Laboratorium 8.

Wymagania odżywcze drobnoustrojów

Najważniejsze to:
- dostępne źródło węgla
- dostępne źródło azotu
- źródło podstawowych pierwiastków

Pojęcia:
skrobia – roślinna substancja zapasowa (polisacharyd), magazynowana w amyloplastach (wyspecjalizowane organelle) w postaci ziaren, zbudowana jedynie z cząsteczek glukozy ( z reszt α-D-glukozy), występująca w dwóch formach (glukanach): amylozy i amylopektyny; skrobia jest nierozpuszczalna w wodzie;
amyloza – jedna z form skrobii; nie ma rozgałęzień i jest zbudowana z reszt glukozy połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi; obie formy są szybko hydrolizowane przez α-amylazę, enzym wydzielany przez gruczoły ślinowe i trzustkę; stanowi 20-30% i daje z jodem reakcję barwną (niebieskie zabarwienie) wskutek odkładania się jodu w spiralnych skrętach łańcuchów glukozy; jest rozpuszczalna bez pęcznienia w gorącej wodzie;
amylopektyna – rozgałęziona forma skrobii, w której jedno wiązanie α-1,6-glikozydowe przypada na około 25-30 wiązań α-1,4-glikozydowych; podobna do glikogenu, choć ma mniej rozgałęzień; występuje w większych ilościach; pęcznieje w wodzie, a przy podgrzewaniu tworzy klej skrobiowy; w reakcji jodyną daje zabarwienie od purpurowego do brązowego;
enzymy – skrobię hydrolizują głównie enzym trzustkowy α-amylaza i, w mniejszym stopniu, α-amylaza śliny; amylaza rozszczepia wiązania α-1,4-glikozydowe skrobi, ale nie działa na wiązania α-1,6-glikozydowe; w rezultacie powstają di- i trisacharydy maltozy i maltotriozy oraz produkt zawierający wiązania α-1,6-glikozydowe, zwany dekstryną graniczną;
próba jodowa – skrobia w reakcji z płynem Lugola daje zabarwienie niebieskie; płyn Lugola to roztwór jodu w jodku potasu;
Skrobię można przeprowadzić do glukozy w drodze kwaśnej hydrolizy lub enzymatycznie. Występują trzy rodzaje enzymatycznej degradacji glukanów:
1) fosforoliza – przekształcenie np. skrobi do glukozo-1-fosforanu, katalizowane przez α-1,4-glukanofosforylazę;
2) hydroliza – wielocukry są rozszczepianie hydrolitycznie przez amylazy; α-amylaza szybko upłynnia skrobię, równocześnie atakując wiele wiązań α-1,4-glikozydowych, także w środku łańcucha; uwalnia maltozę, glukozę i oligomery zawierające od 3 do 7 reszt glukozy;
3) transglikozydacja – powstawanie ze skrobi pierścieni (krystaliczne) α-, β- lub γ-cyklodekstryn złożonych z 6, 7 lub 8 reszt glukozy, w wyniku działania transglikozylaz;

Prototrofy – potrafią zsyntetyzować wszystkie potrzebne składniki z jednego źródła organicznego i soli mineralnych;
Auksotrofy (żywieniowe) – nie potrafią sobie czegoś zsyntezować z tego, co mają dostępne; najczęściej mutanty aminokwasowe (nie potrafią zsyntezować któregoś aminokwasu, a przez to kilku idących po tej samej ścieżce metabolicznej – problem z którymś ze szlaków);

Ćwiczenia

Ćw. 1.
Do 4 jałowych probówek dodać po 5 ml odpowiednich roztworów:
1) 1% r-r glukozy (węgiel) - a
2) 1% r-r glukozy + K₂HPO₄ (węgiel + podstawowe pierwiastki) - b
3) 1% r-r glukozy + K₂HPO₄ + siarczan amonowy (węgiel + podstawowe pierwiastki + azot) - c
4) bulion odżywczy - d
Wsiać ezą do każdej probówki jedną, dowolnie wybraną bakterię (Micrococcus Luteus).
wyniki: a- nie rośnie (nie spełnia podstawowych wymagań – nie jest podłożem); b- nie rośnie (nie spełnia podstawowych wymagań – nie jest podłożem); c- nie rośnie (bo nie jest prototrofem); d- rośnie;

Ćw. 2. Amonifikacja przeprowadzana przez bakterie glebowe
Do 2 jałowych probówek dodać po 5 ml roztworów:
1) podłoże bulionowe (sole mineralne + białka) – A
2) podłoże z mocznikiem (mocznik) – B
Do każdej próbówki wrzucić po szczypcie ziemi ogrodowej.
bakterie są w stanie produkować amoniak (amonifikacja – od białek do amoniaku)
wyniki: A- amoniak powstał; B- amoniak powstał;

Wymagania odżywcze:

Ćw. 3. Proteolityczna aktywność drobnoustrojów
Przygotować w dwóch probówkach rozcieńczenia 10^-1 i 10^-2 roztworu glebowego. Posiać głaszczką na 2 płytki rozcieńczenie 10^-2:
1) agar – żel (żelatynowy) [jedyne źródło węgla i azotu to żelatyna (białko!) zestalona agar-agarem + sole mineralne – podłoże selekcyjne, rosną tu tylko te bakterie, które potrafią rozkładać żelatynę, te , które nie umieją, nie będą rosły = brak pożywienia];
2) agar – ml (mleczny – kazeina zestalona agar – agarem)
wyniki: agar-żel – rosną; agar-ml – rosną;

Ćw. 4. Właściwości amo….lityczne(?)
Korzystając z rozcieńczenia 10^-1 z poprzedniego ćwiczenia, zrobić posiew na płytkę ze skrobią.

TEORIA

Podstawowe składniki organiczne komórek:
- białka
- węglowodany
- tłuszcze
Odżywianie bakterii – pobieranie związków z otaczającego środowiska
Metabolizm:
- anabolizm – endoergiczne procesy
- katabolizm – dostarczające energię reakcje rozkładu
Za kryterium podziału wymaganych przez bakterie czynników odżywczych można przyjąć podstawową funkcję, jakiej dany związek służy. W tym ujęciu podział obejmuje dwie główne grupy związków:

1. składniki odżywcze, wykorzystywane głównie jako źródło energii
2. składniki odżywcze, służące przede wszystkim jako materiał do budowy protoplazmy, a w tym:
a) podstawowe źródło węgla
b) podstawowe źródło azotu
c) czynniki wzrostowe – związki organiczne niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania komórki
d) podstawowe jony nieorganiczne
Często jeden składnik spełnia obie funkcje, np. glukoza, będąca dla wielu gatunków najłatwiej przyswajalnym źródłem energii, może służyć równocześnie jako podstawowe źródło węgla.
Najłatwiej przyswajalne dla bakterii źródła węgla:
* cukry
* glicerol
* kwasy – mlekowy, winowy, cytrynowy
Węgiel w postaci CO₂ jest wykorzystywany jedynie przez pewną grupę drobnoustrojów – autotrofy.
Autotrofizm – przyswajanie węgla w postaci związku nieorganicznego – CO₂ – z wykorzystaniem energii świetlnej lub chemicznej.
Heterotrofizm – przyswajanie i przetworzenie organicznych połączeń węgla.
Nie ma jednak ostrej granicy; istnieją bakterie zaliczane do autotrofów (np. bakterie nitryfikacyjne), które dla optymalnego wzrostu wymagają organicznych połączeń węgla (czynników wzrostowych). W tym ujęciu autotrofy (organizmy samożywne) to drobnoustroje, które wykorzystują CO₂ jako podstawowe źródlo węgla. Heterotrofy, wykorzystując energię chemiczną wyzwalaną w procesach rozkładu, muszą rozporządzać przynajmniej jednym związkiem organicznym, z którego drogą przemian metabolicznych wytwarzają składniki komórkowe.
Bakterie autotroficzne:
- fotoautotrofy – zużywają energię światła słonecznego (bakterie zielone i purpurowe, siarkowe Thiorhodaceae i bezsiarkowe Athiorhodaceae);
- chemoautotrofy – energia z procesów utleniania prostych zw. nieorganicznych (bakterie wodorowe, siarkowe – Thiobacillus, Nitrosomonas, bakterie żelazowe);
Najbardziej dostępne źródło azotu: jony amonowe, amoniak. Bakterie czerpią też azot z połączeń organicznych, będących jednocześnie źródłem węgla.

1. Węglowodany – wykorzystywane w warunkach tlenowych i beztlenowych; przyswajane jako materiał budulcowy i źródło energii;
2. Białka – tylko przez bakterie proteolityczne; przy braku węglowodanów podstawowe źródło energii;
3. Tłuszcze – wykorzystywane przez niektóre bakterie – lipolityczne
Do prawidłowego wzrostu niektóre bakterie wymagają obecności w podłożu czynników wzrostowych. Nie posiadają zdolności ich syntezy i pobierają je z otoczenia. Mogą to być aminokwasy, nukleotydy, witaminy.
Ze względu na zapotrzebowanie na czynniki wzrostowe:
- auksotrofy – drobnoustroje niezdolne do syntezy podstawowych witamin, aminokwasów, muszą je pobierać z otoczenia
-prototrofy – zdolne do wzrostu na podłożach minimalnych, zawierających tylko jeden prosty związek organiczny, np. glukozę.