CYTOGENETYKA-zajmuje się badaniem mat.genetycznego (j.komórkowego,genomu)
Cytogenetyka klasyczna-zajmuje się badaniem genomu za pomocą metod prążkowego barwienia chromosomów)
METODY BARWIENIA --> PR[Author:A] ĄŻKÓW:
-umożliwiają precyzyjną identyfikację każdego chromosomu, identyfikację brakującego lub dodatkowego mat.chromosomowego( o wielkości co najmniej 4Mb),wybarwienie konkretnych fragmentów(poszczególne metody)
GTG (prazki G,trypsyna, barwnik Giemsy)-najczęściej stos. do oceny kariotypu ,tą metodą uzyskuje się 300-400 prążków ciemnych i jasnych charakt. dla każdej pary chrom. Prążki ciemne zawieraja skondensowaną chromatynę =heterochromatynę (dostęp trypsyny do niej jest utrudniony), bogatą w pary zasad A-T,zawierającą stos. mało aktywnych genów.Jest to obszar wolnoreplikujący (replikuje się późno w fazie S) Prążki jasne zawierają euchromatynę, 80% aktywnych genów,duzo par C-G, obszary te replikuja się wcześnie. Aby widoczne były mutacje musi być min. 400 prążków na kariotyp. W profazie i prometafazie rozdzielczość jest max.(wyst. Ok. 500-850 prążków na kariotyp-możliwe jest stwierdzenie mikromutacji).
GTW(pr.G,trypsyna,b.Wrighta)
CBG(prążki C, Ba(OH)2, b.Giemsy)-Ba(OH)2 wiąże się z heterochromatyną konstytucyjną (wyst. ona w centromerach wszystkich chromosomów, w ok. satelitarnych chr. akrocentrycznych-13,14,15,21,22, na końcu ramienia długiego chr.Y). 30% populacji wykazuje polimorfizm h. konstytucyjnej. Najczęściej dot. chr. 1,9,16 np.46XX9qh+
RHG(pr.R, hydroliza na ciepło, b. Giemsy )-prążki barwią się na odwrót niż w GTG,metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.
RBG(pr.R,bromodeoksyurydyna,b.Giemsy)
Metoda określania aktywności chr.X = RBA(pr.R,bromodeoksyurydyna,oranż akrydyny)
Jeśli chr.X zawiera wiele euchromatyny to znaczy że jest aktywny,jeśli wiele heterochromatyny tzn że jest nieaktywny.jeśli X jest aktywny to zabarwia się intensywnie na pomarańczowo
się na heparyne(0,5ml heparyny+1ml krwi lub 0,5 ml heparyny +4-5ml krwi),materiał musi być jałowy.
Zakładanie hodowli-badany materiał(6-12 kropli)+podłoże RPMI(bogate w amionokwasy+płodowa surowica cielęca+mitogen(stymuluje wzrost). W przypadku krwi im wieksza leukocytoza tym mniej materiału dodajemy; hodowle pozostawiamy w 37stC , w 5% CO2(krew 24-72 h,białaczki24-bez mitogenu,48-z mitogenem),1h15min przed zakończeniem hodowli należy dodać kolcemid(kolchicyne)=inhibitor tubuliny, bialka tworzacego wrzeciono kariokinetyczne(proces zostaje zatrzymany w metafazie).
Opracowanie hodowli-odwirować1500/min przez 10 min; potem szok hipotoniczny(0,075M KCl,37 st.C,30 min krew,40 min szpik)-aby komórki pękły i uwolniły mat.genetyczny;jeszcze raz wirowanie 1500 obr/min przez 10 min;nastepnie 3 x utrwalanie (metanol:lodowy kwas octowy) w 4stC;1-sze utrw.30 min 2-ie i 3-ie 15 min
Barwienie-po utrwaleniu ponownie wirujemy 1500/min przez 10min,”ściąganie” utrwalacza, mieszanie osadu; rozkładanie na szkiełka=dojrzewanie chromosomów(na płycie grzewczej 45stC przez 12 h);dodanie trypsyny-na zimno lub na ciepło(białaczki-4stC,krew-37stC);barwienie-b.Giemsy(3min).Po wysuszeniu preparaty ogląda się pod mikroskopem,analizuje się 15-20 metafaz, wykonuje się 15 zdjęć(3-5 wycina się i układa kariogramy).Jeśli jest aberracja to jeszcze analiza dodatkowych 35 metafaz, a jak mozaika to 100-200.
CYKL KOMÓRKOWY:składa się z fazy G1,S,G2,mitozy.(G1+G2+S=interfaza);p0ażdym podziale z jednej komórki powst. 2 potomne; każda ma 2x mniejszą masę i objętość niż komórka „matka”.G1(kilka do kilkunastu godzin)-intensywna synteza makrocząsteczek(RNA,białek i in.) co zwiększa masę komórki. w tej fazie komórka podejmuje decyzję o wejściu w podział-nast. aktywacja kinaz białkowych-CDK fazy S(aktywacja=polaczenie kinazy z cyklinami fazy S i jej fosforylacja)-inicjuje to syntezę DNA(faza S6-8h)-2x wzrasta ilość DNA.G2(kilka godzin)-wzrasta akt.CDK fazy M(MPF=czynnik fazy M)-wejście w mitozę.fosforylacja białek blaszki jądrowej histonu H1 przez CDK fazy M powoduje fragmentację otoczki jądrowej i kondensację chromatyny do chromosomów mitotycznych.Fosforylacja nukleolinyi białka B23 powoduje dezintegrację jąderka. Niektóre komórki mogą opuszczać cykl kom. I wchodzić w G0, nie dzielą się ale normalnie funkcjonują i pod wpływem pewnych czynników niektóre z nich mogą powrócić do cyklu i zacząć się dzielić.MITOZA-składa się z kariokinezy i cytokinezy.W kariokinezie zachodzi kopndensacja chromatyny i przemieszczenie chr. do biegunów komórek. Kariokinezę dzielimy na :profaza-kondensacja chromatyny,reorganizacja szkieletu i Era i wytworzenie wrzeciona podziałowego (białka-tityna,dyneina,ATP),na biegunach komórki i wzdłuż mikrotubul powstają zbiorniki ERazawierające dużo Ca++(on do cytosolu i pobudzenie przemieszczenie chromosomów wzdluż wrzeciona);2 pary centrioli wedruja do zewn. części komórki stając się jej biegunami;rozproszeniu ulega jąderko,następuje fragmentacja otoczki jadra,chromosomy przesuwają się ku płaszczyźnie równikowej;metafaza-chr.są w płaszczyźnie równikowej,organella przemieszczaja się w kierunku biegunów komórki;anafaza-rozdzielenie chromatyd w centromerach,rozpoczyna się przemiesczanie chromatyd do biegunów kom.;telofaza-dekondensacja chromosomów,rozp. się synteza rRNA z udziałem chromatyny chr.jąderkotwórczych , co zapoczatkowuje odtworzenie jąderka,odtwarza się otoczka jądra po defosforylacji białek bl. Jądrowej.cytokineza-rozdział cytoplazmy komórki następujące po kariokinezie,rozp. się w ana- lub telofazie wytw. Pierścienia kurczliwego(złożony z filamentów aktynowych i miozynowych)-znajduje się w okolicy równikowej i na obwodzie pod błoną kom.;pierścień się obkurcza(mech.ślizgowy-jak w mięśniu)-powst.bruzda podziałowa,która się pogłębia i rozdziela cytoplazmę.
KLASYFIKACJA CHROMOSOMÓW:autosomy:1-22,chr.płciowe-XY
Każdy chromosom ma przewężenie zwane centromerem(do niego przyczepia się wrzeciono podziałowe i pociąga 2 chromatydy do przeciwległych biegunów komórki).Położenie centromeru jest stałe dla danego chromosomu i stanowi podstawę [podziału chromosomów na: metacentryczne- gdy centromer jest na środku, akrocentryczne- centromer położonyblisko jednego końca chromosomu, submetacentryczne- pośrednie położenie chromosomu.Każdy chromosom ma długie(q) i krótkie(p) ramię. Końcem kazdego ramienia jest telomer.
GRUPA A:1,2,3; 1 i 3 prawie metacentryczne,2-submetacentryczny. GRUPA B:4,5-średnie, submetacentryczne, 4 nieco dłuższe. GRUPA C:6-12 i X; średnie, submetacentryczne. GRUPA D:13,14,15-duże, akrocentryczne, mają satelity, 13 największe,15 najmniejsze. GRUPA E:16,17,18; 16-małe, prawie metacentryczne, 17 i 18-submetacentryczne. GRUPA F:19,20-małe, prawie metacentryczne. GRUPA G:21,22 i Y;małe, akrocentryczne, na końcach ramion satelity,21 mniejszy od 22;Y też akrocentryczny podobny do 21,22, ale jest od nich dłuższy i nie ma satelitów.
Kariogram- sfotografowana płytka metafazalna. Kariotyp-posegregowanie chromosomów pary i do grup.
KARIOTYP KONSTYTUCYJNY-kariotyp z którym człowiek się rodzi.
KARIOTYP NABYTY-charakterystyczny dla komórek nowotworowych(duże tempo dzielenia się).