Wykład 8

Odpowiedź komórki na uszkodzenia DNA – regulacja cyklu komórkowego, aktywacja punktów kontrolnych

Kontrola cyklu komórkowego – cykliczna aktywacja kinaz.

Regulacja cyklu – kaskadowe reakcje fosforylacji i defosforylacji. Za reakcje fosforylacji są odpowiedzialne kinazy, ich rodzaj mianowicie kinazy zależne od cyklin.

Cykl życiowy komórki:

• 1953 – Howard i Pelec opisali cykl komórkowy, nazwali fazy cyklu komórkowego(G₁,S,G₂,M,G₀)

• 2001 – Howard i współpracownicy dostali Nobla za odkrycia regulacji cyklu komórkowego

Kinazy zależne od cyklin - Cdk:

• Są kinazami serynowo/treoininowymi

• Obecne podczas całego cyklu komórkowego, lecz ich aktywacja następuje poprzez związanie się cyklin w odpowiedniej fazie cyklu komórkowego, dezaktywacja tych kinaz następuje poprzez defosforylację

• Aktywowane w odpowiedniej fazie, po niej następuje utrata aktywności

• Aktywność uzależniona…

Cykl komórkowy – cykliny:

Stężenie cyklin jest duże w czasie mitozy, po mitozie stężenie cyklin spada, i pownownie roślnie w interfazie.

Zatrzymanie cyklu:

• Aktywacja punktów kontrolnych – opóźnienia cyklu, całkowite zablokowanie cyklu, starzenie komórki, apoptoza

Cykliczna aktywacja cyklin:

• Kinazy zależne od cyklin(Cdk)

• Serynotreoninowe

• W zależności od fazy cyklu komórkowego aktywne różne kinazy zależne od cyklin i cykliny

• Kinazy obecne przez cały cykl komórkowy(aktywowane na różnych etapach)

• Stężenia podlegają cyklicznym wahaniom w czasie cyklu komórkowego

• Ilość drastycznie spada pod koniec mitozy

Aktywacja Cdk

• Początkowa aktywacja CDK - związanie z odpowiednimi cyklinami

• Pełna aktywacja – fosforylacja treoniny znajdującej się w konserwatywnej pętli T przez CAK (stabilizacja CDK)

Aktywność CDK podczas przebiegu cyklu komórkowego jest regulowana poprzez skoordynowaną aktywność kinaz (CAK) i fosfataz.

Kontrola przebiegu cyklu komórkowego:

• Przejście komórek przez daną fazę cyklu

• Koordynacja fosforylacji i defosforylacji kompleksu CDK-cyklina

• Aktywność CDK podczas przebiegu cyklu komórkowego jest regulowana przez skoordynowaną aktywność kinaz aktywujących CDK (CAK) i fosfataz

Dwie drogi inaktywacji kompleksu cyklina – Cdk:

• ubikwitynacja cyklin – proteosomalna degradacja cyklin (proces nieodwracalny)

• inaktwacja aktywności samej kinazy - fosforylacja Thr14, Thr16 w pętli wiążącej ATP (proces odwracalny – defosforylacja przy udziale CDC25 fosfatazy, co powoduje przywrócenie aktywności Cdk)

Główne cykliny ssaków: D, E, A, B.
W zależności od fazy cyklu komórkowego są powiązane z swoimi partnerami, tj. kinazami cyklino zależnymi.

Progresja komórek ssaków – kompleksy cyklin i kinaz zależnych od cyklin (ich występowanie zależne od fazy cyklu komórkowego):

• Wyjście z G0 i przejście w G1 – obecność cykliny D, wiąże się z Cdk4 i Cdk6 - D-CDK4, D-CDK6, pod koniec fazy dochodzi do rozpadu tych kompleksów.

• W G1 - włącza się kompleks cyklina E z Cdk2 – E-CDK2

• Przejście przez fazę S – kompleks cykliny A z Cdk2 – A-CDK2

• W fazie G2, Wejście w mitozę – kompleks cykliny D z Cdk2 i cykliny A z Cdk2.

Udział białka retinoblastoma (pRb) w progresji cyklu:

• Wejście komórek w fazę S – fosforylacja białka retinoblastoma przez kompleksy: cyklina D1 z Cdk4, cyklina D1 z Cdk6, cyklina E z Cdk2.

• Cyklina A-CDC2 (CDC2=CDK1), cyklina B-CDC2 fazy G2 i M

• Fosforylacja – uwalnianie czynników transkrypcyjnych, aktywacja genów kodujących białka umożliwiające przejście przez fazę S.

Jeżeli pRb jest nieufosforylowane jest połączone z czynnikiem transkrypcyjnym E2F1-3. Gdy komórka znajduje się przy końcu fazy G1, wszystkie 3 kompleksy cyklin i CDK mocno fosforylują białko retinoblastoma. Po fosforylacji tego białka dochodzi do odłączenia czynnika transkrypcyjnego, który przyłącza się do DNA i uruchamia transkrypcję białek niezbędnych do zakończenia fazy S.

Odpowiedź komórek ssaków na uszkodzenia:

Uszkodzenie DNA

Uszkodzone sensory

Systemy naprawy DNA Odpowiedź transkrypcyjna Apoptoza Uszkodzenie punktów kontrolnych

Mogą funkcjonować niezależnie, ale najczęściej białka zaangażowane w jeden typ odpowiedzi biorą również udział w innym typie reakcji komórek na uszkodzenia DNA.

Punkty kontrolne:

• Dawniej – specyficzne punkty restrykcyjne, w których komórka sprawdza integralność przed wejściem w kolejne fazy, zatrzymanie cyklu i sprawdzanie czy nie ma uszkodzeń

• Aktualnie – aktywacja punktów kontrolnych nie jest unikalnym i wyjątkowym procesem, jest to odpowiedź komórkowa na uszkodzenia DNA (szereg szlaków biochemicznych) prowadzących do opóźnienia, zatrzymania cyklu lub apoptozy.

Brak uszkodzeń – niezakłócony cykl – przejścia G1/S, G2/M, faza S(+M) są ściśle kontrolowane

Te same białka biorą udział w regulacji progresji cyklu komórkowego jak również w aktywacji punktów kontrolnych i zatrzymania cyklu

Najważniejsze punkty kontrolne:

• G1/S

• Faza S

• G2/M

Zaburzenia działania punktów kontrolnych – konsekwencje biologiczne

• Zatrzymanie G1 – aktywacja systemów naprawy (DSB, BER, NER)

• Po replikacji – brak zatrzymania powoduje zmiany/mutacje nieodwracalne, prowadzące do apoptozy, starzenia komórki, nieprawidłowego rozdziału chromosomów, a nawet ich aberracji

Przekazywanie sygnału, a uszkodzenia DNA

Uszkodzenie

Rozpoznanie

Sensory

Mediatory

Przekaźniki

Białka efektorowe

Naprawa DNA Zatrzymanie cyklu Apoptoza

Komórkowego

Aktywacja punktów kontrolnych – białka uczestniczące (umowne):

• Sensory: ATM, ATR, kompleks Rad17, kompleks Rad1/Rad9/Hus1 (9-1-1), kompleks MRN

• Mediatory: BRCA1, BP53, MDC1

• Przekaźniki: Chk1, Chk2

• Efektory: CDC25, p53

Sensory:

• Sensor prowadzący do aktywacji punktów kontrolnych

• RPA – punkty kontrolne i naprawa DNA

• RPC/PCNA – sensor charakterystyczny dla odpowiedzi komórki na zatrzymanie cyklu komórkowego

• ATM, ATR

• Zapoczątkowują dwie główne ścieżki uruchomienia punktów kontrolnych przy uszkodzeniach DNA

• Aktywność: ATM-DSBs, ATR- różne typy uszkodzeń DNA, zakłócenie procesu replikacji

• Kompleks Rad17-RFC i 9-1-1 specyficzny dla aktywnych punktów kontrolnych

• Rad17-RFC (75kDa)- ATPaza stymulowana przez DNA, wiażąca się z DNA i przyłączająca klamrowy kompleks białek 9-1-1 na DNA w miejscach uszkodzenia przy udziale ATP

• 9-1-1 – kompleks Rad9/Rad1/Hus1 – przyłączone do DNA w odpowiedzi na stres po działaniu czynnika genotoksycznego

• Fosforylacja Rad17 przez ATR przy uszkodzeniach DNA – konieczne do uruchomienia punktów kontrolnych w odpowiedzi na uszkodzenie

• Mediatory:

• Modyfikatory sygnału lub adaptery – grupy białek regulatorowych dla punktów kontrolnych charakteryzujące się złożoną (kompleksową) funkcją zarówno powyżej jaki i poniżej ATR i ATM

• Białka zawierające domenę BRCT odpowiedzialne za interakcje białko-białko, a także oddziałuje z sensorami, białkami efektorowymi, białkami związanymi z naprawą DNA itp.

• W komórkach ludzkich:

  • BRC11

  • 53BP1 (p53 binding protein 1)

  • TopBP1 (topoisomerase binding protein 1)

  • MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint 1)

• Mediatory oddziałują z sensorami uszkodzeń DNA (ATM), białkami naprawy DNA (MRN), przekaźnikami sygnałów (Chk2) i białkami efektorowymi (p53)

• Przekaźniki sygnału:

  • Kinazy Chk1 i Chk2

• Serynowotreoninowe kinazy ze zróżnicowaną specyficznością substratową(fosforyzują wiele białek)

• Dwie drogi:

• DSB->ATM->Chk2

• Uszkodzenia UV->ATR->Chk1

• Chk1 (-/-) – śmiertelność na poziomie embrionalnym u myszy

• Chk2 (-/-) - …

• Syndrom Li-Fraumeni-like – predyspozycja dla rozwoju nowotworów

• Efektory p53, CDC25A, CDC25B, CDC25C

• Białka CDC25 biorą udział w inaktywacji kinazy zależnej od cykliny związanej z cykliną (odwracalne)

• Domena podlegająca fosforylacji (interfaza lub mitoza). Zaangażowana tylko domena regulacyjna(domena katalityczna nie). Fosforylują konkretne miejsca – zatrzymanie cyklu- bezpośredni wynik to inaktywacja aktywności fosfatazowej, a w konsekwencji brak progresji cyklu komórkowego

• Defosforylacja kinaz zależnych od cyklin (CDK) (bezpośrednio powiązanych z progresją cyklu komórkowego)

- fosfatazy

- fosforylacja wielu miejsc przez różne kinazy

- fosforylacja zwiazana z punktem kontrolnym (Chk1, Chk2) - inaktywacja CDC25 (bezpośrednia inhibicja, usunięcia z jądrą komórkowego i/lub proteolityczna)

Punkt kontrolny G1/S

• Chroni komórkę przed wejściem w fazę S w obecności uszkodzeń DNA przez zahamowanie zapoczątkowania replikacji

• – aktywacja ATM/ATR dwie ścieżki sygnalizacyjne:

  1. Inicjacja zatrzymania G1/S

- fosforylacja Chk1/2 a następnie Cdc25A -> brak inicjacji replikacji

1. Utrzymywanie zatrzymania G1/S

- szybka odpowiedź (1), druga ścieżka włącza fosforylację P53

- ATM/ATR

Punkt kontrolny G₂/M

• Wejście w mitozę – defosforylację Cdc2 – uzależniona od fosforylacji Cdc25C

• Aktywacja ścieżki ATM/Chk2/Cdc25 lub ATR/Chk1/Cdc25 – zatrzymanie cyklu komórkowego w G2

• Fosforylacja Cdc25A – wiązanie do białka 14-3-3-cytoplazmatyczna degradacyjna poprzez ubikwitynację

• Schemat aktywacji i zatrzymania cyklu bardzo podobne dla punktów kontrolnych

Uszkodzenie

Zatrzymanie widełek replikacyjnych

Aktywacja ATM białka RPA, ATR

Chk2 fosforylacja Rad17(ładuje klamrowy kompleks)

Fosforylacja p53 fosforylacja miejsc serynowych w Chk1

Nagromadzenie p53 fosforylacja CDC25

Łączenie z cyklinami i kinazami- łączenie z cyklinami i kinazami-

Zatrzymanie cyklu komórkowego(S?) zatrzymanie cyklu komórkowego(G2/M)

• Onkogeneza – cykl komórkowy

• Wiele regulatorów cyklu komórkowego – onkogeny i supresory

• Choroby ze zwiększoną predyspozycją do nowotworów

• Kontrola G1/S najczęściej podlega deregulacji

• Nadmierna ekspresja cyklin lub inaktywacja inhibitorów Cdk

• P53 – 50% nowotworów(mutacja powoduje – brak apoptozy, brak zatrzymania cyklu komórkowego)