Przemysław Kraska gr. III

Fotometryczne oznaczanie zawartości białka.

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się, na przykładzie metody Lowry'ego i jego współpracowników, z fotometryczną analizą ilościową często wykorzystywaną w badaniach biochemicznych.

W metodach fotometrycznych wykorzystuje się zjawisko pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego przez różne substancje. Pomiar absorpcji światła przy określonej częstotliwości drgań (długości fali) może być miarą ilości substancji absorbującej i jest podstawą fotometrycznej analizy ilościowej.

Do oznaczania wykorzystuje się widmo określonych związków lub barwnych produktów powstałych w wyniku reakcji chemicznych, które można mierzyć metodami spektrofotometrycznymi i kolrymetrycznymi. Do pomiarów fotometrycznych służą fotometry lub spektrofotometry wyposażone w tzw. fotoogniwa lub fotokomórki, które służą do pomiarów natężenia światła przechodzącego przez roztwór pochłaniający (badany) oraz przez próbę odniesienia (najczęściej czysty rozpuszczalnik). Pomiar próby odniesienia służy zwykle do wyzerowania przyrządu, gdyż nastawia się go według tej próby na 100% transmisji lub 0 w wypadku pomiaru absorbancji.

Metoda Lowry'ego i współpracowników:

Wykonanie:

Do 2 probówek odmierzyć po 1 ml roztworu białka, a do próby kontrolnej 1 ml wody. Do wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika miedziowego, wymieszać i poczekać 10 minut. Następnie dodać po 0,5 ml odczynnika Folina i całość wymieszać. Po 30 minutach zmierzyć intensywność zabarwienia w fotometrze nastawiając przyrząd na zero wobec próby kontrolnej. Z wartości absorbancji odczytujemy na krzywej zawartość białka w 1 ml i w całej próbie oraz wyliczamy procentowa zawartość białka w badanym materiale.

Wyniki:

W roztworze białka na 400 ml roztworu przypada 120mg albuminy.

W badaniu fotometrycznym wyniki to:

1-sza probówka 0,193,

2-ga probówka 0,191.

Średnia badania to 0,192.

Ilość roztworu wyjściowego wynosi 8 ml. Zawartość białka obliczamy z tzw. metody krzyżowej:

400 ml roztworu - 120mg białka

8 ml roztworu - x mg białka

Wynik to 2,4 mg białka.

Z krzywej wzorcowej odczytujemy jakie jest stężenie substancji na podstawie wyniku absorbancji 192. Wynosi ono 95 μg. Postawiamy tą dana do wzoru:

μg x 25

1000

Wynik to 2,37 mg.

Teraz możemy obliczyć ilość czystego białka w badanej próbce. Korzystamy z tzw. metody krzyżowej:

2,4 mg - 100%

2,37 mg - x %

Wynik to 98,75%.

Zanieczyszczenie wynosi więc 1.25%.

Podsumowanie:

Na ćwiczeniach była wykorzystana metoda Lowry'ego i współpracowników. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz dwóch aminokwasów aromatycznych- tyrozyny i tryptofanu oraz jednego siarkowego- cysteiny. Reakcja biuretowa jest wzmacniana w tej metodzie inną reakcją z odczynnikiem Folina i Ciocalteu, w której kwas fosforomolibdenowy i fosforowolframowy ulega redukcji do błękitu fosforomolibdenowego z udziałem tyrozyny, tryptofanu i cysteiny. Podobnie jak w innych metodach kolorometrycznych stężenie białka odczytuje się z krzywej wzorcowej.

Zaletą tej metody jest znaczna jej czułość, można bowiem oznaczyć ilość białka już od 1 μg w próbie.

Wadą metody jest błąd oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w stosunku do białka oznaczanego. Inną wadą jest zawyżanie wyników oznaczenia w wyciągach nie dializowanych z powodu redukcji odczynnika Folina przez wolne aminokwasy i niewielkie peptydy.

1

---