeciwciała jest odmywany, a matryca pokrywana przeciwciałem skierowanym przeciwko temu pierwszemu, najczęściej sprzężonym z enzymem (np. peroksydazą chrzanową lub alkaliczną fosfatazą). Po tym etapie przeprowadzana jest reakcja kolorymetryczna, która może zachodzić tylko w obecności przeciwciała drugorzędowego i na jej podstawie identyfikuje się miejsce, w którym znajdują się poszukiwane klony.

Screening na podstawie aktywności białka

Metoda ta może zostać zastosowana w dwóch przypadkach. Po pierwsze gdy produkt poszukiwanego genu jest enzymem, który w normalnych warunkach nie występuje w komórkach gospodarza (wektora). Dla przykładu geny alfa-amylazy, beta-glukozydazy, endoglukanazy wyizolowano poprzez wysianie biblioteki genomowej w E.coli na medium zawierające specyficzne dla tych enzymów substraty, będące czynnikiem selekcyjnym dla koloni zdolnych do jego użycia. Po okresie inkubacji w naczyniach hodowlanych pojawią się tylko i wyłącznie te elementy biblioteki, które zawierają geny kodujące zastosowane enzymy, albo elementy te staną się łatwe do odróżnienia (np. na podstawie morfologii), zależnie od charakteru białka. Drugi przypadek zachodzi w sytuacji gdy produkt poszukiwanego genu jest niezbędny do życia zmutowanych komórek gospodarza. Stosuje się wtedy pożywkę minimalną, bez tego produktu. W hodowli pojawią się tylko klony zawierającą prawidłową formę szukanego genu, a tym samym zdolne do syntezy niezbędnego związku.

Przeszukiwanie z wykorzystaniem PCR

Reakcja PCR często używana jest do przeszukiwania bibliotek stworzonych w YACach. Taka biblioteka mieszcząca cały ludzki genom mieści się na 240 "96-dołkowych" płytkach. W celu screeningu tworzy się repliki tych płytek, łącząc np. po 4 na jednym filtrze. Następnie klony z każdych trzech kolejnych filtrów (podawane liczby stanowią tylko przykład, cała procedura może być przeprowadzona w różnych konfiguracjach) łączy się razem i prowadzi reakcję PCR w każdej z takich mieszanin (każda z nich zawiera teraz klony z 12 dołków) z użyciem odpowiednich primerów (specyficznych dla poszukiwanego fragmentu DNA). Jako próby pozytywnej używa się całkowitego ludzkiego DNA. W kolejnym kroku mieszaniny poreakcyjne analizuje się elektroforetycznie, lokalizuję prążek odpowiadający zamplifikowanemu produktowi (taki sam będzie obecny w kontroli). W tym momencie można stwierdzić w której części biblioteki znajduje się poszukiwany gen. Np. jeśli produkt amplifikacji znalazł się w mieszaninie z filtrów od 1-3 możemy do nich zawęzić pole poszukiwań. Prowadzi się wtedy PCR dla mieszaniny klonów z tych właśnie filtrów razem i dla każdego z nich z osobna (przy kontroli pozytywnej). W ten sposób można zidentyfikować pojedynczy filtr, hybrydyzować z nim produkt PCR co pozwoli na lokalizację pojedynczego klonu. Metoda, choć wygląda na skomplikowaną jest w wielu przypadkach mniej kłopotliwa i czasochłonna niż standardowa hybrydyzacja, przede wszystkim dlatego, że opiera się na prostym, bardzo logicznym schemacie.

Wędrówka po chromosomie

Zdecydowana większość wektorów do klonowania oferuje stosunkowo małą pojemność. Wyjątkiem są tutaj YACi i kosmidy. Zdarzają się doświadczenia, w których klonuje się fragmenty o długości do milionów par zasad. W takich przypadkach stosuje się technikę wędrówki po chromosomie (ang. chromosome walking). Żeby móc korzystać z tej metody trzeba dysponować sondą przynajmniej do fragmentu szukanego genu, albo genu leżącego w bliskim jego sąsiedztwie, W skrócie technika wędrówki po chromosomie opiera się na wyszukiwaniu w bibliotece DNA klonu zawierającego fragment DNA hybrydyzujący z naszą sondą i użyciu skrajnej części znalezionego odcinka jako sondy do zidentyfikowania następnego w kolejności. Procedurę powtarza się do uzyskania fragmentów, które w sumie dają cały szukany odcinek.

Podaj etapy tworzenia biblioteki genomowej człowieka.

Biblioteka genomowa jest zbiorem różnych fragmentów genomowego DNA danego organizmu, wklonowanych do cząsteczek wybranego wektora genetycznego, przygotowane z komplementarnego DNA.

Przygotowanie biblioteki obejmuje następujące etapy:

1. Izolacja DNA. W zależności od typu biblioteki, którą pragniemy uzyskać izolujemy całkowity DNA lub DNA z danego typu organelli,

2. Fragmentacja DNA. DNA poddajemy fragmentacji z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych lub metod fizycznych takich jak np.

sonikacja. Trawienie restrykcyjne (częściowe) wykonuje się na ogół w taki sposób, by uzyskać fragmenty dłuższe niż wynikałoby to z

3. Ligacja z wektorem. Każdy fragment DNA, który ma być stabilnie utrzymywany w bibliotece, musi zostać połączony z cząsteczką

4. Transformacja. DNA biblioteki należy umieścić w komórkach E.coli lub drożdży, które następnie rozsiewane są na szalki selekcyjne

w celu uzyskania pojedynczych klonów, z których każdy zawiera inny fragment genomu. Biblioteka na tym etapie może zostać poddana

Etapy tworzenia biblioteki cDNA

Biblioteka cDNA jest zbiorem cząsteczek reprezentujących sekwencje ulegające transkrypcji w danym organizmie. Brak sekwencji genomowych nie ulegających transkrypcji.

Przygotowanie biblioteki cDNA obejmuje:

1. Izolacja RNA. Zdecydowana większość cząsteczek RNA izolowanych z komórek reprezentuje dojrzałe transkrypty genów.

2. Synteza cDNA. Syntezę cDNA wykonuje się z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy oraz dwóch typów starterów.

3. Ligacja z wektorem. Do klonowania sekwencji cDNA używane są zazwyczaj wektory genetyczne, które oprócz klonowania umożliwiające również nadekspresję wklonowanych fragmentów.

4. Transformacja. Wybór organizmu gospodarza, do którego wprowadzamy bibliotekę cDNA zależy od sposobu, w jaki będziemy przeprowadzać identyfikację poszczególnych klonów

Prokariotyczne i eukariotyczne systemy nadekspresji:

Systemy prokaryotyczne

Prokaryotyczne układy do nadprodukcji białek najcz^sciej działaja w Es-cherichia coli. Praktycznie zawsze sa to systemy indukowalne.

Stosujemy je z wyboru, kiedy nadeksprymujemy bialko bakteryjne (z dowolnej bakterii), badz male bialko eukaryotyczne, które nie jest glikozylowane, ani w inny sposób modyfikowane posttranslacyjnie.

Zalety tych systemów to:

• łatwosc manipulacji genetycznych w bakteriach (szczególnie w E. coli)

• duza wydajnosc (do 50% totalnego białka)

• łatwosc i niski koszt hodowli

• mozliwosc prostego przeskalowania hodowli do rozmiarów przemyslowych

Natomiast wady:

• trudno jest nadprodukowac duze białka

• brak eukaryotycznych modyfikacji posttranslacyjnych

• białka eukaryotyczne moga sie zle fałdowac

Systemy eukaryotyczne

Eukaryotyczne układy do nadprodukcji bialek podzielic mozna na pracujace w jednokomorkowych Eukaryota (np. drozdzach) i te oparte na wyższych eu-karyontach.

Dalej mamy podział ukladow "wielokomorkowych" na dzialajace w liniach komorkowych (owadzie, ssacze) i w całych organizmach (roslinne, zwierzece).

System eukaryotyczny wybieramy zwracajac uwage na pokrewienstwo or­ganizmu z ktorego pochodzi białko i organizmu w ktorym prowadzona bedzie nadprodukcja, wymagania co do modyfikacji posttranslacyjnych i mozliwosci techniczno-finansowe.

Generalnie uklady oparte na liniach komorkowych trudno sie skaluje, po-zostale mozna skalowac wzglednie łatwo.

Oczyszczanie bialka z eukaryontow jest trudniejsze, niz z bakterii.

Wydajnosci nie sa tak duze, jak w przypadku prokaryontow.

Manipulacje DNA w organizmach wyższych sa duzo trudniejsze, niz w bakte­riach, dlatego wiekszosc operacji wykonuje sie w E. coli. Przedłuża to procedure

- trzeba przygotowany konstrukt wprowadzic do organizmu docelowego.

Biotechnologia – najnowsza definicja i podział:

Biotechnologia - interdyscyplinarna dziedzina nauki (posługująca się wiedzą z biochemii, mikrobiologii i nauk inżynieryjnych), obejmująca różne kierunki techn. wykorzystania materiałów i procesów biol. (w szczególności przebiegających przy udziale drobnoustrojów, kultur tkankowych oraz biokatalizatorów);

Biała – biotechnologia przemysłowa wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska. Opiera się ona na biokatalizie i bioprocesach.

Czerwona - biotechnologia wykorzystywana w ochronie zdrowia, w szczególności w zakresie produkcji nowych biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, czy genoterapii i ksenotransplantologii

Zielona biotechnologia, nazywana też agrobiotechnologią, zajmuje się aspektami związanymi z rolnictwem, rozwiązaniami stosowanymi w celach spożywczych i niespożywczych. Uściślając termin zielonej biotechnologii, trzeba podkreślić, że głównym obiektem zainteresowania są tutaj rośliny, a nie jakby mogło się wydawać również zwierzęta. Ten rodzaj biotechnologii to głównie wykorzystywanie wiedzy o roślinach do zaspokajania potrzeb człowieka. Do roślin, które są wykorzystywane w agrobiotechnologii należy zaliczyć soję, bawełnę, rzepak i kukurydzę.

Cykl życiowy faga M13

Każdy bakteriofag przechodzi specyficzny cykl reakcji w celu namnożenia się. Najpierw musi rozpoznać bakterie, w której może się namnożyć, i wiąże się z powierzchnią jej komórki. Następnie wstrzykuje swój kwas nukleinowy, który musi być chroniony przed bakteryjnymi nukleazami występującymi w cytoplazmie. Fagowy genom jest następnie replikowany, transkrybowany, poczym musi ulec translacji, w trakcie której produkowane są białka płaszcza i ogona (jeśli jest obecny).Następnie kompletne wiriony są składane i następuje ich uwolnienie z komórki bakterii. Różne fagi używają różnych strategii do wykonania każdej z tych reakcji.

Wektory kosmidowe:

Wektory kosmidowe - stosowane do klonowania dużych fragmentów DNA np. operonów prokariotycznych czy genów eukariotycznych. Budowa : są to zmodyfikowane plazmidy zawierające sekwencję cos faga l konieczną przy pakowaniu DNA do kapsydów fago wych. Najprostsze kosmidy zawierają ori repilkacji , gen markera selekcyjnego , miejsce do klonowania oraz sekwencję cos. Modyfikacje tego typu wektorów polegają na zwiększaniu ilości miejsc do klonowania (polilinkery) , wprowadzaniu element ów umożliwiających analizę klonowanego DNA

Scharakteryzuj system binarny roślin transgenicznych. – wektory do transformacji roślin

Agrobacterium tumefaciens wywołują chorobę nowotworową zainfekowanych roślin przekazując do komórki roślinnej duży plazmid(Ti). Część plazmidu warunkująca choroby ulega integracji z chromosomowym DNA rośliny(T-DNA).

Guzy „crown gall”stanowią duży zbiór niezróżnicowanych komórek, z których wiele zawiera T-DNA. Wiele komórek nie zawiera T-DNA, co implikuje, że T-DNA aktywnie zapobiega różnicowaniu kodując syntezę substancji blokujących różnicowanie i że substancja ta może drogą dyfuzji przenikać do komórek sąsiednich.

Rośliny transgeniczne (modyfikowane genetycznie) - przykłady

Kukurydza
- odporność na owady - wszczepiony został gen odpowiedzialny za wytwarzanie białka, które zjadane przez owada niszczy jego przewód pokarmowy co doprowadza do śmierci. Białko to "działa" tylko w organizmach niektórych, ściśle określonych gatunków owadów-szkodników, nie jest aktywne np. u człowieka.
- wytwarzanie substancji używanych do wyrobu leków lub szczepionek,
Ziemniaki
- wzrost zawartości skrobi, ponadto odmiany składające się wyłącznie z amylopektyny - u odmian tradycyjnych 20% skrobi to amyloza, którą usuwa się z ziemniaków przemysłowych co podnosi koszty,
- odporność na herbicydy, stonkę ziemniaczaną, wirusy,
- "słodkie ziemniaki" - wprowadzenie genu odpowiedzialnego za wytwarzanie słodkiego białka - taumatyny,
- odporność na ciemnienie pouderzeniowe - większa trwałość,
- mała zawartość glikoalkaloidów - substancji szkodliwych na człowieka, występujących w surowych ziemniakach.
Pomidory
- spowolnienie dojrzewania, większa trwałość
- większa zawartość suchej masy,
- poprawa smaku (?),
- intensywniejsza barwa, cieńsza skórka.
Truskawki
- wyższa słodkość owoców,
- spowolnienie dojrzewania,
- odporność na mróz.

Soja
- odporność na środki ochrony roślin - hrebicydy,
- odporność na wirusy, herbicydy, szkodniki,
- obniżona zawartość kwasu palmitynowego.
Rzepak
- odporność na herbicydy,
- zmniejszona zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych,
- większa zawartość kwasu lauronowego.
Buraki cukrowe
- odporność na herbicydy i szkodniki,
- dłuższy okres przechowywania bez strat w zawartości cukru.
Ryż
- zwiększona produkcja beta-karotenu, prekursora witaminy A - wszczepione został geny pochodzące z żonkila, modyfikacja w zamierzeniu miała rozwiązać problem braku witaminy A u dzieci w Azji Wschodniej.

sałata - produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B - można się szczepić jedząc sałatę - została ona opracowana przez naukowców z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego.
Bawełna
- odporność na herbicydy i szkodniki.
Pszenica
- zwiększenie zawartości glutenu - lepsza mąka.
Dynia
- odporność na grzyby
Winogron
- odmiany bezpestkowe.
Banany
- odporność na wirusy i grzyby - zakażają się poprzez uszkodzenia w transporcie.

Kapusta- odporność na szkodniki, mniejsze wymiary główek.
Seler
-zwiększona kruchliwość.

Zastosowanie roślin transgenicznych

-Rolnictwo:

Odporność na herbicydy - chemiczne środki ochrony roślin, środki chwastobójcze.

Odporność na choroby powodowane przez grzyby, wirusy, bakterie.

Odporność na owady - szkodniki.

Odporność na niekorzystne warunki środowiska

Poprawa cech jakościowych oraz użytkowych roślin

-Medycyna

Szczepionki

CHARAKTERYSTYKA PLAZMIDU Ti

Charakterystyka plazmidu Ti
· duży kolisty plazmid zawierający min. geny:
- wirulencji
- katabolizmu specyficznych dla szczepu opin
- biosyntezy opin specyficznych dla szczepu
- związane z biosyntezą hormonów roślinnych - specyficzne dla szczepu
· geny wirulencji i katabolizmu opin są zgrupowane razem i znajdują się poza obszarem T-DNA
· geny biosyntezy opin oraz geny związane z syntezą hormonów roślinnych znajdują się w obszarze T-DNA
· obszar T-DNA jest wyznaczony przez specyficzne sekwencje DNA (bezpośrednie powtórzenia o długości 25 pz) zwane granicznymi (LB- Left Border i RB - Right Border)
· tylko prawa sekwencja graniczna (RB) jest wymagana do rozpoznania i przeniesienia T-DNA
· obecność lewej sekwencji granicznej (LB) poprawia efektywność tego procesu
· wielkość plazmidów Ti: 150-800 kb

Typy plazmidów Ti (dzikich)
Istnieją różne typy plazmidów Ti zależnie od tego jaki rodzaj opin potrafią utylizować. Najlepiej poznane są plazmidy Ti nopalinowe i oktopinowe. Obydwa typy posiadają obszar T-DNA ale różniący się strukturą:
· Nopalinowy T-DNA - prosty ciągły segment, około 22 kb
· Oktopinowy T-DNA - złożony z 3 segmentów; lewy segment DNA (TL) = 13kb, centralny segment (TC) = 1.5kb, prawy segment (TR) = 7.8kb; lewy segment zawiera funkcje onkogenne a prawy segment geny syntezy opin
Uogólniony model przeniesienia i integracji T-DNA
· Nić T powstaje i jest przenoszona do komórki roślinnej w postaci kompleksu DNA-białka. Transfer wymaga genów vir zlokalizowanych na plazmidzie Ti i genów chromosomalnych
· Białko, które znajduje się na końcu 5’ nici T-DNA wchodzi w interakcję z roślinnym DNA i nacina je
· Jednoniciowe T-DNA jest przyłączane do jednej nici roślinnego DNA a napięcia torsyjne z tym związane powodują rozerwanie drugiej nici roślinnego DNA
· Końce nici T są łączone z końcami roślinnego DNA na drodze ligacji, dosyntetyzowana zostaje nić komplementarna do nici T
· Naprawy (łatanie dziur) i replikacja obszarów integracji nici T prowadzą często do duplikacji i rearanżacji w tym obszarze

GENY ODCINKA T-DNA I ICH EFEKTY FENOTYPOWE

Koduje 2 klasy genow warunkujacych transformowany fenotyp :
1. zaangazowanych w synteze opin
2. odpowiedzialnych za biosynteze regulatorow wzrostu roslin

T-DNA
· obszar przenoszony do komórek roślinnych
· zawiera geny kodujące białka zaangażowane w biosyntezę opin i białka zaangażowane w biosyntezę fitohormonów
· pomimo tego, że geny te rezydują na plazmidzie bakteryjnym to są aktywne tylko w komórkach roślinnych
· zawierają typowe eukariotyczne sekwencje regulujące ich transkrypcję: TATA-boxy i CAAT-boxy oraz typowe roślinne sygnały poliadenylacji
· część tych sekwencji wykorzystano do regulacji ekspresji genów markerowych

Techniki mutagenezy ukierunkowanej DNA:

mutageneza ukierunkowana, technika → inżynierii genetycznej prowadząca do sztucznego wywoływania → mutacji w ściśle określonym miejscu genomu; zaprogramowaną mutację określonego genu przeprowadza się stosując przynajmniej jedną z trzech podstawowych metod zmian bezpośrednich DNA: insercję, delecję lub substytucję nukleotydów; w zależności od stosowanych metod wyróżnia się mutagenezę sterowaną oligonukleotydami, kasetową, insercyjną i inne.

Sztuczne chromosomy:

Sztuczny chromosom drożdżowy (YAC) jest zrekombinowanym chromosomem drożdży Saccharomyces cerevisiae używanym w inżynierii genetycznej, jako wektor do klonowania DNA. W skład wektora wchodzi sekwencja inicjacji replikacji (drożdżową- ars, bakteryją - ori), sekwencje telomerowe, centromer oraz na ogół markery. Replikuje w komórkach drożdży.

Zaletą wektora YAC jest zdolność do przyjęcia (insertu) bardzo dużych fragmentów DNA do klonowania (np. cDNA), nawet rzędu 3000 kpz, co, w przeciwieństwie do użytkowania jako wektorów np. plazmidów, czy wektorów fagowych, umożliwia klonowanie całych ludzkich genów.

Zastosowania YACs[edytuj]

Badanie zachowania się chromosomów, głównie podczas mejozy

Dobre (ale mniej stabilne od BAC) wektory dla dużych sekwencji DNA

Badanie ekspresji genów (tego typu wektory mogą funkcjonować w komórkach ssaków)

Sztuczny chromosom bakteryjny (BAC) jest zrekombinowanym DNA bazującym na DNA plazmidowym bakterii pałeczki okrężnicy (Escherichia coli), używanym w inżynierii genetycznej, jako wektor do klonowania DNA. Wykazuje zdolność do przyjęcia fragmentów DNA do klonowania (np. cDNA), (określanego także mianem insertu) długości 100-350 kpz, czyli znacznie mniej niż sztuczny chromosom drożdżowy (YAC). Niemniej jednak BAC wykazuje większą stabilność insertu oraz łatwość operacji namnażania i izolacji klonu.

Ludzki sztuczny chromosom (ang. Human Artificial Chromosome, HAC) - kolejnym krok, po stworzeniu sztucznego chromosomu drożdży (YAC), ku lepszemu poznaniu mechanizmów ekspresji genów. W porównaniu z prawdziwymi ludzkimi chromosomami jest strukturą bardzo małą. Posiada tylko najważniejsze obszary: telomer, centromer oraz gen. W komórce człowieka zachowuje się jak normalny chromosom, dzieli sie i rozchodzi po jednym do każdej z komórek potomnych. Jest często także znany pod nazwą MAC (Mammalian Artificial Chromosome) - Sztuczny ssaczy chromosom, ale jeszcze nie jest jeszcze dokładnie zbadane czy w pełniłby swoje funkcje także w komórkach innych ssaków.

Hybrydyzacja:

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA). Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie (renaturacja). Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.

Zjawisko hybrydyzacji znalazło szereg użytecznych zastosowań w technikach biologii molekularnej. W szczególności, hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy molekularnej) używa się do detekcji homologicznych fragmentów podczas:

poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną detekcję cząsteczek mRNA w technice northern.

do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.

do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice hybrydyzacji in situ.

do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southerna, np. w celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP). Techniki RFLP używa się m.in. celu ustalenia ojcostwa.

W przeszłości prędkość hybrydyzacji DNA wyizolowanego z genomów dwóch różnych organizmów była używana jako miara pokrewieństwa ewolucyjnego. W ten sposób na przykład ustalono po raz pierwszy, że szympans jest najbliższym ewolucyjnie krewniakiem człowieka.

Hybrydyzacja northern:

Hybrydyzacja northern (ang. northern blotting) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów ulegających transkrypcji w komórce.

Metodyka jest zbliżona do hybrydyzacji Southerna: (skąd też pochodzi nazwa metody, patrz niżej)

• RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (elektroforezie) na żelu

• po rozdziale RNA przenosi się na odpowiednią membranę oraz utrwala na niej

• membranę z RNA inkubuje się z sondą, tzn. cząsteczką DNA lub RNA, która po pierwsze jest komplementarna do poszukiwanej sekwencji, a po drugie daje się łatwo wykryć

• po inkubacji i odpłukaniu nadmiaru sondy przeprowadza się detekcję, czyli uwidacznianie sondy, która związała się do poszukiwanej sekwencji RNA na membranie.

Jeżeli nie interesuje nas długość wykrywanego RNA, krok pierwszy (elektroforezę) można pominąć. Wówczas RNA nanosi się bezpośrednio na membranę.

Sonda daje na ogół sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

Nazwa metody powstała przez przekorę do podobnej metody - hybrydyzacji Southerna, która została opracowana pierwotnie do wykrywania kwasów deoksyrybonukleinowych (DNA).

Hybrydyzacja Southern:

Hybrydyzacja metodą Southerna (ang. Southern blotting, Southern blot) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca wykrywaniu określonych fragmentów DNA . Jej nazwa pochodzi od nazwiska Edwin M. Southern, który ją opisał i przedstawił w roku 1975.

Aby ją wykonać, należy przeprowadzić elektroforetyczne rozdzielenie mieszaniny fragmentów DNA (np. po cięciu enzymami restrykcyjnymi), umieścić w alkalicznym buforze, który wywoła denaturację DNA. Następnie całość przenosi się na błonę nylonową. Po odpowiednim spreparowaniu błony nylonowej z DNA wykonuje się hybrydyzację z sondą, a następnie przy pomocy odpowiedniej metody detekcji uwidacznia się interesujące nas fragmenty DNA. Metoda ta może być przeprowadzona w sposób pozwalający określić ilość DNA w badanej próbce. Wówczas siłę sygnału przekłada się na poziom DNA obecnego w badanej próbce.

Hybrydyzację Southerna można stosować m.in. po cięciu DNA enzymami restrykcyjnymi, po reakcji PCR z użyciem mało specyficznych starterów (zobacz: reakcja łańcuchowa polimerazy) lub też w celu wykrycia obcego DNA w badanym organizmie (np. DNA wirusa u człowieka).

PCR:

PCR - (ang. polymerase chain reaction) łańcuchowa reakcja polimerazy to reakcja służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro. Jedną z odmian tej techniki jest tzw. in situ PCR, pozwalający przeprowadzić reakcję PCR wewnątrz komórki. Reakcja, która jest prowadzona w termocyklerach, wymaga: termostabilnej polimerazy DNA (np. polimerazy Taq), wolnych trójfosforanów nukleotydów, jonów Mg2+ oraz primerów.

Primery (startery) są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów długości), jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji.

Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA, która zachodzi w temperaturze ok. 95˚C. Następnie temperatura jest obniżana do ok. 50˚C, co umożliwia połączenie się primerów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu, temperatura jest podnoszona do ok. 72˚C i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment zawarty pomiędzy dwoma primerami. Ta sekwencja cykli jest powtarzana wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać.

GMO:

GMO, czyli organizmy zmodyfikowane genetycznie (organizmy transgeniczne) to rośliny, zwierzęta i drobnoustroje, których geny zostały celowo zmienione przez człowieka. Rekombinacja DNA i inne pokrewne techniki pozwalają tworzyć organizmy o odmiennych właściwościach niż macierzy gatunek. Pierwszy "GMO "został stworzony w 1973 przez Stanley Cohena i Herberta Boyer'a.

Modyfikacje roślin uprawnych polegają przede wszystkim na wprowadzeniu lub usunięciu z nich określonych genów. Modyfikacje mają przede wszystkim na celu:

- zwiększenie odporności na herbicydy i szkodniki,

- zwiększenie odporności na infekcje wirusowe, bakteryjne i grzybowe,

- zwiększenie tolerancji na stres abiotyczny (głównie zmiany klimatyczne),

- przedłużenie trwałości owoców,

- poprawę składu kwasów tłuszczowych oraz aminokwasów białek,

- unormowanie stężenia fitoestrogenów,

- zwiększenie zawartości suchej masy,

- zmianę zawartości węglowodanów, karotenoidów i witamin,

- usunięcie składników antyżywieniowych – toksyn, związków utrudniających przyswajanie składników, związków które podczas obróbki kulinarnej ulegają reakcjom chemicznym wytwarzając toksyny, zwiększając np. zawartość nutraceutyków, czyli substancji niezbędnych dla zdrowia,

Na świecie najczęściej modyfikowanymi roślinami są: kukurydza, pomidory, soja zwyczajna, ziemniaki, bawełna, melony, tytoń. W Europie najczęściej modyfikuje się: kukurydzę, rzepak, buraki cukrowe, ziemniaki.

Przykłady organizmów transgenicznych w rolnictwie:

- transgeniczne pomidory o przedłużonej trwałości (obecnie nie ma dostępnych na rynku)

- transgeniczne rośliny tytoniu, odporne na herbicydy

- soja transgeniczna odporna na działanie glifosatu

Modyfikacje zwierząt mają na celu głównie uzyskanie zwierząt o pożądanych cechach w hodowli – szybciej rosnące świnie, ryby, zastosowaniu ich w produkcji białek, enzymów, innych substancji wykorzystanych w przemyśle farmaceutycznym (jako bioreaktory), uodpornieniu na choroby.

Modyfikacje zwierząt nie są tak popularne jak roślin, głównie ze względu na trudności w samym procesie modyfikacji, proces jest bardzo skomplikowany i trwa długo, koszty są bardzo duże. Zwierzęta modyfikowane genetycznie często chorują lub są bezpłodne.

Wprowadzanie genów do komórek roślinnych:

Mikrowstrzeliwanie, fizyczna - wykorzystuje mikroskopijne kulki z złota lub wolframu o średnicy 0,5 - 5 mikrometra (0,0000005-0,000005 metra). Fragmenty DNA które pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczane na tych kulkach, a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych. Używana jest do tego tzw. "armatka genowa" (ang. particle gun). Wadą metody jest niska wydajność oraz mogące wystąpić uszkodzenia komórek. Zaletą jest to iż komórki nie muszą być pozbawiane ściany komórkowej, można wprowadzać do np. do fragmentu liścia, jak i DNA może zostać wprowadzona także do chloroplastów i mitochondriów.

Wprowadzanie genów do komórek zwierzęcych – metodyka:

1. w postaci fosforanu wapnia do linii komórkowych

2. metoda z zastosowaniem polikationów (Polibren), jonitowanego dekstranu,

3. metoda elektroporacji - polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki. Podejście to może być stosowane też przy wprowadzaniu genów do innych komórek - zwierzęcych, bakteryjnych.

4. za pomoca liposomów - Fuzja liposomów - tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie - powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA.

5. mikroiniekcja - polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco- i czasochłonna.

6. metoda wstrzeliwania

Terapia genowa:

leczenie polegające na wprowadzeniu obcych kwasów nukleinowych (DNA lub RNA) do komórek. Charakter lub informacja genetyczna zawarte we wprowadzonym DNA lub RNA powinny wywierać efekt terapeutyczny. Mechanizmy działania wprowadzonych kwasów nukleinowych mogą być następujące:

• Zmuszenie komórki do produkcji białka kodowanego przez wprowadzony gen;

  • produkcja białek potrzebnych, których w organizmie brakuje lub występują w niedomiarze (np. w defektach metabolicznych, takich jak hemofilia);

  • produkcja białek prowadzących do śmierci komórki (apoptozy) - potencjalne zastosowanie do terapii przeciwnowotworowych (patrz: nowotwór).

• Hamowanie lub modulację ekspresji genów przez wprowadzenie:

  • dominujących alleli genów kodujących nieaktywne lub defektywne białko;

  • antysensowych kwasów nukleinowych wchodzących w interakcję z mRNA (patrz np.^[1]);

  • pułapek (wabików) oligonukleotydowych, wychwytujących czynniki transkrypcyjne;

  • małych interferujących RNA (siRNA) służących wyciszeniu ekspresji konkretnego genu;

  • rybozymów (lub DNAzymów) chemicznie modyfikujących materiał genetyczny.

Metoda in vivo polega na podaniu nośnika kwasu nukleinowego do ustroju pacjenta. W tym celu najczęściej stosuje się wektory wirusowe, które potrafią wprowadzać DNA lub RNA do komórki. DNA plazmidowe (zobacz: plazmid), nie podawane z żadnym nośnikiem, jest w stanie wnikać jedynie do komórek mięśni szkieletowych.

Metoda ex vivo polega na wyizolowaniu komórek z organizmu pacjenta, wprowadzeniu do nich terapeutycznego DNA lub RNA (zobacz: transfekcja) i ponownym podaniu ich pacjentowi.

Mutageneza – zarówno spontaniczny jak i wywołany przez mutageny proces powstawania zmian – mutacji w DNA.Mutageneza jest wykorzystywana w hodowli roślin uprawnych w celu wyprowadzenia nowych odmian. Jest też wykorzystywana w badaniach naukowych (np. analiza ekspresji genów). Mutageneza może być losowa lub ukierunkowana – wywołująca mutację w określonym miejscu w sekwencji DNA.

badania naukowe jakimi zajmuje się współczesna biotechnologia

- analityka różno kierunkowa

- bioinformatyka

- chemia kombinatoryczna

- diagnostyka

- synteza białek (w tym enzymów)

- genomika

- terapia medyczna (farmakogenetyka, badania kliniczne, marketing)

- produkcja aparatury i odczynników

- mikromacierze

- agrobiotechnologia

- proteomika

- wyciszanie genów

- manipulacje komórkami macierzystymi

- aparatura i odczynniki wspomagające

Firmy biotechnologiczne:

Bayer CropScience

A & A Biotechnology

"BIOMED" Wytwórnia Surowic i Szczepionek Sp. z o.o.

Delecja:

Delecja - jeden z typów (najczęściej spontanicznej) mutacji genowej dotyczącej zmiany składu nukleotydowego DNA.

Polega na utracie jednej lub większej liczby par nukleotydów z DNA genowego. Delecja trójki nukleotydów powoduje brak jednego aminokwasu w łańcuchu (delecja kodonu kodującego dany aminokwas, lub połączenie dwóch uszkodzonych kodonów w nowy). Delecja liczby nukleotydów nie będącej wielokrotnością liczby 3 prowadzi do przesunięcia ramki odczytu i zmiany wszystkich kodonów od miejsca delecji począwszy. Delecja kilkuset nukleotydów oznacza zmianę prowadzącą nawet do usunięcia całego genu.

Insercja:

insercja (interkalacja) - najczęściej spontaniczna mutacja genu polegająca na wstawieniu krótkiej sekwencji DNA w obrębie pojedynczego genu albo wstawieniu dłuższego fragmentu chromosomu. Wstawienie przynajmniej jednego nukleotydu. Insercja trójki nukleotydów powoduje powstanie dodatkowego aminokwasu w łańcuchu (insercja kodonu kodującego dany aminokwas pomiędzy dwa kodony, lub insercja jednego kodonu w drugi z wytworzeniem dwóch nowych, np. ATT dodane pomiędzy C i T kodonu CTG daje CATTTG, czyli CAT TTG). Insercja liczby nukleotydów nie będącej wielokrotnością liczby 3 prowadzi do przesunięcia ramki odczytu i zmiany wszystkich kodonów od miejsca insercji począwszy.

Chromatografia metalopowinowactwa – jak oczyścić zrekombinowane białko.

Podstawą chromatografii metalopowinowactwa (IMAC – Immobilized Metal Affinity) jest fakt, że białka posiadają liczne reszty funkcyjne, które mają zdolność kompleksowania jonów metali przejściowych (i nie tylko) – są to grupy tiolowe Cys, imidazolowe His, karboksylowe Glu i Asp oraz fenolanowe Tyr.

Naniesienie próbki adsorpcja próbki Płukanie złoża Elucja próbki

na złoże

SCHEMAT OCZYSZCZANIA PRZY UŻYCIU CHROMATOGRAFII METALOPOWINOWACTWA

Złoże do oczyszczania w systemie IMAC powinno być zbudowane z hydrofobowego polimeru posiadającego powierzchniowe hydrofilowe grupy zapewniające jego zwilżalność, np. agaroza, celuloza. Złoże IMAC powinno być tak zmodyfikowane chemicznie, aby posiadało zdolność chelatowania jonów metali przejściowych, które stanowią właściwe ligandy oddziałujące z białkami. Ważne jest, aby chelatowanie jonów metali było na tyle silne, żeby nie następowało ich wymywanie podczas procesu oczyszczania.

1. Oczyszczanie białka

• nanieść na kolumnę ekstrakt bezkomórkowy;

• płukać złoże buforem A (4 objętości złoża);

• płukać złoże buforem B (4 objętości złoża);

• płukać złoże buforem C (4 objętości złoża);

• płukać złoże buforem D (4 objętości złoża);

• eluować białko przy użyciu buforu E (3 x 5 ml).

Transgeneza:

Transgenezą nazywamy technikę modyfikowania genomu metodami inżynierii genetycznej. Zwierzęta transgeniczne to takie, które w swoim genomie zawierają zintegrowany DNA pochodzący od innego osobnika. Jednym z pierwszych eksperymentów transgenezy było wprowadzenie na początku lat 80. do zygoty myszy szczurzego genu hormonu wzrostu. Głównym efektem tego zabiegu było szybsze tempo wzrostu i wyraźne wydłużenie ciała myszy transgenicznych. Samce transgeniczne przekazywały swojemu potomstwu obcy gen, natomiast samice były niepłodne. Podobne rezultaty otrzymano po wprowadzeniu myszom ludzkiego genu czynnika uwalniającego hormon wzrostu. Materiał genetyczny wprowadza się do komórki zazwyczaj za pomocą jednej z następujących technik: • bezpośrednia mikroiniekcja genu lub fragmentu DNA do przedjądrza, najczęściej męskiego, zapłodnionej komórki jajowej. Po mikroiniekcji DNA dokonywany jest transfer zarodków do hormonalnie przygotowanych biorczyń. Jest to główna metoda uzyskiwania transgenicznych zwierząt gospodarskich;

Transgeneza to modyfikacja materiału genetycznego polegająca na:

- wycięciu

- dołączeniu

- zmianie

fragmentu DNA.

Organizmy transgeniczne:

- prokariotyczne:

U bakterii występuje zjawisko transformacji i transdukcji, czyli transgeneza naturalna. (Przykład – włączenie materiału genetycznego wirusa HIV do kom. limfocytu T).

Możliwa jest transgeneza sztuczna

przykład: wprowadzenie fragmentu wirusa WZW typu B do drożdży (warunkuje produkcje przeciwciał)-> szczepionka przeciw WZW typ B.

*Antygen – substancja wprowadzona drogą pozajelitową do organizmu, pobudza go do wytworzenia przeciwciał i jest rozpoznawana przez limfocyty T i B.

Gen S odpowiedzialny jest za wytworzenie struktury powierzchniowej.

odpowiedzialny za wytworzenie przeciwciał

Klonowanie

Klonowanie – w potocznym rozumieniu proces tworzenia idealnej kopii z oryginału.

W biologii mianem klonu określa się organizmy mające identyczny lub prawie identyczny materiał genetyczny. Klonami są więc organizmy powstałe w procesie rozmnażania wegetatywnego, takie jak kolonie bakterii, jednokomórkowców, odrośla i rozmnóżki roślin etc.

Termin klonowanie jest używany w kilku znaczeniach:

Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację genetyczną jak dawca. Szczególnym przypadkiem jest twinning, czyli powstawanie lub otrzymywanie bliźniąt monozygotycznych, gdzie nie można wyróżnić dawcy.

Klonowanie organizmów oznacza procedurę otrzymywania organizmów o takiej samej informacji genetycznej, z reguły poprzez procedurę transferu jądra z komórki somatycznej do komórki jajowej pozbawionej uprzednio jądra. W przypadku klonowania roślin stosuje się procedurę odróżnicowania komórek dawcy do komórek merystematycznych.

Klonowanie genów – w genetyce i biologii molekularnej proces wyosobniania genu. Polega na łączeniu fragmentów materiału genetycznego z wektorem molekularnym i ich namnażaniu w innym organizmie. Otrzymuje się w ten sposób wiele kopii tego samego genu. Termin klonowanie genów odnosi się też do identyfikacji genów poprzez wykorzystanie procedury klonowania genów. Jeśli pojedynczy fragment genomu jest przenoszony z jednego wektora do drugiego, taki proces określa się mianem subklonowania.

Opanowano obecnie metody klonowania wielu gatunków roślin i zwierząt. W przypadku zwierząt zazwyczaj stosuje się technikę polegającą na przeniesieniu jądra komórki somatycznej pobranej z klonowanego osobnika, do komórki jajowej pozbawionej jądra. Proces ten tworzy funkcjonalną zygotę. Zygota ta może, jeśli się jej na to pozwoli, rozwinąć w żywego osobnika. Dawca komórki jajowej z reguły pochodzi z tego samego gatunku. Transfer jądra do komórki jajowej innego gatunku rzadko jest skuteczny.

Klony otrzymane w procesie transferu jądrowego nie są w 100% genetycznie identyczne z dawcami. W trakcie tego procesu wymienia się bowiem tylko materiał genetyczny zawarty w jądrze komórkowym pozostawiając DNA mitochondrialny biorcy. Mitochondrialny DNA ma jednak minimalny wkład w dziedziczenie cech genetycznych.